UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE TECÁMAC

SECRETARIA ACADÉMICA
DIVISIÓN QUÍMICO BIOLÓGICAS

ANÁLISIS INSTRUMENTAL

Profesor: Carlos Adulfo Esquinca Canseco

PRÁCTICA #3. MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

7IBT1

Integrantes:
Hernández Terrón Ana Karen
Luna Orozco Christopher Gregorio
Manzano Ramirez Karla Ivett
Noya Olalde Casandra Guadalupe
Varela Pineda Litzy Aislinn
 Introducción.
La cromatografía es un método químico de separación para la caracterización de
mezclas complejas cuyo objetivo es separar los distintos componentes, la cual tiene
aplicación en todas las ramas de la ciencia; en el principio de retención selectiva,
cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo
identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.

En esta práctica se elaborarán diferentes tipos de cromatografía como es la laminar

y la cromatografía en columna. De esta manera se lograrán observar las fases de
la cromatografía desde una perspectiva que ayude a entender de una gran manera
lo que es la cromatografía. La cromatografía describe un procedimiento químico en
el que se separa una mezcla en sus componentes individuales mediante una fase
móvil y una fase estacionaria. La fase estacionaria consta, según el procedimiento,
de materia sólida o un líquido, y la fase móvil de un líquido o gas. La cromatografía
usa diferentes procedimientos, que según el campo de aplicación tiene sus ventajas
y desventajas. Los procedimientos más importantes son la cromatografía en papel
cromatografía en capa fina, la cromatografía en columna y la cromatografía de
gases. Las aplicaciones prácticas de la cromatografía se encuentran por ejemplo en
la producción, donde se usa la cromatografía para la limpieza y aislamiento de
sustancias. Por otro lado, en la analítica química se usa la cromatografía para
separar mezclas en compuestos homogéneos. Finalmente se espera que la
siguiente practica ayude a identificar cada proceso para cada tipo de cromatografía
realizada y saber que especificaciones debe llevar cada una y una comparación a
cuáles son los resultados que deberían ser obtenidos a los que se obtuvieron dentro
de esta práctica.
 Objetivos.
Objetivo general

✓ Llevar a cabo la cromatografía laminar y cromatografía en columna para

conocer sus distintos funcionamientos y aplicaciones mediante la separación
de los componentes de una muestra.

Objetivos específicos

✓ Realizar a una cromatografía laminar por medio de cromatografía en papel

para saber si una muestra es apolar o polar.
✓ Realizar una cromatografía de intercambio iónico para lograr el
ablandamiento de la dureza total en una muestra de agua por medio de una
resina de intercambio catiónico.
✓ Realizar una cromatografía de adsorción para la eliminación de colorantes
de una muestra mediante el uso de una columna de carbón activado.
✓ Calcular el Rf de cada componente de la muestra de colorantes para saber
si una muestra es polar o apolar por medio de la cromatografía laminar.
 Marco Teórico.
La cromatografía es un método empleado en todas las ramas de la ciencia, permite
la separación, identificación y determinación de los componentes químicos en
mezclas complejas siendo, por tanto, procesos que abarcan varias técnicas de
separación basadas en propiedades físicas que, en interacción con sustancias o
mezclas de sustancias, permite descomponer una mezcla y analizar sus
constituyentes (Melina, A., Sampietro, Vattuone, 2010).

Todos los tipos de cromatografía depende de una serie de instrumentos,

compuestos y tecnología determinada, por lo que es importante conocer de los
compuestos básicos mencionados al momento de realizar una cromatografía,
siendo lo mas importantes:

• Fase estacionaria: Es una sustancia que se mantiene inmóvil mientras se

ejecuta la cromatografía.
• Fase móvil: Es la sustancia que se mueve durante la cromatografía. Puede ser
un líquido o un gas. La muestra que contiene el analito se administra en la fase
móvil.
• Analitos: Son las sustancias que se van a separar, cuantificar y/o identificar
utilizando la cromatografía, es decir, son las sustancias que se van a analizar.
• Muestra: Es la mezcla que se va a analizar. Puede estar constituida por uno o
varios analitos, y otros componentes que pueden no ser de interés, de los que
serán separados los analitos.
• Tiempo de retención: Es el tiempo que demora un analito en pasar desde la
columna o sistema por donde pase la fase móvil, hasta el detector (equipo que
puede dar una señal de detección utilizando alguna propiedad del analito).
• Selectividad: Es la capacidad de diferenciar cada componente en la mezcla.
• Eluyente: También se refiere a la fase móvil cuando sale de la columna
cromatográfica.

(Ondarse Álvarez D., 2021).

De acuerdo a Elsa Lundanes (2013) La clave de la separación en cromatografía es
la velocidad con la que se mueve cada sustancia dependiente de su afinidad relativa
por ambas fases. Los componentes que presentan mayor afinidad por la fase
estacionaria van a interaccionar por más tiempo con la misma por lo cual se retienen
con mayor facilidad, por otro lado, aquellos que tengan mayor afinidad por la fase
móvil van a retenerse menos, esto se debe a la polaridad de cada molécula
entendiéndose esta como una característica de cada enlace y se debe a la
diferencia de electronegatividad entre los átomos enlazados.

Existen varios tipos de cromatografía que varean de acuerdo a su naturaleza, fase

estacionaria y móvil, dentro de los que se encuentra:

Cromatografía en papel: conformada por una tira de papel filtro como fase
estacionaria a la que se le agrega una pequeña parte de la muestra y se sumerge
en la fase móvil que asciende por capilaridad, arrastrando consigo la muestra y
separándola por afinidad.

Cromatografía de intercambio iónico: Separa las moléculas con base a su carga

iónica neta, pudiendo ser de intercambio catiónico (retiene cationes con carga
positiva) o de intercambio aniónico (retiene aniones de carga negativa).

Cromatografía en capa fina: Basada en la preparación de una capa uniforme de un

absorbente sobre una placa de vidrio, la fase estacionaria será un componente polar
(silica gel) y el eluyente será menos polar para permitir la separación de los analitos
en la cual los más polares van a desplazarse con mayor facilidad.

Cromatografía en columna: La fase estacionaria se coloca dentro de una columna

que puede ser de vidrio o de acero inoxidable, mientras que la fase móvil puede ser
liquida o gaseosa. La muestra se coloca en el extremo superior de la columna y esta
baja mediante la fuerza de gravedad, puede clasificarse como sólido-líquido, liquido-
liquido, liquido-gas o solido-gas.

Cromatografía de afinidad: La separación de los analitos está en función de su

especificidad de fijación de ligando, los ligandos de afinidad son moléculas
poliméricas que sirven de soporte porque están unidas covalentemente sobre la
columna cromatografía o matriz inerte que debe de tener una estructura de poro
abierta y estabilidad en condiciones de cambio de pH, detergentes y agentes
disociantes, para así, retener y adsorber específicamente a las proteínas, la fase
estacionaria es sólida (Universidad Nacional Autónoma de México, 2007).
 Materiales y Reactivos.

Equipo, material o reactivo Imagen

Papel filtro No. 2

Capilar

Pinzas para bureta

Lámpara de alcohol

Vasos de precipitado

Agitador

Reloj de vidrio

Tren de tinción
Fibra de vidrio

Probeta de 100 mL

Pipeta de 5mL

Soporte universal

Espátula

Cámara cromatográfica

Piseta de agua destilada

Bureta de 50 mL

Carbón activado
Acetona

Resina de intercambio catiónico

Alcohol al 96%

Negro de Eriocromo T

Buffer de amonio para dureza de

pH 10

Hidróxido de Sodio 0.5N

Ácido clorhídrico 0.5N

 Metodología.

Inicio

1. Calentar un capilar a la flama.

2. Jalar por ambos extremos.

3. Mezclar en relación 1:1. Cristal violeta y

Safranina

4. Colocar solución a la altura de 1 cm sobre

una lámina de papel filtro.

5. Dejar secar.

6. Repetir 5 veces.

7. Adicionar fase móvil en la cámara de

corrimiento.

8. Colocar las láminas (inclinada) en la cámara

de corrimiento.

9. Efectuar el corrimiento.

10. Calcular el factor de retención.

Fin

Ilustración 1. Diagrama de flujo de Cromatografía Laminar.

 Inicio

1. Armar el soporte universal y las pinzas para

bureta.

2. Colocar una malla de fibra de vidrio en fondo

de la bureta.

3. Disolver la fase estacionaria correspondiente

en la fase móvil.

4. Verter poco a poco en la columna.

5. Dejar una altura libre de 8 cm y una altura de

solvente de 1 cm.

Fin

Ilustración 2. Diagrama de flujo del Empaquetamiento de cromatografía en columna.

 Inicio

1. Adicionar una gota de cristal violeta

en 10 mL de agua destilada.

2. Adicionar 5 mL de la solución colorida

en columna de carbón.

3. Agregar 15 mL de agua destilada.

4. Colectar el eluído en un vaso de pp.

5. Regenerar el carbón activado.

6. Adicionar 25 mL de NaOH 0.5 N

7. Adicionar 25 mL de HCl 0.5 N

inmediatamente.

8. Enjuagar con 100 mL de agua

destilada.

Fin

Ilustración 3. Diagrama de flujo de Cromatografía de Adsorción.

 Inicio

1. Colocar 25 mL de agua de la llave en un vaso de

precipitado.

2. Adicionar 0.5 mL de buffer para dureza pH 10.

3. Agregar una pizca de Negro de Ericromo T.

4. Adicionar a la columna de intercambio catiónico

25 mL de agua de la llave.

5. Añadir 10 mL de agua destilada.

6. Recolectar al final un volumen de 25 mL de

eluído.

7. Repetir paso 2 y 3 en el eluído.

8. Regenerar resina y dejar reposar 5 min. 25 mL de HCl 0.5N

9. Enjuagar con 100 mL de agua destilada.

10. verificar un pH de 6 a la salida de la columna.

Fin
Ilustración 4. Diagrama de flujo de Cromatografía de Intercambio Catiónico.
 Resultados
A) Cromatografía Laminar. Cromatografía en papel filtro.
En la cromatografía sobre papel, las interacciones del soluto con el papel hacen que
los compuestos se desplacen a velocidades diferentes. Principalmente se utiliza
para compuestos muy polares o polifuncionales, así como en muestras coloreadas,
como los pigmentos naturales.

Distancia
recorrida por la 6.2 cm
fase móvil. (Dslv)

Distancia
recorrida por el 3.1 cm
soluto. (Dslt)

Ilustración 5. Cromatografía en papel filtro. Separación de safranina y cristal violeta

Elaboración: Propia

La distancia recorrida por la fase móvil es de 7.2 cm mientras que la muestra tiene
un desplazamiento de 4.1 cm. Lo anterior se debe a la polaridad que puede
presentar lo que va a ser la muestra de tal manera que tiene menos afinidad con a
fase móvil.

Fórmula para calcular Retención.

𝐷𝑠𝑙𝑡 3.1 𝑐𝑚
𝑅𝑑 = 𝑅𝑑 = 𝑅𝑑 = 0.5
𝐷𝑠𝑙𝑣 6.2 𝑐𝑚
 B) Cromatografía en placa de silica.

4.5 cm Placa 1 4.1 cm

Placa 2

Distancia recorrida por la fase

móvil. (Dslv)

2.1 cm 1.7 cm

Distancia recorrida por el

soluto. (Dslt)

Ilustración 6. cromatografía en placa se sílice gel por duplicado.

Elaboración: Propia

La distancia recorrida por la fase móvil de la placa 1 es de es de 5.5 cm mientras

que la muestra tiene un desplazamiento de 3.1 cm. Mientras que en la placa 2, se
muestra un desplazamiento de la fase móvil de 5.1 cm, mientras que la muestra se
desplaza en aproximadamente 2.7 cm.

Fórmula para calcular Retención en Placa 1.

𝐷𝑠𝑙𝑡 2.1 𝑐𝑚
𝑅𝑑 = 𝑅𝑑 = 𝑅𝑑 = 0.466
𝐷𝑠𝑙𝑣 4.5 𝑐𝑚

Fórmula para calcular Retención en Placa 2.

𝐷𝑠𝑙𝑡 1.7 𝑐𝑚
𝑅𝑑 = 𝑅𝑑 = 𝑅𝑑 = 0.414
𝐷𝑠𝑙𝑣 4.1 𝑐𝑚
 C) Cromatografía de Adsorción.
En la Tabla 1. Se muestra una comparación del aspecto de una solución cristal
violeta somentida al procedimiento de una cromatografia de adsorción en una
columan de carbón activado.

En la primer columna se observa la solución pigmentada con un color britllante y

muy notorio a simple vista, mientras que en la segunda columna se observa que la
muestra al pasar por la columna y al ser recolectada en un vaso de precipitado ha
perdido completamente su coloración.

Tabla 1. cromatografía de adsorción. Muestra previa y posterior de la cromatografía en columna de carbón

activado.

Solución Cristal violeta

Antes Después

Elaboración: Propia

D) Cromatografía de Intercambio Catiónico.

La dureza es un parámetro en la calidad del agua, ya que representa la
concentración de iones de Calcio y Magnesio en el agua. Cuanto mayor sea esta
concentración decimos que el agua es más “dura” y cuanto menor sea esta, la
llamaremos “blanda”.

En la Tabla 2 se muestra la comparación de 2 pruebas de dureza en una muestra

de agua proveniente del grifo. En la prueba 1 al realizar la prueba de dureza se
observa una coloración violeta muy tenue (lila), lo que indica que tiene una dureza
media. Mientras que en la prueba 2 se observa que la muestra al pasar por la
columna de intercambio catiónico pierde la coloración. Sin embargo, al realizar
nuevamente la prueba de dureza en el volumen recolectado se observa una
coloración azul marino lo que indica la nulidad de la dureza en la muestra.

Tabla 2. Comparación de prueba de dureza en una misma muestra. En la imagen un se observa una prueba cualitativa;
En la imagen 2 se comprueba la nulidad de dureza de muestra recolectada de una cromatografía de adsorción.

Prueba cualitativa de la dureza

Prueba 1 Prueba 2

(Imagen de referencia)
Elaboración: Propia

Cuestionario.
1. Explique la diferencia de separación de los componentes de una muestra en
una cromatografía de intercambio iónico, exclusión molecular, adsorción y
partición.

Dentro de esta clase de cromatografía de intercambio iónico, podemos distinguir

entre las de intercambio catiónico y las de intercambio aniónico. En el primero, la
fase estacionaria contiene grupos funcionales con carga negativa, por eso retiene
cationes. Por lo contrario, en el intercambio aniónico los grupos funcionales de la
fase estacionaria tienen carga positiva, por lo que retiene aniones.

La base de este tipo de cromatografía es la de separar los componentes según su

tamaño molecular en estado disuelto. Las moléculas más grandes son las primeras
en eludirse. Esta técnica también se usa para caracterizar la distribución del peso
molecular de los polímeros.
En este tipo, la fase estacionaria es un sólido y la móvil es líquido y puede estar
formada por un solvente o una mezcla de ellos. Algunos componentes de la mezcla
se retendrán con mayor fuerza que otros para proceder a separar los componentes
de la muestra. En la cromatografía de partición la separación de los componentes
de la mezcla se produce por diferencias de polaridades entre la fase estacionaria y
la móvil, siendo las dos fases líquidas inmiscibles.

Existen dos tipos de cromatografía por partición según la polaridad de la fase

estacionaria y móvil; la fase normal, en que la fase estacionaria es polar y la móvil
es apolar, y la fase reversa, donde la estacionaria es polar y la fase móvil es polar.

2. ¿Cómo se lleva a cabo la adición de la muestra en una cromatografía de

frente móvil (análisis frontal), elusión y desplazamiento?

Tipo de interacción entre el soluto y la fase estacionaria. Entre varias posibilidades

la sorción es la más común. Este término se aplica a una clase en la cual un material
(en este caso el soluto) es atraído por otro (la fase estacionaria). Si el soluto está
confinado a la superficie de la fase estacionaria, el fenómeno se llama adsorción, y
el método cromatografía de adsorción. Son muchos los sólidos (adsorbentes) que
se han utilizado como fase estacionaria.

3. En la cromatografía laminar ¿Qué significado se le da al factor de Retención

Rf?

Los componentes separados por cromatografía deben poder ser visualizados de

alguna manera, hecho que no constituye un problema para sustancias coloreadas
como los pigmentos, pero cuando los componentes a separar no pueden ser
observados a simple vista es necesario recurrir a diversas herramientas de
detección, las cuales se denominan reveladores.

4. ¿Cuál es la función de la saturación de la fase estacionaria en una

cromatografía laminar?
Básicamente, un restrictor es un tubo capilar de unos 2 a 10 cm de longitud y un
diámetro interno menor al de la columna (típicamente 1/10 del diámetro), donde a
la salida el SF expande y pasa al estado gaseoso y se puede mantener
simultáneamente la presión en el interior de la columna.

A diferencia de la cromatografía de gases, en la SFC no se aumenta la velocidad

de elución modificando la temperatura, sino la presión del SF. El aumento de
presión, al aumentar la densidad, permite una mayor interacción analito-fase móvil
y disminuye los tiempos de elución. Se suele emplear en las eluciones una primera
etapa isobárica para luego aumentar la presión lineal o asintóticamente hasta el final
de la elución.

5. Defina los siguientes términos: fase estacionaria, soporte, fase móvil y eluído.
• La fase estacionaria: consiste en una capa delgada de un adsorbente
(como, por ejemplo, gel de sílice, alúmina o celulosa) depositada sobre
un soporte plano como una placa de vidrio, o una lámina de aluminio o de
plástico.
• Soporte: es la inmovilización del líquido que constituye la fase
estacionaria por medio de algún solido el cual ejerce como matriz de
retención frente al empuje mecánico de la fase móvil
• La fase móvil: determina la primera gran división de los métodos
cromatográficos. En esencia, algún tipo de fluido puede ser usado como
fase móvil. Históricamente, los líquidos fueron los primeros en ser usados
dando lugar a un amplio rango de métodos clasificados como
cromatografía líquida (CL). Los gases también pueden ser usados como
fase móvil, los métodos basados en este principio se clasifican como
cromatografía gaseosa (CG).
• Elución: proceso de extraer un soluto de la fase estacionaria.
Análisis de Resultados.

Conclusión.
 Referencias.
• Lunades E. (2013). ESTUDIO CROMATOGRÁFICO POR HPLC-DAD, EN
EXTRACTOS ACETONICOS DE LAS ESPECIES Gnaphalium Elegans,
Achyrocline Satureioides Y Achyrocline Bogotensis.
• Ondarse Álvarez D. (2021). Cromatografía. Concepto de.
https://concepto.de/cromatografia/
• Universidad Nacional Autónoma de México. (2007). Técnicas
cromatograficas. Obtenido de
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf
• Lunades E. (2013). ESTUDIO CROMATOGRÁFICO POR HPLC-DAD, EN
EXTRACTOS ACETONICOS DE LAS ESPECIES. Gnaphalium Elegans,
Achyrocline Satureioides Y Achyrocline Bogotensis.
• Universidad Nacional Autónoma de México. (2007). Técnicas cromatograficas.
Obtenido de
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf
• Mki, e. a. (2011). La adecuación de los métodos analíticos. GUIA EURACHEM, 60.
• Quattrocchi, O. A., de Andrizzi, S. A., & Laba, R. F. (1992). INTRODUCCION A LA
HPLC. Buenos Aires.
• Heftmann, E. (2004). Chromatography: Fundamentals and applications of
chromatography and related differential migration methods.