PREINFORME CROMATOGRAFÍA DE CAPA DELGADA

Consultas Preliminares:
 Consulte los principios en los cuales se fundamenta la cromatografía. ¿Cuáles son los tipos de cromatografía
más importantes? Describa cada uno.
La cromatografía es una técnica más para el análisis y la separación de mezclas químicas. La técnica se basa en
una interacción de polaridad entre la muestra y otras dos sustancias llamadas fase estacionaria y fase móvil, que
puede ser líquida o gaseosa. Como indican sus nombres, la fase estacionaria no se mueve, mientras que la fase
móvil fluye a través de la fase sólida. Los factores efectivos en este proceso de separación incluyen características
moleculares relacionadas con la adsorción (líquido-sólido), la partición (líquido-sólido) y la afinidad o diferencias
entre sus pesos moleculares. Debido a estas diferencias, algunos componentes de la mezcla permanecen más
tiempo en la fase estacionaria y se mueven lentamente en el sistema cromatográfico, mientras que otros pasan
rápidamente a la fase móvil y abandonan el sistema más rápidamente.
Existen variedad de técnicas cromatográficas entre estas:
-Cromatografía en columna: esta técnica se utiliza para la purificación de biomoléculas. Sobre una columna
(fase estacionaria) primero se aplica la muestra a separar, luego se aplica el tampón de lavado (fase móvil). Su
flujo a través del material interior de la columna colocado sobre un soporte de fibra de vidrio está asegurado. Las
muestras se acumulan en la parte inferior del dispositivo de una manera dependiente del tiempo y del volumen.
-Cromatografía de intercambio de iones: La cromatografía de intercambio iónico se basa en interacciones
electrostáticas entre grupos cargados y material de soporte sólido (matriz). La matriz tiene una carga iónica
opuesta a la de la del compuesto a separar, y la afinidad del compuesto a la columna se logra con enlaces iónicos.
-Cromatografía de permeación en gel: el principio básico de este método es utilizar materiales que contienen
dextrano para separar macromoléculas en función de sus diferencias de tamaño molecular. Este procedimiento se
utiliza básicamente para determinar los pesos moleculares de las proteínas y disminuir las concentraciones de sal
de las soluciones de proteínas.
-Cromatografía de afinidad: la cromatografía por afinidad es un tipo de cromatografía de líquidos que se basa
en la unión reversible entre el analito de interés y un ligando específico, inmovilizado en un soporte sólido inerte.
Cuando la muestra pasa por la columna, sólo son retenidas las moléculas que se unen de manera selectiva al
ligando por afinidad y las que no se unen avanzan con la fase móvil. Después, los analitos retenidos pueden ser
arrastrados cambiando las condiciones de la fase móvil.
-Cromatografía en papel: en el papel, el material de soporte de la cromatografía consiste en una capa de celulosa
altamente saturada con agua. En este método, un papel de filtro grueso comprende el soporte y las gotas de agua
asentadas en sus poros constituían la "fase líquida" estacionaria. La fase móvil consiste en un fluido apropiado
colocado en un tanque de revelado. La cromatografía en papel es una cromatografía "líquido-líquido"
-Cromatografía de capa fina: la cromatografía de capa fina es una cromatografía de "adsorción sólido-líquido".
En este método, la fase estacionaria es una sustancia adsorbente sólida que se recubre sobre placas de vidrio.
Como material adsorbente se utilizan todas las sustancias sólidas. En este método, la fase móvil viaja hacia arriba
a través de la fase estacionaria. El solvente viaja hacia arriba por la placa delgada empapada con el solvente por
medio de la acción capilar. Durante este procedimiento, también impulsa la mezcla previamente caída en las
partes inferiores de la placa con una pipeta hacia arriba con diferentes caudales. Así se consigue la separación de
analitos. Esta tasa de desplazamiento ascendente depende de la polaridad del material, la fase sólida y el disolvente
-Cromatografía de gases: en este método, la fase estacionaria es una columna que se coloca en el dispositivo y
contiene una fase estacionaria líquida que se adsorbe sobre la superficie de un sólido inerte. La cromatografía de
gases es una cromatografía "gas-líquido". Su fase portadora consta de gases como He o N2 . La fase móvil que es
un gas inerte se pasa a través de una columna a alta presión. La muestra a analizar se vaporiza y entra en una fase
de fase móvil gaseosa. Los componentes contenidos en la muestra se encuentran dispersos entre la fase móvil y
la fase estacionaria sobre el soporte sólido.
-Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC): con esta técnica de cromatografía es posible realizar análisis
estructural, funcional y purificación de muchas moléculas en poco tiempo. En HPLC, la fase móvil pasa a través
de columnas a una presión atmosférica de 10 a 400 y con un caudal elevado (0,1 a 5 cm / s). En esta técnica, el
uso de partículas pequeñas y la aplicación de alta presión sobre la tasa de flujo de disolvente aumenta el poder de
separación de HPLC y el análisis se completa en poco tiempo.
 Consulte los valores de polaridad de los disolventes más usados en el laboratorio:

“Solvents and Solvent Effects in Organic Chemistry,” Christian

Reichardt https://onlinelibrary.wiley.com/doi/book/10.1002/9783527632220

 Consulte cuáles son algunos de los criterios que más importantes que deben tenerse en cuenta en la elección
de adsorbente para desarrollar una: separación cromatográfica determinada?
 Consulte las estructuras de las sustancias utilizadas durante la práctica
Fluoresceína:

Azul de metileno:

Naranja de metilo:

Etanol:
 OBJETIVOS:
-Utilizar la técnica de cromatografía de placa delgada (TLC) para la separación de una mezcla de colorantes.
-Variar la polaridad de la fase móvil con el fin de observar la variación de Rf de cada uno de los componentes
de la mezcla.
-Ahondar en el uso y comprensión de los métodos cromatográficos como una herramienta útil en la separación
de sustancias químicas.

DIAGRAMA DE FLUJO:
- Separación de fluoresceína y azul de metileno

Tomar dos placas para cromatografía y Introducir capilar para cromatografía dentro
trazar dos líneas a una distancia de 0,7 cm de la muestra 1 y aplicar sobre cada una de
de cada extremo de la placa. las líneas que se trazaron sobre las placas.
Dejar que el solvente se evapore.

Con una pinza introducir la placa dentro de

Dejar que el frente alcance la línea superior
un vaso de 50 mL que contiene 2 ml de
y calcular Rf
acetato de etilo y tapar con vidrio reloj.

- Cambio de polaridad en fase móvil

Tomar la segunda placa e introducirla en un Dejar que se desarrolle como en el caso

vaso de 50 ml con 2 ml de acetato de etilo: anterior y calcular el Rf
etanol 1:1

- Revelado con ultravioleta

Iluminar con una lámpara ultravioleta con

Ubicar las dos placas una al lado de la otra longitude de onda larga y corta. Observar

*Llevar a cabo el mismo procedimiento para la muestra 2. En la sección de cambio de polaridad de fase se
utiliza 2 ml de etanol al 20%.