Preparacin de un extracto vegetal para la separacin de sus compuestos por cromatografa en

capa fina y columna abierta

Objetivo: obtener un extracto vegetal para la separacin de sus compuestos por cromatografa en
capa fina y columna abierta.

Introduccin

Introduccin a la cromatografa

Los mtodos cromatogrficos son mtodos de separacin que involucran la transferencia

reversible de un compuesto que est adsorbido en una fase estacionaria (adsorbente) a una fase
mvil (solvente) que fluye a travs de la fase estacionaria.

En 1906, el botnico Ruso M. Tswett realiz un experimento que condujo al descubrimiento de lo

que hoy conocemos como cromatografa. Coloc un extracto de pigmentos vegetales en la parte
superior de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio (CaCO3). Al agregar ter, observ
que la mezcla original se separaba en diversas bandas coloridas que descendan a travs de la
columna a diferentes velocidades. Un rasgo caracterstico de la cromatografa es la presencia de
dos fases; dispuestas de tal manera que mientras una permanece estacionaria dentro del sistema
(fase estacionaria), la otra se desplaza a lo largo de l (fase mvil). La clave de la separacin en
cromatografa es que la velocidad con la que se mueve cada sustancia depende de su afinidad
relativa por ambas fases (equilibrio de distribucin). En el experimento de Tswett, la separacin de
los pigmentos vegetales se logr gracias a que cada uno de ellos tena una afinidad diferente por
las fases. En general, los componentes ms afines a la fase estacionaria avanzan lentamente (ms
retenidos) mientras que los ms afines a la fase mvil (menos retenidos) se mueven con mayor
rapidez. Por consecuencia, el medio cromatogrfico (columna, placa o papel) funciona como un
controlador de la velocidad de cada sustancia que constituye la mezcla, logrando as su separacin
y mediante el uso de un detector, su caracterizacin qumica. Aunque los principios
fundamentales son los mismos, se acostumbra clasificar los mtodos cromatogrficos segn el
estado fsico de la fase mvil: Cromatografa lquida. La fase mvil es un disolvente o mezcla de
disolventes y la fase estacionaria un slido que interacta con las sustancias que se desea separar
(cromatografa lquido-slido), o bien un lquido inmiscible con la fase mvil, depositado en la
superficie de un slido (cromatografa lquido-lquido). Esta forma de cromatografa puede
realizarse con diferentes arreglos experimentales: en columna, en capa delgada o en papel. En el
primer caso, la fase estacionaria se encuentra rellenando un tubo; en el segundo, se dispersa
sobre una lmina de vidrio o aluminio formando un lecho de espesor uniforme; en la
cromatografa en papel, la fase estacionaria es la solucin acuosa contenida en el interior de las
celdas formadas por las fibras de la celulosa, y es por tanto una forma de cromatografa lquido-
lquido.
Cromatografa en capa fina

La cromatografa en capa fina se basa en la preparacin de una capa, uniforme, de un adsorbente

mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales son, un adsorbente,
placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensin, otro para aplicar la
capa de adsorbente, y una cmara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso tambin
poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas. La fase mvil es
lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La fase estacionaria ser un componente polar
y el eluyente ser por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los
componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos polares.

Polaridad de los compuestos orgnicos en orden creciente:

hidrocarburos < olefinas < flor < cloro < nitro < aldehdo

aldehdo < ester < alcohol < cetonas < aminas < cidos < amidas

La cromatografa en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros mtodos
cromatogrficos (en columna, en papel, en fase gaseosa). El tiempo que se necesita para conseguir
las separaciones es mucho menor y la separacin es generalmente mejor. Pueden usarse
reveladores corrosivos, que sobre papel destruiran el cromatograma. El mtodo es simple y los
resultados son fcilmente reproducibles, lo que hace que sea un mtodo adecuado para fines
analticos. Al realizar la eleccin del adsorbente se debe tener en cuenta el tamao de las
partculas del adsorbente, cuanto ms finamente dividido est mayor ser su adhesin al soporte,
aunque tambin se le puede aadir un adherente.

En la eleccin del eluyente influyen varios factores:

Precio.

Pureza.

No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad).

No utilizar compuestos muy voltiles.

Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).

La eleccin del eluyente se realiza de forma emprica. Hay que estudiar la polaridad del
componente y probar con eluyentes cada vez menos polares. Generalmente se utiliza como
reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados con los componentes orgnicos (con
tonos amarillo-marrn), pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente
sealar las manchas aparecidas. Otro reactivo revelador bastante utilizado es el cido sulfrico,
que reacciona con los componentes orgnicos produciendo manchas negras. Sin embargo, debe
tenerse en cuenta que el tamao de las manchas no est relacionado con la cantidad de
componente separado.
Cromatografa en columna abierta

Este tipo de cromatografa se caracteriza porque la fase estacionaria se coloca en una columna
vertical; generalmente es un material inerte finalmente dividido y hmedo.

La muestra es separada cuando es llevada hacia debajo de la columna por el eluente. El coeficiente
de distribucin, con respecto a las dos fases es diferente para cada componente de la muestra, por
lo tanto, cada uno viaja a travs de la columna, separndose en tiempos relativamente cortos. La
adicin continua del eluente finalmente fluye cada uno de los componentes, quedando como
soluciones coloreadas, la recuperacin de los compuestos puros solo es posible, por simple
evaporacin del solvente. Este tipo de cromatografa se cataloga dentro de la cromatografa de
particin.

Cuando la columna se empaca con el material de soporte humedecido con el mismo eluente, se
incluye en el tipo de cromatografa de adsorcin. La velocidad de separacin en este caso depende
del grado de adsorcin que tengan los compuestos con el soporte.

Metodologa

Parte 1. Obtencin del extracto vegetal

1. Pesar 10 gr de hojas secas de planta proporcionadas por la profesora.

2. Triturar las hojas manualmente o con un mortero.
3. Depositar las hojas trituradas en un vaso de precipitado de 400 mL y agregar 100 mL de
acetato de etilo, tapar el vaso con papel aluminio.
4. Calentar a 180 C con agitacin durante 20 minutos.
5. Filtrar el disolvente y depositarlo en un recipiente de vidrio previamente pesado.

Parte 2. Montaje en seco de la columna

1. Sujetar con pinzas en el soporte universal la columna.

2. Depositar una mota de algodn.
3. Depositar 10 g de slica gel fase normal.
4. Verter por las paredes n-hexano suavemente hasta que se hidrate.

Parte 3. Montaje en hmedo de la columna

1. Sujetar con pinzas en el soporte universal la columna.

2. Depositar una mota de algodn.
3. En un vaso de precipitado de 250 mL depositar 10 g de slica gel e hidratar con n-hexano
mezclando con un agitador de vidrio.
4. Depositar la mezcla en la columna con un embudo.

Parte 4. Perfil metablico por cromatografa en capa fina

1. Medir con una regla 0.5 cm de abajo hacia arriba la cromatoplaca y marcar una lnea.
2. Sobre la lnea marcada realiza tres separaciones (a, b y c) de 0.5 cm.
3. Aplicar la muestra (extracto de las hojas en acetato de etilo) con un capilar de la siguiente
manera:
a) Una aplicacin
b) Tres aplicaciones
c) Cinco aplicaciones
4. Preparar un sistema n-hexano: acetato de etilo (85:15) en una probeta de 10 mL y mezclar
en vaso de precipitado de 50 mL.
5. Colocar en la cmara de elusin el sistema y la cromatoplaca.
6. Cuando la fase mvil haya terminado de eluir retirar la cromatoplaca.
7. Dejar secar la cromatoplaca.
8. Observar la cromatoplaca en UV.
9. Aplicar revelador en campana de extraccin.
10. Calentar la cromatoplaca a 110 C en parrilla de calentamiento.

Cuestionario previo

1. Qu son los mtodos cromatogrficos?

2. Menciona y describe las dos fases caractersticas de la cromatografa.
3. Qu es un medio cromatogrfico? Menciona dos ejemplos.
4. Menciona las caractersticas de la cromatografa lquida.
5. Cul es la base principal de la comatrografa en capa fina?
6. Cules son los requerimientos para poder llevar a cabo la cromatografa en capa fina?
7. Dibuja un esquema que muestre cmo se lleva a cabo la cromatografa en columna
abierta.
8. Dibuja un esquema que muestre cmo se lleva a cabo la cromatografa en capa fina.
9. Dibuja la estructura qumica del revelador sulfato crico amoniacal y explica qu reaccin
qumica se lleva a cabo en el revelado de los compuestos.