Instituto Politécnico

Nacional
Escuela Superior de Ingeniería
Química e Industrias
Extractivas

Laboratorio de Técnicas de Separación

Practica No. 1 “Encendido y purga de un cromatógrafo

de líquidos de alta resolución”

Profesor: Luis Camacho

Alumno: Ramirez Rodriguez Brandon Azael

No. Boleta: 2020320578

Grupo: 3IM79 Fecha: 2/Sep/2022

 Contenido

Objetivos ................................................................................................................ 3
Introducción Teórica............................................................................................... 4
Clasificaciones ................................................................................................... 5
Parámetros cromatográficos ............................................................................... 8
Instrumentación ................................................................................................ 11
Desarrollo experimental ....................................................................................... 14
Bibliografía ......................................................................................................... 15
 Objetivos
• Conoce las partes que integran a un cromatógrafo de líquidos de alta
resolución (CLAR en español o HPLC en inglés), básico.

• Conocer los pasos correctos para realizar el encendido del cromatógrafo de

líquidos Flexar de Perkin Elmer.

• Conocer los pasos correctos para realizar la purga del cromatógrafo de

líquidos Flexar de Perkin Elmer.

• Conocer los pasos correctos para realizar el apagado del cromatógrafo de

líquidos Flexar de Perkin Elmer.
 Introducción Teórica
El termino cromatografía significa escritura en color y fue usado por primera vez por
M.S. Tsweet, un biólogo ruso, en 1906, cuando consiguió separar diferentes
componentes coloreados de un extracto vegetal.
La cromatografía es una técnica de separación física en la que los componentes de
una muestra se distribuyen entre dos diferentes fases, una fija (fase estacionaria) y
otra que se mueve (fase móvil), la fase que se mueve se mantiene en contacto con
la fase que permanece fija y se mueve en una dirección definida.
El proceso cromatográfico sucede gracias a que los componentes de la muestra
tienen repetidos equilibrios de distribución entre las dos fases, las cuales no son
miscibles entre sí. Estos equilibrios están descritos por diferentes ecuaciones que
suponen que existe una transferencia de un analito entre ambas fases. Existe una
constante para el equilibrio, la cual es llamada constante de distribución o
coeficiente de distribución.
En cualquier proceso cromatográfico la fase móvil se encarga de transportar los
diferentes solutos a través de la fase estacionaria. Las dos fases deben ser elegidas
de forma que los componentes que se desean separar se distribuyan de distinta
forma entre ellas. De esta forma, los componentes con una mayor afinidad a la fase
estacionaria irán más lentos, mientras que, los de menor afinidad, se moverán a una
mayor velocidad siendo transportados por la fase móvil.
El equilibrio de distribución se produce cuando la mezcla de solutos entra en
contacto con las dos fases, al avanzar la fase móvil a través del lecho
cromatográfico, el gradiente de concentración entre las dos fases da lugar a que se
establezco otro nuevo equilibrio de distribución en un punto posterior.
La diferente movilidad de los analitos en la fase móvil a través de la fase estacionaria
permite la separación de los compuestos. De esta forma, el proceso de separación
se considera como un proceso dinámico que se logra debido a las diferencias en
las constantes de distribución de los componentes individuales de la muestra entre
estas dos fases.
 Clasificaciones

Existen diferentes clasificaciones para los métodos cromatográficos:

1.- Según el estado físico de las fases:
a) Cromatografía Gas-Liquido: este tipo de cromatografía utiliza como fase
móvil un gas y como fase estacionaria un líquido.
b) Cromatografía Gas-Solido: tiene como fase móvil un gas y como fase
estacionaria un sólido.
c) Cromatografía liquido-liquido: en este caso tanto la fase móvil como la fase
estacionaria, es un líquido.
d) Cromatografía liquido-solido: la fase móvil es un líquido y la estacionaria un
sólido.
2.- Según el mecanismo de operación:
a) Cromatografía de adsorción: los
componentes de la muestra son
retenidos mediante adsorción
selectiva en la superficie de un
sólido de elevada superficie
especifica que constituye la fase
estacionaria. Las moléculas de
soluto y solvente compiten por las
posiciones en el adsorbente. Este
mecanismo es el más habitual en
cromatografía liquido-solido.

b) Cromatografía de reparto: la fase estacionaria es un líquido que se encuentra

impregnando un soporte sólido. El soluto se reparte entre la fase estacionaria
liquida y la fase móvil de acuerdo con su solubilidad en cada una de ellas.
 c) Cromatografía de intercambio iónico: la fase estacionaria
es un sólido que contiene grupos cargados positiva o
negativamente, teniendo la capacidad de separar especies
iónicas. Los solutos de carga opuesta a la fase estacionaria
son atraídos por ésta mediante fuerzas electrostáticas.

d) Cromatografía de exclusión molecular: también llamada de filtración o

permeación de gel, la fase estacionaria está constituida por un polímero
entrecruzado de tamaño de poro definido. Las moléculas grandes, no
compatibles con el tamaño del poro siguen su avance, mientras que las más
pequeñas quedan retenidas en los intersticios del gel. Esta modalidad
cromatográfica es útil para especies neutras de alto peso molecular,
realizándose la separación en función de su tamaño.

e) Cromatografía de afinidad: permite la separación de mezclas por su

interacción especifica con un determinado ligado de actividad: enzima-
sustrato, antígeno-anticuerpo.

3.- Según la disposición o configuración de la fase estacionaria.

 a) Cromatografía en columna: la fase estacionaria se encuentra empaquetada
en el interior de una columna generalmente fabricada en acero, polímero o
vidrio.

b) Cromatografía plana
• Cromatografía en capa fina: la fase estacionaria esta
extendida sobre un soporte solido inerte de vidrio,
plástico o aluminio. La muestra para análisis se aplica
por medio de un tubo capilar sobre la superficie de una
capa fina adsorbente en forma de banda o punto.
• Cromatografía en papel: se denomina de esta forma a
la cromatografía plana que emplea celulosa como fase estacionaria.

Cromatografía de líquidos en columna

Dentro de las técnicas cromatográficas que emplean como fase móvil un líquido se
incluyen tanto la cromatografía en papel y capa fina como la cromatografía en
columna.
En un inicio en la cromatografía liquida en columna se trabajaba con columnas
relativamente grandes haciendo pasar la fase móvil a través del lecho
cromatográfico mediante la gravedad. El lecho cromatográfico estaba constituido
por partículas de tamaño grande (150-250 µm). Algunas de las desventajas que
presentaba este diseño son:
 • Tediosos procedimientos de empaquetado de las columnas.
• La columna se suele usar solo una vez, por lo que es una técnica cara.
• Baja eficiencia al trabajar con partículas grandes.
• Los tiempos de análisis son excesivamente largos, inclusive para
mezclas simples.
• El diseño es fuertemente dependiente de la forma en que el operador
aplique la muestra.
• La detección de los solutos manual no permite la automatización.

Parámetros cromatográficos

De esta manera, la cromatografía liquida en columna fue perdiendo su uso frente al

avance de la cromatografía de gases que presentaba como grandes ventajas frente
a las anteriores la alta eficiencia de las columnas y el que se podía usar tanto en
escala analítica como preparativa.
El principal problema
de la eficacia en
cromatografía liquida
clásica en columna
abierta clásica era que
tenía una baja
velocidad de difusión
de las molecular de
soluto entre las fases
estacionaria y móvil. La
única forma de
aumentar la eficiencia
de las columnas era aumentar la velocidad de la transferencia de masa y
equilibración de las moléculas de soluto entre ambas fases. Los tratados teóricos
clásicos de Van Deemter y Giddings sugerían que ese objetivo solo se podía llevar
a cabo utilizando rellenos de tamaños de partículas muy pequeños. La reducción
del tamaño de la partícula hasta valores de 5 µm conlleva a la necesidad de utilizar
sistemas de propulsión de las fases móviles que puedan impulsarlas a través de
estos nuevos lechos, es decir que sean capaces de trabajar a altas presiones (34-
340 atm). Por lo tanto, tanto las bombas como las columnas y conexiones deben
soportar unas condiciones de trabajo de alta presión. De esta manera, surge la
cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC/CLAR), en esta técnica se utiliza
una alta presión para forzar el paso de la fase móvil a través de una columna que
contiene partículas de pequeño tamaño. Obteniéndose como beneficios:
• Aumentar la eficacia de la separación al disminuir el tamaño de la
partícula.
• Reducir la duración del proceso de separación entre 5 y 50 veces.
• Permitir realizar la detección en continuo del eluato y por lo tanto la
automatización.
• Trabajar a escala preparativa.

Un crogratograma es el registro de señales de respuesta producidas en un detector

debido a la presencia de los analitos en la salida de una columna cromatográfica.
Esto corresponde a un registro de perfil de concentración, o masa, de los
componentes que hay en la muestra como resultado del movimiento de la fase móvil
o como el volumen eludido desde la introducción de la muestra. Debido a que se
trabaja a un flujo constante de la fase móvil, se registra la señal analítica en el
detector frente al tiempo transcurrido desde que la mezcla se puso en contacto con
la fase móvil y la estacionaria. De tal forma que, esos tiempos representan el
volumen de la fase móvil necesaria para la elución del analito.
El número de picos cromatográficos es el
numero de compuestos que se separaron
en la solución y nos proporciona
información acerca del grado de
complejidad de la muestra. En el
cromatograma se obtienen datos
suficientes para poder hacer un análisis
cualitativo y cuantitativo. De manera
cualitativa se puede evaluar la posición de
los picos en el cromatograma, mientras
que, de manera cuantitativa se tiene el
área bajo el pico cromatográfico, que
permite conocer la cantidad de cada sustancia que se encuentra en la mezcla. Por
otra parte, el cromatograma nos proporciona información sobre el comportamiento
de la columna.
El cromatograma se obtiene a partir de la señal que se genera por las partículas de
cada una de las sustancias en la mezcla en la salida de la columna. A partir del
cromatograma se pueden definir los parámetros cromatográficos de retención.
Las moléculas idénticas que forman el soluto entran al sistema cromatográfico en
un momento especifico. Cuando una molécula de soluto está en la fase móvil
avanza a la misma velocidad lineal que esta. Cuando entra en contacto con la fase
estacionaria permanece retenida, según la afinidad que tenga, siendo su velocidad
lineal nula hasta que vuelve a la fase móvil. Si se deja eluir el conjunto de moléculas
idénticas, cada una de estas habrá tardado un tiempo en recorrer el sistema que
debería ser el mismo si no existieran fenómenos de dispersión. Este tiempo se
denomina tiempo de retención y coincide con el tiempo medio que todas las
moléculas idénticas tardan en recorrer el sistema. Para efectos prácticos es el
tiempo que transcurre desde la inyección de la mezcla al sistema, hasta que un
determinado soluto alcanza el detector.
Un cromatógrafo consiste en un sistema compuesto de un reservorio de fase móvil,
una bomba de alta presión, un sistema de introducción de muestra, la columna
cromatográfica, un sistema de detección y un sistema de adquisición y tratamiento
de datos que permita visualizar la separación.

Los cromatógrafos se comercializan con una disposición integrada o modular, la

cual ofrece una mayor flexibilidad instrumental. Comúnmente están fabricados en
acero inoxidable debido a la resistencia mecánica que tiene este material. A pesar
de esto pueden existir problemas de corrosión, de contaminación y de degradación,
para estos casos se desarrollaron instrumentos resistentes a la corrosión y
biocompatibles, incluyendo mecanismos de titanio y/o fluoropolímeros en los
componentes más importantes.

Instrumentación

Depósitos de la fase móvil.

Los depósitos que contienen la fase móvil que se va a utilizar en el
sistema cromatográfico deben estar fabricados en un material
inerte a la posible reacción con la fase móvil. Habitualmente
consiste en una botella de vidrio, material platico o un Erlenmeyer
equipado con un tapón perforado y un tubo flexible para la
adecuada conexión al sistema de bombeo. En el otro extremo, el
tubo de conexión sumergido en el recipiente de la fase móvil acaba
en un filtro de 2µm de tamaño de poro con el fin de prevenir la
entrada de partículas en suspensión a la bomba.

Sistemas de bombeo
El sistema de bombeo es un componente de suma importancia en el sistema
cromatográfico, su misión es hacer pasar un caudal constante de fase móvil a través
de la columna cromatográfica.
Se podría suponer que para obtener un caudal constante es suficiente con mantener
la presión constante en la cabeza de la columna, pero experimentalmente no sucede
así. La relación entre el caudal de la fase móvil en la columna y la caída de presión,
ΔP, viene dada por la ley de Darcy.
Por lo tanto, la calidad de una bomba en HPLC se mide de acuerdo con la
reproductibilidad y constancia del caudal suministrado. Un caudal variable da origen
a ruido en el detector, lo que lleva a una menor precisión en la detección de señales
débiles. Los sistemas de bombeo deben cumplir los siguientes requisitos:
• Estar fabricados de materiales químicamente inertes a la fase móvil.
• Generar presiones por encima de 400 atm.
• Suministrar un caudal libre de pulsaciones o llevar un sistema
amortiguador de las mismas.
• Proporcionar caudales adecuados para diferentes tipos de columnas.
• Normalmente se exigen caudales de 10 µL/min a 100 µL/min.
• Suministrar caudales reproducibles a lo largo del tiempo
 • Los cabezales de la bomba deben tener un pequeño volumen para
facilitar y llevar a cabo cambios rápidos en la composición de la fase
móvil.

Sistemas de introducción de muestra

Los sistemas de introducción de muestra se sitúan entre el sistema de bombeo y la
columna cromatográfica. Son montajes diseñados para introducir un volumen de
muestra líquida en el sistema hidrodinámico de alta presión. Es un elemento
fundamental en el cromatógrafo de líquidos y de su buen funcionamiento depende
la correcta cuantificación de los picos y su resolución.
El sistema de inyección debe cumplir los siguientes requisitos:
• Introducir la muestra dentro del sistema en una banda cromatográfica
lo mas estrecha posible, originando la mínima dispersión de la
muestra.
• Poder introducir volúmenes pequeños y poder variar dicho volumen
fácilmente.
• Ser capaces de trabajar a presiones elevadas.
• Proporcionar resultados reproducibles.
• Su funcionamiento no debe alterar las características hidrodinámicas
del sistema.
Columnas y rellenos
La columna cromatográfica es
la parte esencial del
cromatógrafo de líquidos ya
que en ella tiene lugar la
separación o discriminación
entre analitos e interferentes.
Por lo tanto, debe indicarse
una atención especial al
material que se usa como
relleno de columna y también
a la influencia de los
parámetros de la columna sobre su eficacia.
Excepto en el caso de las capilares, las columnas constan de un tubo que contiene
relleno cromatográfico, dos conexiones y dos fritados. El tubo debe ser de un
material químicamente inerte, mecánicamente resistente y soportar las altas
presiones de trabajo, de diámetro interno homogéneo y con pared interior
pulimentada. El material mas utilizado es el acero inoxidable, aunque está
aumentando el número de columnas cuyo tubo está fabricado de un material
polimérico.
La pared interior debe ser perfectamente homogénea para evitar perdidas de
eficacia y resolución producidas por el denominado efecto pared.

Detectores
Una vez concluida la separación, surge el problema de detectar las zonas de
soluto y, en caso necesario medir su concentración. Para ello se utilizan los
detectores, estos son capaces de transformar en señal eléctrica alguna propiedad
de la fase móvil o de los solutos, siendo capaces de proporcionar información
sobre la presencia de las especies separadas en la columna cromatográfica.
Los detectores en continuo no son los únicos utilizados en la cromatografía de
líquidos. En algunos casos se utiliza la colección de fracciones a intervalos
regulares de tiempo para la posterior identificación y cuantificación del producto
eluido.
 Desarrollo experimental
Encendido del equipo
• Encender los dos reguladores.
• Conectar el eliminador de administrador de solventes.
• Encender la bomba.
• Encender el detector.
• Esperar a que los indicadores enciendan en verde.
• Encender la computadora.
• Iniciar el programa “Chromera”

Purga del equipo

• Tomar una jeringa con la mitad de aire y la mitad de solvente.
• Abrir la válvula de purga.
• Conectar la jeringa.
• Comenzar el procedimiento de purga desde el programa “Chromera”.
• Dejar purgar por aproximadamente 5 min.

Apagado del equipo

• Iniciar el método “Apagado” desde el programa.
• Esperar a que el método se finalice.
• Cerrar el programa “Chromera”.
• Apagar la computadora.
• Apagar la bomba.
• Apagar el detector.
• Desconectar el eliminador de administrador de solventes.
• Apagar los reguladore
 Bibliografía
Cela, R., Lorenzo, R. A., & Casais, d. M. (2002). Técnicas de separacion en
Química analítica. Madrid: EDITORIAL SÍNTESIS.
Gismera Garcia, M. J., Quintana Mani, M. d., & da Silva de Campos, M. d. (2009).
Introducción a la Cromatografía Líquida de Alta Resolución. Madrid:
Universidad Autonoma de Madrid.
Skoog, D. A., Holler, J. F., & Crouch, S. R. (s.f.). Principios de análisis
instrumental.