Qumica Analtica III

Introduccin a la cromatografa. Historia, Principios

bsicos, Tipos de cromatografa

Dr. Edgar F. Morn Palacio

Cromatografa
Se utiliza con los fluidos, que pueden ser gases o lquidos, se
empuja a circular la mezcla por un slido o un lquido que
permanece estacionario (fase estacionaria). Los distintos
componentes de la mezcla circulan a velocidades diferentes por la
fase estacionaria, y por lo tanto unos componentes estn ms
tiempo retenidos en ella que otros, emergiendo despus
Existen varios tipos de cromatografa que son:
1.

Cromatografa en papel

2.

Cromatografa en capa fina

3.

Cromatografa en columna

4.

Cromatografa de lquidos de alta eficiencia (HPLC)

5.

Cromatografa de gases (CG)

Principios bsicos
La cromatografa es una tcnica analtica y cuantitativa que ha
alcanzado un alto grado de desarrollo y modalidades en los
laboratorios de qumica y bioqumica. En sus diversas
aplicaciones, la cromatografa sirve para separar compuestos
qumicos y molculas diferentes a partir de mezclas
multicomponentes, las cuales pueden contener varios centenares
de sustancias diferentes

Es el mtodo ms comn para realizar separaciones analticas y tiene

aplicacin a todas las ramas de la ciencia. La importancia de la
cromatografa en la ciencia ha hecho que se hayan otorgado 12 premios
Nobel entre 1937 y 1972, a trabajos donde esta tcnica fue esencial

Cromatografa
El botnico ruso Mikhail S. Tswett formaliz el uso de la cromatografa en
los estudios cientficos por el ao 1910, dio ese nombre a la tcnica y la
aplic a la separacin de los pigmentos naturales que se encuentran en
las plantas (conocidos como carotenoides y clorofilas).

En general, la cromatografa consiste en hacer pasar una fase mvil con

un determinado disolvente (o eluyente), en este caso una mezcla de agua
y etanol -misma que contiene disuelta la mezcla de molculas que se
desea separar-, a travs de una fase fija que actuar como tamiz o filtro
selectivo, en este caso algodn. A su paso, la separacin de molculas se
produce debido a sus diferencias de tamao, geometra y distribucin de
carga elctrica

Fase mvil

En todas las separaciones cromatogrficas, la muestra se disuelve en una

fase mvil:
1. Gas
2. Lquido
3. Fluido supercrtico (Sustancia que se encuentre en condiciones de
presin y temperatura superiores a su punto crtico. Es un cuasi estado
con propiedades intermedias entre lquidos y gases)
La fase mvil se hace pasar por una fase estacionaria inmiscible, la cual
se mantiene fija en la columna o sobre una superficie slida

Fase estacionaria
Las dos fases se eligen de tal forma, que los componentes de la muestra
se distribuyen de modo distinto entre la fase mvil y estacionaria
a) Elementos que son retenidos con fuerza por la fase estacionaria se
mueven lentamente con el flujo de la fase mvil
b) Elementos que se unen dbilmente a la fase estacionaria, se mueven
con rapidez

Debido a estas diferencias los componentes se separan de manera

discriminada de manera que pueden ser analizados cualitativa y
cuantitativamente

Tipos de Cromatografa
Segn el estado fsico del eluyente
cromatografa de gases
cromatografa de lquidos

Segn el estado fsico del lecho

lquido-lquido
slido-lquido

Segn las caractersticas del lecho cromatogrfico

abierto: en papel, en capa fina
cerrado: en columna

Segn la presin del eluyente

Baja presin

Alta presin

Tipos de Cromatografa
Segn la composicin del eluyente
Isocrtica
De gradiente

Segn la polaridad de la fase estacionaria

Fase normal
Fase reversa

Segn el mecanismo de retencin

De reparto
De filtracin en gel o de exclusin molecular
De adsorcin
De intercambio inico

De afinidad

Cromatografa en papel
Pertenece al tipo Cromatografa de particin se fundamenta en
que las sustancia problema, puedan tener diferentes
coeficientes de reparto en dos disolventes de inmisibilidad
limitada, uno permanece fijo en la superficie del papel fase
estacionaria
Es la ms sencilla de las cromatogrficas, y a la vez muy similar
a la cromatografa en capa fina o Thin Layer Chromatography
(TLC).
Se utiliza solamente con un propsito analtico, en situaciones
donde los compuestos a ser identificados son fcilmente
adsorbidos en papel y no en slica gel de la TLC

Cromatografa en papel
Descendente: Se trata de una caja saturada de vapor de agua,
atravesada por una cajetn semicilndrico lleno con el solvente
orgnico. En el se deposita, como muestra la figura el papel con la
banda de muestra justo al salir el papel del cajetn. Para sujetar el
papel introducimos una varilla a lo largo de la caja. El solvente
comenzar ascendiendo por el papel por capilaridad y continuar
bajando al salir de la cajetilla, pasando por la zona de muestra y
arrastrndola, consiguindose as la separacin
Ascendente: El solvente se encuentra en la parte inferior de la cubeta
y asciende por el papel haciendo que se separe la muestra. La
resolucin de la cromatografa en papel descendente es mayor

En este tipo de experimento puede se aplicado para diferenciar

muestras y componentes de una mezcla caracterizada. Se
controlan tres variables durante esta tcnica:

1. El solvente
2. El papel
3. Distancia recorrida por el solvente

Rf o Fraccin representativa

La distancia recorrida por el solvente es la variable mas

difcil de controlar y comparar los radios de las muestras
de diferentes experimentos, a los cuales se les llama Rf
(Del ingls: retention factor)
La Rf, es definida por la ecuacin:
Rf = Distancia del centro de la muestra al punto inicial
Distancia final del solvente al punto de inicio

El Rf para un compuesto es una constante de un

experimento a otro solamente si las siguientes
condiciones de la cromatografa son tambin constantes:
Sistema de solventes
Adsorbente
Grosor del adsorbente
Cantidad de muestra
Temperatura

Al

comparar
dos
compuestos
bajo
condiciones
cromatogrficas idnticas, el compuesto con el Rf ms
grande es menos polar porque interacciona con menos
fuerza con el adsorbente polar en la placa del TLC

Revelado y clculo de Rf
Una vez corrido el
disolvente se retira el
papel y se deja secar,
se trata con un reactivo
qumico con el fin de
poder
revelar
las
manchas
Esta cromatografa se
usa
para
una
identificacin
cualitativa. En un papel
filtro se coloca un poco
de muestra y despus
se revela y se miden
las
distintas
velocidades

Cromatografa en Capa Fina

Ismailov y Scraiber utilizaron lminas de vidrio para

colocar capas muy delgadas de almina y luego aplicaron
extractos vegetales, dando as la primera forma de
Cromatografa de Capa Fina
Egon Stahl (1956) di el nombre de Cromatografa de
Capa Fina. Estandariz los procedimientos, equipos y
adsorbentes dando un auge a la tcnica simple, a bajo
costo y eficiente

Proceso de Adsorcin

La muestra aplicada en la capa es adsorbida en la

superficie del material por la accin de fuerzas
electrostticas (fuerzas de Van der Waals, puentes de
Hidrgeno, efectos inductivos, etc). Luego, cuando la
capa es expuesta a un flujo por accin capilar, se inicia
una competencia de enlaces entre los sitios activos del
adsorbente y la sustancia con el solvente

Adsorbentes
Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)
xido de Aluminio Almina (cida, neutra bsica)
Tierra Silcea Kieselguhr
Celulosa (Nativa o micro-cristalina)
Poliamidas

Adsorbentes y preparacin
Se
Tamao de Partcula
Volmen de Poro
Dimetro de Poro
rea Superficial

Homogeneidad
Pureza

usan como soporte del

adsorbente
lminas
de:
Vidrio, Plstico Metlicos

Los tamaos de la placa para

TLC convencional son : 20
cm x 20 cm; 10 cm x 20 cm y
5 cm x 2 cm
Hay placas que contienen un
indicador de Fluorescencia:
F254 F366. El nmero que
apararece como subndice
nos indica la longitud de onda
de excitacin del indicador
utilizado

Desarrollo y revelado de la placa

Es un proceso mediante el cual son transportados a
travs de la fase estacionaria por la fase mvil
Si la muestra (mancha) no es coloreada se requiere de
mtodos
que
nos
permitan
visualizar
el(los)
componente(s) presentes. Tambin se conoce este
procedimiento como Revelado
Mtodos de revelado:
Qumicos (por inmersin o rociado). Se obtienen
derivados coloreados o fluorescentes
Fsicos (pticos). Generalmente se utiliza radiacin
UV

Evaluacin de un Cromatograma
de Capa Fina
Anlisis Cualitativo
Medida de Rf
Comparacin Visual de Color/Intensidad
Propiedades UV/IR/MS/NMR
Anlisis Cuantitativo

Semi-cuantitativo
Comparacin visual del dimetro y la intensidad del
color de la mancha contra una serie de manchas
patrones de concentracin conocida

Evaluacin de un Cromatograma
de Capa Fina
Cuantitativo
Indirecta
Directa
Densitometra
Medida de Transmisin. Medida de luz
transmitida a travs de la sustancia
Medida de Emisin. Medida de luz
reflejada desde la sustancia
Espectrofotometra
Fluorescencia
Fluorescencia con "quenching"

Proceso en pasos
Primera etapa: Aplicacin de las muestras a analizar
La primera precaucin que hay que tener en el manejo de
la placa es la de procurar no tocar con los dedos la capa
de celulosa. La placa fina se coge siempre por los bordes
de la misma

Se coloca la placa encima de la mesa, y con un lpiz se

traza una lnea muy dbil a unos 1,5 cm del borde inferior
de la placa, procurando daar lo mnimo posible la capa
En la lnea se sealan dbilmente cinco puntos,
distribuidos equitativamente a lo ancho de la placa

En cada punto de ellos se aplica cada uno de los patrones

y la muestra problema
La segunda precaucin a considerar es la de no
contaminar las disoluciones de los patrones y la muestra
problema

Se aplica en la placa una gota

de la muestra, procurando que
se extienda lo menos posible y
no dae la capa. Se seca a
continuacin con el secador de
aire. Se aplica una segunda
gota y se vuelve a secar. Esta
operacin se repite para cada
unas de las muestras

Una vez realizada la aplicacin

de cada muestra es importante
anotar en el cuaderno de
laboratorio las posiciones en
las que se ha colocado cada
patrn y el problema

Segunda etapa: Elucin de las muestras

La cromatografa se realiza en la cubeta o cmara de
desarrollo. La cubeta contiene un volumen de fase mvil,
cuya altura de lquido debe de estar siempre por debajo
de la lnea de aplicacin de las muestras.

La placa que contiene las muestras se introduce en la

cubeta. Se coloca la tapa de la cubeta y se espera que la
fase mvil ascienda por la capa hasta que alcance una
altura de hasta unos 2-3 cm del extremo opuesto a la
parte sumergida. Una vez realizada la elusin, se abre la
tapa de la cubeta y se saca la placa

Tercera etapa: Secado y visualizacin de la muestra

Inmediatamente que se ha sacado la placa, con el lpiz
se marca en un borde el nivel alcanzado. Se introduce en
la estufa durante unos 5 min para que se seque

A continuacin, mediante unas pinzas de madera se

sumerge en la cubeta que contiene la solucin de
ninhidrina. Una vez que toda la placa se ha impregnado,
se saca inmediatamente de la cubeta, dejando que
escurra el exceso de solucin de ninhidrina, y se vuelve a
introducir en la estufa durante 3 min para que se realice la
reaccin de color

TLC
En la cromatografa de capa fina, la fase estacionaria es
una delgada capa de un soporte slido granulado, la fase
estacionaria est hidratada, por lo que se le considera
como la fase polar
La placa seca se sumerge en un pequeo volumen de fase
mvil (mezcla de solventes). La polaridad de la mezcla de
solventes se elige de acuerdo a la mezcla de compuestos
que se desea separar

Como slo la base de la placa queda sumergida, el

solvente comienza a mojar la fase estacionaria y asciende
por capilaridad. Al recorrer la placa la fase mvil va
arrastrando a las substancias apolares y aquellas ms
polares son retenidas por la fase estacionario dando lugar
a la separacin

Revelado en 1 dimensin

Tomado de: Anlisis Qumico. Mtodos y tcnicas instrumentales

modernas. 2003. Francis y Annick Rouessac. Ed. MacGrawHill.

Revelado en 2 dimensiones

Tomado de: Anlisis Qumico. Mtodos y tcnicas instrumentales

modernas. 2003. Francis y Annick Rouessac. Ed. MacGrawHill.

Migracin segn el solvente

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modernas. 2003. Francis y Annick Rouessac. Ed. MacGrawHill.

TLC cuantitativa
Para poder utilizar la TLC como un mtodo cuantitativo de
anlisis, hace falta poder cuantificar las manchas (figura
5.1 y 5.5). En este caso, la placa a examinar se desplaza
bajo la luz de un densitmetro (o escner) que mide la
absorcin o la fluorescencia, a una o varias longitudes de
onda. Este aparato realiza un diagrama que es un pseudo
cromatograma con picos donde es posible medir reas. Se
trata, de hecho, de una imagen isocrnica de la separacin
en el instante final

Tomado de: Anlisis Qumico. Mtodos y tcnicas instrumentales

modernas. 2003. Francis y Annick Rouessac. Ed. MacGrawHill.

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modernas. 2003. Francis y Annick Rouessac. Ed. MacGrawHill.

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modernas. 2003. Francis y Annick Rouessac. Ed. MacGrawHill.

Cuando se deben revelar compuestos marcados por un

radioistopo -, se dispone entonces de densitometros
particulares equipados de una cmara de vdeo que da
una imagen de la distribucin radioactiva de la placa. El
antiguo procedimiento de la radiografa por contacto sobre
una placa fotogrfica tiene el defecto de ser lento (pueden
superarse las 48 h de exposicin) y muy poco sensible.
Estos nuevos aparatos, conocidos bajo el nombre de
mquinas de Charpak son utilizados igualmente en
electroforesis en gel. La sensibilidad es suficiente como
para descubrir actividades de algunos Becquerel por mm2

Tomado de: Anlisis Qumico. Mtodos y tcnicas instrumentales

modernas. 2003. Francis y Annick Rouessac. Ed. MacGrawHill.

TLC vs HPLC
Para muchas aplicaciones, la TLC permite evitar recurrir a
la HPLC. Aunque actualmente la TLC requiere todava una
mayor intervencin humana que la HPLC, el uso de
nuevos dispositivos ms perfeccionados para la aplicacin,
desarrollo empleando gradientes de elusin, revelado y
lectura de la placa, le confiere la reproducibilidad necesaria
Los resultados obtenidos con esta tcnica vienen a ser
comparables a los de HPLC
En comparacin con esta ltima, se considera que la TLC
es adecuada para tratar, en un mismo tiempo, un nmero
de muestras cuatro veces superior. Una misma placa
permite realizar numerosos anlisis simultneos, en
paralelo, en condiciones idnticas
Tomado de: Anlisis Qumico. Mtodos y tcnicas instrumentales
modernas. 2003. Francis y Annick Rouessac. Ed. MacGrawHill.

Las placas de TLC de un solo uso permiten una

preparacin ms rpida de la muestra, con un menor
riesgo de prdida o de contaminacin del compuesto a
analizar

Existe la posibilidad de elegir entre diversas fases

estacionarias enlazadas, de polaridad media, de las cuales
algunas de ellas estn destinadas a realizar separaciones
de enantimeros
La placa de TLC puede ser considerada como un medio,
provisional, de conservar muestras muy pequeas, que
despus de la extraccin, pueden servir para otros anlisis
(espectrometra de masas)
Sin embargo, la TLC queda an lejos de ser una
tcnica de apoyo para la mayora de los qumicos
Tomado de: Anlisis Qumico. Mtodos y tcnicas instrumentales
modernas. 2003. Francis y Annick Rouessac. Ed. MacGrawHill.

Particularidades asociadas a la TLC

La TLC pone en juego fenmenos fsico-qumicos ms
complejos que la HPLC. Comprende un sistema donde
estn presentes tres fases distintas: una fase estacionaria
slida, una fase mvil lquida, una fase vapor en equilibrio
La fase estacionaria slo est parcialmente equilibrada por
la fase lquida antes del paso de los compuestos
La capacidad de absorcin de la superficie disminuye a
medida que una parte de los sitios de absorcin son
ocupados, lo que da como resultado el ensanchar la
longitud de las manchas

Tomado de: Anlisis Qumico. Mtodos y tcnicas instrumentales

modernas. 2003. Francis y Annick Rouessac. Ed. MacGrawHill.

El Rf de un compuesto en estado puro o presente en una

mezcla es ligeramente diferente
No es posible hacer variar el flujo de la fase mvil para
mejorar la separacin
La velocidad de migracin del frente del disolvente no es
constante. Es una funcin compleja donde interviene, entre
otros, la dimensin de las partculas de la fase estacionaria

La resolucin entre dos manchas depende ms del Rf que

del compuesto

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modernas. 2003. Francis y Annick Rouessac. Ed. MacGrawHill.

A,B y C quien sale primero en la placa?. Hexano:Acetona. 80:20