TEMA MONOGRÁFICO
GENÉTICA BÁSICA (I)
Herramientas básicas de análisis genético
J. Clàriaa, M. Sánchezb y R. Queraltc
a
Unidad de ADN. Centro de Diagnóstico Biomédico. Hospital Clínic. Institut d´Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS).
b
Laboratorio de Genoma Humano. Facultad de Medicina. Universidad de Barcelona.
c
Servicio de Genética. Centro de Diagnóstico Biomédico. Hospital Clínic. Barcelona.
E l rápido desarrollo de la biología molecular en las dos últimas
décadas ha representado una revolución en la metodología
empleada en los laboratorios de análisis clínicos y de diagnóstico
biomédico. La consecuencia inmediata de este progreso ha sido no
sólo la reducción del número y volumen de muestras a analizar y la
automatización de la mayoría de las técnicas, sino también el desa-
rrollo de programas de prevención que han contribuido de forma
significativa a mejorar la salud pública. El objetivo de este capítulo
es describir de forma resumida las herramientas básicas más utili-
zadas en el diagnóstico molecular y definir el estado actual de su
aplicación al análisis genético.
AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Para realizar cualquier análisis genético debemos previamente ais-
lar el material genético del paciente, el cual está formado por ca-
denas de ácidos nucleicos. Existen dos tipos de ácidos nucleicos: el
ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN).
El ADN se encuentra principalmente en el núcleo de las células,
mientras que el ARN se encuentra en el citoplasma de las células.
Así pues, debemos partir de un material celular, ya sea sangre total
o muestra de tejido para aislar tanto ADN como ARN. Si partimos
de tejidos sólidos, tanto para el aislamiento de ADN como de
ARN, se debe fraccionar antes de la extracción del ácido nucleico.
Aunque en este capítulo nos centraremos en metodologías ba-
sadas en el análisis de ADN, a continuación se describen las prin-
cipales características del aislamiento de ADN y ARN.
La extracción de ADN de las células se realiza mediante una in-
cubación con el detergente dodecil sulfato de sodio (SDS) que so-
lubiliza los lípidos de membrana y la proteinasa K que degrada en-
zimáticamente las proteínas. Posteriormente, se separa el ADN de
las proteínas mediante precipitación salina o mediante extracción
con fenol-cloroformo. Una vez aislada la fase nucleica se precipita
con etanol absoluto y se eliminan las impurezas de sales con lava-
dos de etanol al 70%. Finalmente, el ADN se resuspende en una
solución acuosa1.
La extracción de ARN es más compleja que la del ADN debido
a la alta estabilidad y actividad de las ribonucleasas, enzimas que
degradan el ARN. Por tanto, es muy importante trabajar con ma-
teriales y productos libres de ribonucleasas. El primer paso para el
aislamiento del ARN consiste en la lisis de las células en un medio
químico que destruya las ribonucleasas, como el tiocianato de gua-
nidinio. Posteriormente, el ARN es separado de las demás macro-
moléculas en un gradiente de cloruro de cesio, precipitado con iso-
propanol, lavado con etanol al 75% y resuspendido en una solución
acuosa2.
AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue desarrollada a
mediados de los años ochenta por Mullis3,4. A este bioquímico el
invento le valió el premio Nobel de Química en 1993, mientras
que a la empresa que en esos momentos estaba trabajando (la
compañía Cetus) le valió unos 300 millones de dólares al vender la
patente a la compañía farmacéutica Hoffmann-La Roche. En tan
sólo 20 años la PCR se ha convertido en una de las técnicas de la-
boratorio más utilizadas y una de las más citadas en la literatura
científica.
La PCR es una técnica relativamente sencilla por la cual una ca-
dena de ADN es amplificada millones de veces de un modo rápido
y preciso. La PCR es también una técnica altamente sensible que
permite la amplificación de ADN a partir de cantidades mínimas
de material (es posible amplificar una sola molécula de ADN). Es-
tas características junto con su fácil aplicación y versatilidad, hacen
que la PCR sea una técnica sumamente útil no sólo en investiga-
ción básica, sino también en aplicaciones de interés clínico, como
el diagnóstico genético y la medicina forense.
A grandes rasgos, la PCR es un método in vitro de síntesis de
ADN por el cual cualquier fragmento de ADN puede ser replica-
do selectivamente. En la figura 1 se recoge un esquema resumido
del proceso de la PCR. En general, la reacción de PCR consiste en
la amplificación de un fragmento de ADN delimitado por dos oli-
gonucleótidos cebadores (primers, fragmentos de ADN monocate-
nario de 15 a 25 bases) en repetidos ciclos de desnaturalización, hi-
bridación (annealing) de los cebadores a la secuencia de ADN
complementaria y extensión de la nueva cadena mediante la activi-
dad de la enzima ADN polimerasa5. Dado que cada miembro de
la pareja de cebadores se hibrida específicamente a cada una de las
dos cadenas complementarias de ADN, la síntesis de nuevas cade-
nas de ADN se restringe al fragmento de ADN delimitado por los
dos cebadores. A continuación se describe con más detalle cada
una de las etapas clave de la PCR.
Desnaturalización
Cuando se suministra calor a una cadena de ADN bicatenario, los
puentes de hidrógeno que estabilizan la doble hélice se rompen y
se separan las dos cadenas de ADN. Por esta razón, en la primera
etapa de la PCR se aplica calor (94 °C, 1 min) a la muestra para se-
parar las dos cadenas complementarias de ADN (fig. 1).
Hibridación
Si la solución que contiene el ADN se deja enfriar (a temperatu-
ras que suelen ir desde 40 a 60 °C durante 30-60 s) se logra la
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otros cofactores en un tampón apro-

5’ 3’ piado y a 72 °C (temperatura óptima
Cadena original Cebador de polimerización de la Taq) durante
Cebador
3’ 5’ 1 min aproximadamente, las dos he-
bras de ADN son copiadas a partir de
los cebadores específicos (fig. 1). Así,
5’ 3’
se obtienen dos productos mixtos con
Desnaturalizar regiones de cadena doble y sencilla,
1 Hibridar 3’ 5’ que poseen en común un segmento
cebadores
de doble cadena, la región diana a
Extender nueva cadena amplificar.
Si en un segundo ciclo se repite
Desnaturalizar
Hibridar cebadores todo el proceso de desnaturaliza-
2 ción-hibridación-extensión, se obten-
Extender nueva cadena
drán cuatro moléculas de ADN de la
región diana amplificada. A partir de
Desnaturalizar aquí en cada ciclo se duplica el nú-
Hibridar cebadores
3
mero de copias de la región diana. El
resultado final es una acumulación
Extender nueva cadena
exponencial del fragmento de ADN
amplificado. Es decir, se obtienen
Desnaturalizar aproximadamente 2n copias, siendo n
Hibridar cebadores
el número de ciclos de amplificación
realizados. El termociclador es el
4 aparato que de forma automática re-
aliza esta secuencia de acontecimien-
Extender nuevas cadenas
tos durante el número de ciclos de-
Desnaturalizar seado.
Hibridar cebadores Aunque la PCR, tal como apunta-
mos anteriormente, es una técnica rá-
pida, sencilla y de fácil aplicación,
5
también posee algunos inconvenien-
tes. Entre los más importantes cabe
citar la fidelidad de la Taq polimerasa
que no siempre es del todo precisa
Extender nuevas cadenas
(se ha estimado que incorpora de 1 a
2 errores por cada 10.000 bases) y la
fácil contaminación de los reactivos
Ciclo (p. ej. mediante la formación de aero-
soles en las puntas de las pipetas dis-
pensadoras).
Figura 1 Diagrama esquematizado del proceso de la PCR. El material de partida es un ADN de doble cadena.
En primer lugar (ciclo 1), las cadenas se desnaturalizan y se hibridan los cebadores específicos,
los cuales flanquean la región de ADN a amplificar (representada entre líneas discontinuas). CLONACIÓN MOLECULAR
A continuación la Taq polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN a partir del cebador específi-
co. En el segundo ciclo (ciclo 2) se desnaturalizan las cadenas, se hibridan los cebadores específi-
cos y se sintetizan nuevas hebras de ADN. A partir del ciclo 3 y en continuos ciclos de desnaturali-
La clonación molecular consta básica-
zación-hibridación-extensión se amplifica exponencialmente el fragmento de ADN de interés. En mente de dos procesos: la creación de
este esquema y a partir de los ciclos 1 y 2, no se representan las cadenas originales, las cuales se una construcción o construct y la in-
amplifican de forma no exponencial y, por tanto, no contribuyen de forma significativa en el pro- troducción de dicha construcción
ducto final. dentro de una célula eucariota o pro-
cariota. Una construcción se compo-
hibridación de la pareja de cebadores específicos a las cadenas ne de un vehículo, denominado vector, donde insertaremos un
de ADN gracias a la complementariedad de sus bases a las re- fragmento de ADN obtenido normalmente mediante PCR. Segui-
giones flanqueantes del ADN a amplificar (fig. 1). Cada uno de damente, se introduce esta construcción en una célula para gene-
los cebadores se hibrida a una hebra distinta, de forma que am- rar múltiples copias idénticas.
bos presentan su extremo 3’ hacia el interior de la región a am- Un vector es una construcción artificial de ADN que contie-
plificar. ne los elementos necesarios para replicarse en el interior de la
célula, como un ente independiente del genoma celular, cuan-
Extensión do ésta se divida. Un vector consta de un origen de replicación
Es la elongación de las cadenas de ADN mediante la actividad de que permite la multiplicación dentro de la célula, un sitio de
la ADN polimerasa. En presencia de una ADN polimerasa termo- clonación, o multicloning site, que es la zona donde se inserta el
estable (Taq polimerasa de Thermus aquaticus), de deoxinucleóti- fragmento de interés y de un gen de resistencia a un antibiótico
dos trifosfato (dNTP) en concentraciones saturantes, magnesio y (ampicilina, kanamicina, tetraciclina, etc.) que nos permitirá se-
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ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Y

No digerido
ELECTROFORESIS

Estándar
Digerido
En 1970 Smith et al descubrieron que algu-
Origen nas enzimas de ciertos microorganismos cor-
taban el ADN en determinados puntos de su
secuencia6. Estas enzimas son las endonucle-
TTGA
ADN

AACT asas de restricción o enzimas de restricción y

se denominan según las iniciales del microor-
420 pb ganismo del que proviene, seguido de la va-
506 pb
396 pb riedad de la especie y de un número romano
298 pb
si existe más de una enzima aislada de un
280 pb
mismo tipo de bacteria (p. ej., Hind III pro-
TCGA viene de Haemophilus influenzae variedad
ADN

AGCT Rd y es la tercera enzima que se aisló). El lu-

140 pb 154 pb gar que reconoce y corta una determinada
134 pb
enzima de restricción se denomina diana de
Enzima de restricción restricción. Algunas de estas dianas presentan
Gel de agarosa la característica de ser palindrómicas, es de-
Electroforesis cir, que leyendo la secuencia nucleotídica en
sentido 5’-3’ obtenemos lo mismo que en
Figura 2 Enzimas de restricción y electroforesis en gel de agarosa. La figura representa un frag- sentido 3’-5’ (fig. 2, TCGA).
mento de PCR de 420 pb que contiene la diana de restricción TCGA, que es cortado en 2 El proceso de cortar el ADN con una enzi-
fragmentos de 140 y 280 pb por una enzima de restricción (simbolizado por unas tijeras). ma de restricción se denomina digestión. Pa-
Si no existe la diana de restricción, la enzima no podrá actuar y obtendremos un único
ra realizar una digestión de un fragmento de
fragmento de 420 pb. Los fragmentos de ADN se visualizan en un gel de agarosa teñido con
bromuro de etidio. El tamaño de los fragmentos se estima mediante la extrapolación de la
ADN normalmente basta añadir la enzima de
distancia recorrida en el gel por fragmentos de ADN de tamaño conocido (estándar). restricción y un tampón adecuado e incubar
la mezcla a la temperatura requerida por la
enzima. Finalmente, se analiza la muestra
leccionar positivamente aquellas células que han incorporado el cargándola en una matriz o gel de agarosa o poliacrilamida y some-
vector. tiéndola a un campo eléctrico (electroforesis) (fig. 2). De forma
Para realizar una construcción circular debemos tener el vector breve, la electroforesis consiste en aplicar sobre el gel de agarosa o
linearizado, es decir, cortado o digerido con una enzima de restric- poliacrilamida un campo eléctrico donde el polo positivo se sitúa
ción que presente una diana única en el sitio de clonación del vec- en el extremo contrario al sitio de carga de la muestra; de este mo-
tor. Posteriormente, se inserta el fragmento de interés entre los dos do, la muestra, que es ADN y posee carga negativa, se desplaza
extremos del vector, proceso que se denomina ligamiento. De esta por el interior del gel en dirección al polo positivo (fig. 2). Es nece-
forma, una vez incorporado el fragmento de interés al vector, volve- sario añadir a las muestras un colorante que nos permita visualizar
mos a tener una construcción circular. De forma muy resumida, la su localización aproximada. Las moléculas de ADN se visualizan
reacción de ligamiento incluye el vector linearizado, el fragmento a por tinción con bromuro de etidio, compuesto que se intercala en-
clonar, la ligasa o enzima que los unirá y el tampón de la ligasa que tre las bases del ADN y emite fluorescencia cuando es estimulado
aporta los iones necesarios para que la enzima funcione. con radiación ultravioleta. Para tener una referencia del tamaño de
Una vez insertado el fragmento de interés en el vector, se intro- los productos de digestión, en uno de los carriles del gel se carga
duce toda la construcción en el interior de una célula eucariota o un estándar o marcador, que consiste en un conjunto de fragmen-
procariota, proceso que se denomina transformación. Normalmen- tos de ADN de longitud (en pares de bases, [pb]) conocida (fig. 2).
te, se utilizan células procariotas, como la bacteria Escherichia coli,
debido a que crecen con más rapidez y con menos requerimientos
nutricionales que las células eucariotas. Existen diferentes méto- SECUENCIACIÓN DE ADN
dos de transformación, siendo los más utilizados la electropora-
ción, el choque térmico y la transfección mediada por virus o por Las técnicas de secuenciación de ADN se desarrollaron a finales
liposomas. En la electroporación sometemos a las células a una de los años setenta y revolucionaron de forma significativa el mun-
descarga eléctrica, mientras que en el choque térmico las somete- do de la genética molecular. Originalmente, se describieron dos
mos a un cambio de temperatura. Ambos procedimientos generan métodos de secuenciación de ADN: el método de Maxam y Gil-
poros en las membranas de las células permitiendo que la cons- bert7 y el método de Sanger et al8. Mientras que el método de Ma-
trucción se introduzca en el interior de ellas. En la transfección xam y Gilbert está basado en la degradación química de la cadena
utilizamos virus para infectar o liposomas para fusionar las células original de ADN, el método de Sanger et al se basa en la síntesis
e introducir nuestra construcción. de una nueva cadena de ADN mediante la actividad enzimática de
Una vez transformada, la propia maquinaria celular se encarga- una ADN polimerasa. Aunque ambos métodos producen pobla-
rá de realizar múltiples copias de la construcción. Para recuperar ciones de fragmentos marcados (originalmente con radioactividad)
estas copias será necesario lisar las células y purificar nuestra cons- de distinta longitud, los cuales son separados por electroforesis en
trucción. Las miles de copias de nuestro fragmento de interés se un gel de poliacrilamida, en la práctica el método enzimático de
utilizarán para otras aplicaciones como, por ejemplo, sondas para Sanger et al es el más popular y el más utilizado para secuenciar
Southern o Northern blot, para realizar estudios de transcripción ADN de forma rutinaria. En los últimos años, el método original
y/o traducción in vitro, etc. de Sanger et al se ha modificado y mejorado sustancialmente, sien-
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Cebador
ADN a secuenciar
ADN polimerasa
dNTP
Terminadores (ddNTP)
PCR
Gel de poliacrilamida
Electroferograma
Figura 3 Secuenciación de ADN. La reacción de secuenciación consta de la
muestra de ADN a secuenciar, un cebador (sense o antisense),
una ADN polimerasa, deoxinucleótidos (dNTP) y terminadores di-
deoxinucleótidos (ddNTP), acoplado cada uno de ellos a un fluo-
rocromo característico. Durante el proceso de la PCR, estos
terminadores se incorporan a la nueva cadena de ADN, generan-
do fragmentos de tamaño variable. Estos fragmentos se sepa-
ran en un gel de poliacrilamida y la señal emitida por cada uno
de ellos da lugar a un pico característico del electroferograma.
do los cambios más importantes la sustitución de la radioactividad
por marcadores fluorescentes y la aplicación de la PCR. A conti-
nuación se describen a grandes rasgos las principales característi-
cas del método de Sanger et al.
Método de Sanger et al
El método enzimático de Sanger et al está basado en la incorpora-
ción de terminadores dideoxinucleótidos (ddNTP) a una nueva ca-
dena de ADN mediante la actividad de una ADN polimerasa.
Aunque los ddNTP se incorporan a la nueva cadena de la misma
forma que se incorporan los deoxinucleótidos convencionales
(dNTP), difieren de éstos porque carecen del grupo 3’-OH nece-
sario para la elongación de la cadena. Por esta razón, cuando se in-
corpora un ddNTP a la nueva cadena creciente de ADN, la ausen-
cia del grupo hidroxilo evita la formación del puente fosfodiéster
con el siguiente dNTP y la elongación de la cadena se termina en
ese punto. En la práctica, cada uno de los cuatro ddNTP se combi-
na con una mezcla de los cuatro dNTP convencionales en presen-
cia de la ADN polimerasa y de un cebador (primer) específico. En
el método original, cada uno de los cuatro ddNTP se empleaban
en cuatro reacciones distintas en presencia de un dNTP marcado
radiactivamente, de forma que se obtenían poblaciones de ADN
de distinta longitud de nucleótidos. Los fragmentos radiactivos ob-
tenidos se separaban en un gel de poliacrilamida y la secuencia de
ADN completa se determinaba mediante autorradiografía.
Como ya se ha comentado anteriormente, el método enzimático
de Sanger et al es el método de secuenciación más utilizado en la
actualidad, pero con importantes modificaciones. En este sentido,
la incorporación de la PCR ha dado lugar a lo que se denomina se-
cuenciación cíclica. En la secuenciación cíclica y al igual que en el
método original de Sanger et al, se copia la cadena original de
ADN a partir del cebador hasta el lugar de incorporación del
ddNTP por la ADN polimerasa. La diferencia radica en que en la
secuenciación cíclica, esta reacción tiene lugar de 20-30 veces en
un termociclador, lo cual resulta en la generación de múltiples co-
pias de los fragmentos, lo que amplifica enormemente la señal y
facilita su detección. Otras modificaciones importantes del método
original de secuenciación son la sustitución de la radiactividad por
fluorocromos y la automatización de su detección y análisis me-
diante secuenciadores automáticos de ADN. Así, en el método
actual la fluorescencia suele estar asociada a los terminadores
ddNTP (cada terminador esta asociado a un fluorocromo distin-
to), los cuales se incorporan a la nueva cadena de ADN mediante
la amplificación cíclica usando la actividad de la Taq polimerasa
(fig. 3). Los nuevos fragmentos de ADN se separan en un gel de
poliacrilamida y la señal emitida por cada uno de los fluorocromos
al ser excitados por un láser es captada por unos detectores y anali-
zada mediante soporte informático (fig. 3). Las principales ventajas
de la secuenciación automática son la gran flexibilidad en la utiliza-
ción de cualquier cebador (normalmente es uno de los dos usados
para amplificar el ADN por PCR) y que los errores de lectura cau-
sados por falsas paradas de la ADN polimerasa no se detectan, ya
que no incorporan fluorescencia. Además, y puesto que cada ter-
minador lleva asociado un distinto fluorocromo, el número de tu-
bos a manejar se divide por cuatro mientras que el número de
muestras a secuenciar en un mismo gel se multiplica por cuatro.
SSCP Y RFLP
El análisis de SSCP (single strand conformation polymorphism) es
una de las técnicas mas empleadas para la detección de mutacio-
nes del ADN. Es la técnica de elección cuando se conoce el gen
responsable de una enfermedad pero se desconoce la situación de
la mutación y hay que analizar un gran número de muestras. La
técnica se basa que en condiciones no desnaturalizantes, el ADN
de cadena sencilla adopta una conformación dependiente de su se-
cuencia. La región de ADN a analizar se amplifica por PCR, la do-
ble cadena generada se desnaturaliza por calor y, seguidamente, se
analizan las cadenas sencillas por electroforesis en un gel de polia-
crilamida no desnaturalizante. Si el fragmento de ADN amplificado
es portador de una mutación, la movilidad de las cadenas sencillas
diferirá respecto a la de un control normal, generando un patrón
anómalo de migración. Las condiciones de electroforesis permiten
discriminar entre dos moléculas que difieran en un solo
nucleótido9. Los productos de PCR deben oscilar entre 200 y 400 pb.
La confirmación del cambio de nucleótido y su situación se deter-
minará posteriormente mediante secuenciación.
El análisis de RFLP (restriction fragment length polymorphism) es
la metodología empleada para el análisis de polimorfismos de longitud
del ADN de los fragmentos de restricción. El ADN genómico a anali-
zar se corta con las enzimas de restricción de interés y a continuación
el ADN cortado se separa mediante electroforesis en un gel de agaro-
sa. El gel se incuba en una solución desnaturalizante para obtener las
dobles hebras desnaturalizadas y los fragmentos separados se transfie-
ren a una membrana mediante la técnica conocida como Southern
Blot10. La membrana se hibrida con una sonda específica (fragmento
de ADN marcado) dando lugar a distintos fragmentos a analizar. Esta
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A CACACGTGCAC
Cebador
CTGCACTTTGACAGGGATA CACACACACACACACACA TACGTAGCCGTATACCGG
GACGTGAAACTGTCCCTAT GTGTGTGTGTGTGTGTGT ATGCATCGGCATATGGCC
Core Cebador
B C
M H1 H2 P M H1 H2
D E
M H1 H2 P S T
M: madre P: padre H1, H2: hijos S: sangre T: tumor
Figura 4 Microsatélites. A) Secuencia de un microsatélite. La repetición
(CA)n se halla dentro del rectángulo. B) Patrón electroforético
de una herencia normal biparental. H1: heterozigoto; H2: homozi-
goto. B) Patrón electroforético de un desequilibrio cromosómico.
H1: trisomía (dos alelos maternos y un alelo paterno); H2: mono-
somía (un alelo paterno y pérdida del alelo materno). D) H1: he-
rencia uniparental materna; H2: herencia uniparental paterna;
E: pérdida de heterozigosidad (pérdida de un alelo).
técnica se ha utilizado para el análisis del ADN polimórfico (ADN re-
petido). Con la introducción de la PCR el análisis de RFLP por
Southern Blot se ha sustituido por el análisis de microsatélites.
ANÁLISIS DE MICROSATÉLITES
El análisis de microsatélites, o STR (short tandem repeats), consis-
te en la amplificación por PCR de una región de ADN genómico
no codificante que contiene una secuencia polimórfica (core) repe-
tida n veces11 (fig. 4A). En función del número de nucleótidos re-
petidos distinguimos los microsatélites del tipo dinucleótido (CA)n,
trinucleótido (TGA)n, tetranucleótido (TAGA)n y pentanucleótido
(TAGAG)n. Para un microsatélite determinado, el número de re-
peticiones (n) es variable entre individuos y, por tanto, el tamaño
del fragmento amplificado será distinto. Con la posterior separa-
ción electroforética en un gel de poliacrilamida desnaturalizante se
obtendrá un patrón de bandas alélico, polimórfico y propio de ca-
da individuo. Para la elección de un microsatélite se debe tener en
cuenta una serie de condiciones: una alta heterozigosidad (porcen-
taje de individuos con dos alelos de distinto tamaño), un elevado
número de alelos, una secuencia polimórfica regular, unos alelos
fácilmente distinguibles y una buena amplificación por PCR.
Para un determinado microsatélite y un determinado locus se
produce la amplificación de dos alelos, uno de cada progenitor.
Estos alelos pueden ser de distinto tamaño (heterozigoto) (fig. 4B
[H1]), o bien del mismo tamaño (homozigoto), en este caso se vi-
sualiza una sola banda de doble intensidad (fig. 4B [H2]). Las utili-
dades del análisis de microsatélites son bien conocidas para la
identificación de individuos en genética forense. En genética clíni-
ca se utiliza para el diagnóstico de duplicaciones cromosómicas,
como el síndrome de Down, que estudia el origen parental y meió-
tico de la no disyunción del cromosoma 21 (fig. 4C [H1])12. Tam-
bién se utiliza en el análisis de microdeleciones cromosómicas, co-
PCR (cebadores fluorescentes )
CACACGTGCAC
P
CACACGTGCAC
GTGTGGACGTG
GTGTGTACGTG
GTGTGCACGTG
GTGTGAACGTG
C T G A
Figura 5 Chips de ADN. En este esquema se representa un chip de ADN
utilizado para estudiar la existencia de mutaciones puntuales
en un gen. Un chip de ADN es una matriz sólida donde se hallan
inmovilizados miles de fragmentos de ADN diferentes (normal-
mente oligonucleótidos). La región del gen a analizar se amplifica
por PCR en presencia de cebadores acoplados a un fluorocromo,
y el fragmento obtenido se hibrida a la matriz conteniendo la
secuencia de ADN complementaria inmovilizada. Según en qué
posición de la matriz se detecte la fluorescencia podremos dis-
cernir qué nucleótido ocupa esa posición en nuestra muestra de
ADN.
mo el síndrome de Williams (microdeleción de la región
7q11.23)13 y el síndrome velo-cardio-facial (microdeleción de la re-
gión 22q11.2)14, donde se estudian los locus delecionados y el ori-
gen parental de la deleción (fig. 4C [H2]). El análisis de disomía
uniparental estudia la herencia de un determinado par de cromo-
somas de un solo progenitor, sin contribución del otro progenitor,
dando lugar a distintos síndromes como el de Angelman y el de
Prader Willi debido a una duplicación paterna y materna, respecti-
vamente, del cromosoma 15 (fig. 4D [H2, H1])15,16. El análisis de li-
gamiento de una familia estudia la cosegregación de determinados
alelos con el fenotipo de una enfermedad y, por último, el análisis
de pérdida de heterozigosidad (LOH: Loss of heterozygosity), es-
tudia en un mismo individuo y para un locus determinado la pérdi-
da de un alelo en un tejido tumoral respecto a la presencia bialéli-
ca en otro tejido no tumoral (fig. 4E).
CHIPS DE ADN Y OTRAS TECNOLOGÍAS
DE FUTURO
Una de las constantes de los métodos de biología molecular es
la tendencia a disminuir el volumen de reacción y de miniatu-
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rizar todos los procesos, de forma que sea posible analizar el
máximo número de muestras en el mínimo espacio y volumen.
Éste es el concepto básico de la tecnología de microarrays y
chips de ADN: analizar miles de genes y variantes genéticas de
forma rápida y en un volumen de reacción del orden de nano-
litros.
Un array es una matriz donde se ordenan un gran número
de muestras. Un microarray es una matriz que contiene miles de
muestras ordenadas cada una de ellas en puntos de 200 µm de diá-
metro. A grandes rasgos, existen dos tipos de microarrays. En pri-
mer lugar, los microarrays propiamente dichos donde diversos
fragmentos de ADN (normalmente cADN) se hallan inmoviliza-
dos en una superficie sólida, como por ejemplo en un portaobje-
tos de vidrio o una membrana de nailon. Por otra parte, existen los
denominados DNA chip microarrays, donde el ADN en forma de
oligonucleótidos se halla inmovilizado en una placa de silicona
de forma similar a los chips de informática o microprocesadores.
En ambos casos el procedimiento analítico es el mismo: el ADN
aislado de la muestra a analizar se marca con fluorescencia y se hi-
brida (a temperatura y condiciones ya establecidas) a la matriz
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conteniendo el ADN complementario inmovilizado (fig. 5). Las
dos principales aplicaciones de los microarrays y chips de ADN
son la detección de las mutaciones/polimorfismos más habituales
de una enfermedad y el análisis de las diferencias en el grado de
expresión de un determinado gen. En el primer supuesto, el mate-
rial de partida será ADN genómico, mientras que en el segun-
do caso el material a analizar es el cARN obtenido a partir del
cADN sintetizado por retrotranscripción del ARNm original de la
muestra.
La aplicación de la tecnología de microarrays y chips de ADN al
análisis del genoma humano se denomina de forma genérica como
genómica. De forma similar, la aplicación de esta tecnología al es-
tudio de la expresión proteica recibe el nombre genérico de pro-
teómica. 
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