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Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de

Estudios Superiores Zaragoza

Ingeniería Química

Laboratorio de Ciencia Básica III

Luna Vázquez Alfonso

Cromatografía

 Cromatografía en capa fina

 Cromatografía en columna

Cabrera González Jorge Raúl

Domínguez Ordaz Andrea Araceli

García Lira Andrea Lizeth

Grupo: 4314

9 de abril del 2019

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Introducción.

La cromatografía es un método físico de separación basado en la diferencia de

distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una móvil y
otra estacionaria. Las moléculas de soluto de la mezcla son retenidas por la fase
estacionaria y arrastradas por la fase móvil, de manera que, si los componentes de la
mezcla presentan diferentes afinidades por alguna de las fases, sus velocidades medias de
avance a lo largo del sistema serán diferentes. La afinidad viene determinada por fuerzas
de tipo Van der Waals, puentes de hidrógeno o transferencia de carga. Los componentes
que sean fuertemente retenidos por la fase estacionaria se moverán más lentamente a lo
largo de dicha fase que aquellos que se unen débilmente. Como consecuencia de esta
diferencia de movilidad los componentes de la mezcla se separan en bandas discretas, que
pueden analizarse cualitativa o cuantitativamente mediante el uso de los detectores
adecuados.
La cromatografía es una técnica extremadamente versátil, que permite tanto la
separación de mezclas como la purificación de productos, la determinación del grado de
pureza de un compuesto, el seguimiento de reacciones o la detección y caracterización de
compuestos. Su principal ventaja frente a otros métodos de separación y purificación
consiste en que ésta técnica puede aplicarse a cantidades muy pequeñas de producto.

En la presente práctica se estudiarán dos tipos de cromatografía líquida:

Cromatografía de adsorción en columna (CC)

Cromatografía de adsorción en capa fina (CCF)

En ambas técnicas la fase móvil está constituida por un líquido, la fase estacionaria por un
sólido y el mecanismo de separación se basa en la diferencia de adsorción de los
componentes de la mezcla en la superficie activa de la fase estacionaria. En la primera
(CC) la fase estacionaria se sitúa en un tubo (columna), en la segunda (CCF) se deposita
sobre una superficie abierta plana. La cromatografía líquida suele emplearse para
compuestos de poca volatilidad, tales como moléculas grandes y altamente polares, a los
que no es aplicable la cromatografía de gases.
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Objetivo General
Conocer y comprender las técnicas de cromatografía en capa fina y en columna, sus
características y los factores que en ella intervienen.
Objetivos Particulares
• Observar la relación que existe entre la polaridad de las sustancias que se analizan
y la de los eluyentes utilizados.
• Emplear la técnica de cromatografía en capa fina como criterio de pureza e
identificación de sustancias.
• Emplear la técnica de cromatografía en columna para la separación de un
compuesto orgánico.
• A través de cromatografía en capa fina controlar la cromatografía en columna.
Hipótesis
Con base a la diferencia de polaridades, un eluyente polar será el que arrastre a la clorofila
y viceversa el menos polar es que mueva a la Xantofila.

Marco Teórico
Las separaciones cromatografías dependen de la diferencia entre los coeficientes de
partición de los componentes entre dos fases inmiscibles. Una, la fase activa, progresa en
relación con la otra, la fase estacionaria, y transporta las substancias que se están
separando. El coeficiente de partición K de una substancia en un sistema de dos fases
está dado por:
𝐾 = 𝐶𝑠/𝐶𝑚

donde Cs = concentración de la substancia en la fase estacionaria.

Cm = concentración de la substancia en la fase activa.

A mayor coeficiente de partición de una sustancia, mayor es su concentración en la fase

estacionaria y más lento su avance a lo largo del sistema cromatográfico.
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Clasificación

Además, de acuerdo con el mecanismo de retención, la cromatografía se puede clasificar

en los siguientes tipos:
• de adsorción (normal, de fase reversa)
• de partición liquido-liquido
• de intercambio iónico
• de permeación sobre gel

Cromatografía de adsorción
Partición entre las fases liquida activa y la sólida estacionaria. El resultado de tales
separaciones depende principalmente de la elección de las fases adecuadas, las cuales
pueden dividirse en:
a) Fases normales
• Fase estacionaria: polar (gel del silice, a1úmina, celulosa, etc.).
• Fase activa: no polar (hexano-éter-metanol).

b) Fases reversas
• Fase estacionaria: no-polar (geles de sílice modificados, nylon, poliestireno, etc.).
• Fase activa: polar (metanol/agua/acetonitrilo).
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Fases estacionarias
Gel de sílice
Es la fase estacionaria más comúnmente utilizada por los químicos orgánicos de
laboratorio para separar mezclas. El gel de sílice es un ácido silícico altamente poroso,
deshidratado y pulverizado a un tamaño de partícula de 0.04-0.2 mm con un diámetro de
poro de 50-100 Á, y una superficie de 200-400 m2 por gramo. Los grupos-SIOH sobre la
superficie proporcionan al gel de sílice un carácter débilmente ácido. Se necesita tener
cuidado con las substancias que son 1ábiles a los ácidos.

Alumina
Es algo alcalina (PH 9.5). La a1úmina neutra se prepara mediante la neutralización hasta
un PH de 7.0, seguida de una activación y puede ser desactivada mediante la adición de
agua.

• Preparación: Añadir la cantidad de agua que se calcule, agitar hasta que se disuelvan
todos los terrones y grumos y dejar reposar durante 24 horas aproximadamente,
en un recipiente cerrado herméticamente.

La mayor parte de las mezclas de disolventes pueden usarse como eluyentes.

Utilizar solamente disolventes de pureza conocida; por lo regular deben ser recién
destilados (los éteres forman peróxidos, el cloroformo puede contener alcohol 0 fosgeno,
los disolventes absorben humedad, etc.).

Efecto de la temperatura
A menor temperatura las substancias se adsorben más fuertemente en la fase
estacionaria: la cromatografía se lleva a cabo en un área sin corrientes de aire, pero no
demasiado caliente. En los casos propicios, las columnas frías pueden dar una mejor
separación de compuestos termolábiles.
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Cromatografía en capa fina: Técnicas Analíticas y

Preparativas
a) Usos
• Para comprobar la pureza.
• En pruebas preliminares antes de la separación.
• En la comparación cualitativa con sustancias conocidas.
• Para llevar el control en reacciones.
b) Procedimiento
1) Corte unas placas de vidrio comercial (de 20 x 20 cm) con un cortador de vidrio (de
preferencia de rueda, no de diamante).
2) Elija la fase estacionaria: alúmina o gel de sílice, de aproximadamente 0.2 mm de
grosor.
3) Aplicación de la substancia: se diluye la substancia en el disolvente menos polar y
con el P.e. más bajo, hasta obtener una solución al 1%, se aplican
aproximadamente 2 ml a la placa, en forma de mancha y se deja hasta que el
disolvente se evapore completamente.
4) Desarrollo del cromatograma: una porción de la placa se sumerge en el eluyente y
se permite que se desarrolle. Cuando el frente del disolvente ya ha avanzado una
distancia conveniente, se rema la placa (véase la figura) se marca el frente del
disolvente y se deja secar.
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5) Identificación: las manchas de color son, por supuesto, inmediatamente visibles;

las incoloras pueden revelarse mediante:

• Luz UV: si la substancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una fase
estacionaria impregnada con un indicador fluorescente.
• La introducción de]a placa en vapores de yodo.
• El roció con una solución de agua H2SO4 a una concentración 1:1 (dentro de un
compartimiento especialmente protegido y bajo una campana de extracción de
gases), Después caliente intensamente, por ejemplo, con un soplete hasta
carbonizar los compuestos.
• Rociarlas con reactivos colorantes convenientes.

c) Registro
Marque el cromatograma usando papel carbón. Señale las manchas, posición de inicio y
frente del disolvente. Indique el tipo de placa, eluyente y la técnica de desarrollo.

𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑎𝑛𝑐ℎ𝑎 𝑎𝑙 𝑝𝑢𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑜 𝑅𝑓

=
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑓𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑙𝑢𝑦𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑎𝑙 𝑝𝑢𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑜

El valor dcl Rf depende de las condiciones en las cuales se corre el cromatograma (tipo de
placa, eluyente, asf como las condiciones de la placa, temperatura, vapor de saturación,
etc.). Tiene una reproducibilidad de aproximadamente +-20%, por lo que es mejor correr
el compuesto de referencia probable en] a misma placa.

d) Corrimientos múltiples
Algunas veces es útil volver a correr una placa, después que se ha secado, hasta que el
frente del disolvente alcance la misma posición del frente del disolvente en el corrimiento
anterior. Un corrimiento n-veces repetido es efectivamente el mismo, como si se corriera
un cromatograma la longitud n-veces y proporciona una mejor resolución entre manchas
muy cercanas de Rf pequeño.
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Cromatografía en
columna
a) Usos
En la separación de grandes cantidades de material (por ejemplo, >100 mg).
b) Procedimiento
1) Por medio de la CCF se optimiza el sistema (adsorbente, eluyente) para la
separación.
2) Cantidad de adsorbente que se requiere: de 30 a 100 veces el peso de la muestra
(50 veces es un buen promedio) ·
3) Dimensiones de la columna: el adsorbente se debe empacar en ésta en una
proporción de altura/diámetro de 10:1; para estimar la cantidad de adsorbente en
relación con el diámetro de la columna.
4) Sujete firmemente la columna en forma vertical.
5) Llene la columna con el eluyente (O, si se utiliza una mezcla de disolventes use el
componente menos polar).
6) Comprima firmemente un pedazo de algodón en el fondo de la columna con una
varilla de vidrio y cúbrala con una capa de arena de mar bien limpia
(aproximadamente 0.5-1 cm)
7) Vacié el adsorbente previamente pesado:
• Alúmina: en forma de un fluido delgado, mientras la columna se golpea
suavemente con un pedazo de manguera de hule.
• Gel de sílice: como una papilla en el disolvente.
8) Permita que el disolvente corra (golpeando suavemente la columna) hasta que
quede aproximadamente 1 mm por arriba de la parte superior del adsorbente.
9) Disuelva]a substancia en la cantidad mínima de disolvente (que no sea más polar
que el eluyente) y aplíquelo con cuidado y uniformemente en la parte superior de
la columna (con la llave cerrada). Después, abra la llave y corra el disolvente hasta
que quede nuevamente una capa de 1mm por arriba del adsorbente, Repita la
misma operación varias veces utilizando cantidades pequeñas de eluyente.
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10) Llene cuidadosamente con el eluyente el volumen de la columna que queda por
arriba del adsorbente, para proteger la superficie de éste, se puede depositar una
capa de arena de mar de 1 cm de espesor en la parte superior de la columna.
11) Abra la llave y colecte el eluyente en fracciones (fracciones de X ml por X g de
adsorbente).
12) Velocidad del flujo: las velocidades altas proporcionan malas separaciones. Una
regla empírica indica de 3 a 4 ml por minuto en una columna de 40 cm de altura.
13) Evapore cada Fracción, pese el residuo e incluya la información en el registro.
14) Las fracciones que contienen los mismos componentes (corrobore por medio de
CCF) pueden combinarse, purificarse (por cristalización, destilación)y
posteriormente caracterizarse.
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c) Eluyentes más comunes (para las columnas de gel de sílice y alúmina).

La elección del eluyente depende de la polaridad de las substancias que van a ser
separadas, frecuentemente es mezclas de disolventes. En general, se empieza con éter de
petróleo, diclorometano, acetato de etilo y mezclas de éstos. El diclorometano y el
acetato de etilo también son buenos disolventes para muchas sustancias.
La cantidad mínima utilizada de una mezcla de disolventes debe ser tal, que el frente del
disolvente alcance el final de la columna antes de que se aplique una mezcla de
composición diferente

Consejos utiles
• No permita que la columna se seque.
• La temperatura en el entorno de la columna debe mantenerse aproximadamente
constante.
• Una corrida cromatográfica debe llevarse a cabo sin interrupción.
• Cuando se use alúmina, no utilizar acetona como eluyente, ya que se pueden
encontrar productos de condensación entre los constituyentes principales del
producto de la elución.
• Cuando se utilizan eluyentes con un punto de ebullición bajo (éter, penano,
diclorometano), especialmente cuando se cambian los disolventes, a menudo se
forman burbujas en la columna (acanalamiento) y éstas, por lo general, evitan que
se obtenga una separación satisfactoria. El uso de columnas en frio puede prevenir
este acanalamiento.

Metodología.

Extracción del pigmento.

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Lavar y cortar la Machacar la Agregar poco a

espinaca espinaca en el poco los
finamente mortero disolventes.

Filtrar por 10 ml Metanol

Macerar por 30
decantación. min. 15 ml Acetato de etilo
25 ml Hexano

Lavar con 25 ml Secar con 1 g de

de salmuera Na2 SO4

Cromatografía en capa fina.

Sumergir las placas Previamente tener

Preparar la papilla en la sílice, retirar las cámaras de
con gel sílice y excedentes y elusión con papel
Metanol. meter a secar en la filtro y con .5 ml de
estufa para disolvente.
activarlas.

Retirar la placa Colocar la placa Colocar un

antes de que el
eluyente llegue a
la terminación de
la sílice.
con la muestra en pequeño punto de
la cámara de pigmento en la
elusión y dejar que placa ya activada
corra el eluyente. dejando 1 cm de
separación.

Con la CCF determinamos los dos disolventes que nos ayudaban a arrastrar mejor los
pigmentos, estos los utilizaríamos en la columna (Acetato de etilo y Cloroformo).
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Cromatografía en columna.

Agregar
Agregar: Algodón, cloroformo en
Montar la
Arena (1 cm), Gel intervalos de 1
columna en una
sílice (10 cm), ml hasta
bureta de 25 ml.
Arena, 1 ml del arrastrar todos
pigmento. los pigmentos
amarillos.

Agregar poco a
poco Acetato de
Depositar los Depositar el
etilo hasta
pigmentos verdes pimento amarillo
arrastrar los
en un tubo de en un tubo de
pigmentos
ensaye. ensaye.
verdes.

• Resultados y discusión:
Polaridad.

Como analito utilizamos los pimientos verdes obtenidos durante la maceración (más o
menos 10ml de pigmentos verdes), y al realizar la CCF, obtuvimos los siguientes
resultados:

Hexano

Tetracloruro
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Cloruro de metilo

Cloroformo

Acetato de etilo

Acetona

Metanol

Fig. 1.-Tabla de resultados de CCF.

Como se puede observar en la tabla 1, determinamos que la clorofila es más afín a una
sustancia polar, debido a que tuvo un mayor recorrido cundo entro en contacto con:
acetona, metanol y acetato de etilo, que son disolventes polares.

Mientras que la xantofila tiende a ser más afín a los compuestos no polares o menos
polares ya que de igual manera que la clorofila tubo un mayor recorrido cuanto el
eluyente resulta ser un compuesto no polar (Cloroformo y cloruro de metilo).

Con base a lo anterior se volvió a repetir la CCF pero ahora con una combinación de
eluyentes:
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Acetato de etilo
+
Cloruro de metilo

Acetona
+
Cloroformo

Cloroformo
+
Acetato de etilo

Fig. 2.-Tabla de resultados de CCF combinación de eluyentes.

De acuerdo con los resultados obtenidos de la tabla 2, determinamos que la mejor

combinación de eluyentes para trabajar en Cromatografía en columna fue la muestra que
contenía Cloroformo con acetato de etilo, ya que es en donde se muestra mejor
separación de los componentes del pigmento. Después de haber determinado el mejor
eluyente se realizó la cromatografía en columna, como lo muestra en la siguiente imagen.

Primero se agregó cloroformo ya que este es un eluyente poco polar, y debido a esto lo
primero que obtuvimos fue la xantofila, una vez que se desplazó la mayor cantidad de
amarillo (xantofila) procedimos a colocar el acetato de etilo el cual es un compuesto polar
o más polar, esto hizo que desplazara a la clorofila. Pero debido a que dejo de moverse el
analito en la columna el equipo decido cambiar de eluyente a metanol el cual es más polar
que el acetato de etilo, una vez que termino la cromatografía determinamos los
volúmenes de cada muestra obtenida, los cuales fueron:
Tubo 1 5ml
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Tubo 2 2ml
Tubo 3 2ml
Tubo 4 1ml
Tubo 5 7ml

De acuerdo a la tabla anterior se obtuvo

una mayor cantidad de clorofila, pero
esto no quiere decir que en nuestro
analito tenga tales cantidades de
clorofila y xantofila, para poder determinar eso, sería necesario calcular sus respectivas
concentraciones.

Conclusiones:

Se llevó a cabo una práctica exitosa debido a que logramos separar e identificar la clorofila
de la Xantofila, de acuerdo con sus respectivos colores, amarillo y verde, así mismo
pudimos determinar si se trataban de una sustancia polar o no polar, así mismo pudimos
observar algunos detalles que pueden mejorar la práctica, por ejemplo:

Evitar que el adsorbente se seque dentro de la columna, ya que puede que afecte la
separación, además como lo podemos observar en la tabla 2, en donde la placa
cromatográfica no se ve muy bien ya que al agregarle el gel de sílice no lo habíamos
movido y esto pudo ser la causa de ese error, también algo que debemos tomar muy en
cuenta es que al agregar el eluyente dentro de la columna debe ser continuo y uniforme y
que aparte de que se seca puede que se creen burbujas.

Bibliografía

• Brewster R. Q., van der Wert C. A., McEwen W. E., Curso Práctico de Química Orgánica,
2 ed., Madrid, Alhambra, 1979.

• Fessenden R. J., Fessenden J. S., Técnicas en el laboratorio de Orgánica, 3 ed.,

Alhambra, 2001.

• Vogel A. I., Practicas de Quimia Orgánica, 5 ed., Longman Scientific & Technical,
Londres, 1989.
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