DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA SALUD

Sección Genética Humana, Microbiología y Bioquímica Clínica

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

“Práctica No. 4. Recuento de S. aureus en

alimentos por agar y petrifilm.”

Loja - Ecuador

2017
 Departamento de Ciencias de la Salud Código: LAB_ANAT_V04

Laboratorio de Microbiología de Alimentos Válido desde: Octubre 2017

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ÍNDICE

I. INTRODUCCIÓN 3

II. OBJETIVOS. 3

III. MATERIALES Y EQUIPOS 3

IV. METODOLOGÍA (PROCEDIMIENTO) 4

V. RESULTADOS OBTENIDOS 5

VI. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 5

VII BIBLIOGRAFÍA 5

VIII ANEXO 7

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PRÁCTICA No. 4. Recuento de S. aureus en alimentos por agar y petrifilm

I INTRODUCCIÓN
1.1 Recuento de Staphylococus aureus en alimentos por agar y petrifilm

Es una bacteria gram positiva, catalasa y coagulasa positiva. Staphylococcus

aureus es un microorganismo que puede llegar a los alimentos (infecciones
piógenas) o del hombre (nariz, boca o piel de individuos enfermos o
asintomáticos). Por lo que su presencia y número dá un indicio de la calidad
microbiológica y manejo sanitario de los alimentos.

Entre los alimentos comúnmente asociados con intoxicaciones estafilocócicas se

encuentran las carnes (res, cerdo, pollo), los productos cárnicos (jamón, salami,
salchichas, etc), ensaladas (jamón, pollo, papa), leche y productos lácteos (queso).

La toxina se genera con mayor facilidad en alimentos procesados, donde se ha

eliminado gran parte de la flora propia del alimento y S. aureus puede multiplicarse
libremente produciendo la enterotoxina.

Método rápido petrifilm

La placa de Petrifilm Staph Express para recuento de Staphylococcus aureus es

un sistema de medio de cultivo listo para la muestra que contiene un agente
gelificante soluble en agua fría. El medio modificado cromogénico Baird Parker es
la placa es selectivo y diferencial para el Estafilococos. Las colonias rojo violeta en
la placa son S. Aureus. Cuando solamente se aprecian colonias rojo-violeta.

II OBJETIVOS
1. Determinar el contaje de S. aureus en productos alimenticios.
2. Diferenciar las colonias de S. aureus por los dos métodos.
3. Interpretar los resultados obtenidos con una norma nacional o internacional.

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III MATERIALES Y EQUIPOS

- Butterfield’s buffered phosphate diluent: preparación de la solución stock: disolver

34,0 g de KH2PO4 en 500 ml de agua, se ajusta el pH a 7,2 con aproximadamente
1,75 ml de NaOH 1M, y diluir a 1 Lt. Mantener en refrigeración. Diluyente: diluir
1,25 ml de la solución stock a 1 lt con agua. Prepare blancos de dilución con esta
solución. Autoclavar 15 minutos a 121 ºC.
- Medio de cultivo Agar Baird Parker 140 ml.
- Placas de Staphylococcus aureus (4 unidades)
- Discos 3M para confirmación de S. aureus (2 unidades)
- 3 pipetas de 10 ml
- 3 pipetas de 1 ml
- 1 Incubador
- 1 mechero bunsen
- 1 pera de succión
- 3 erlenmeyers de 250 ml
- 1 erlenmeyer de 500 ml
- 1 balón de 1000 ml
- Contador de colonias
- Termómetro NIST
- 1 varilla de agitación
- Papel craf
- Algodón
- Papel aluminio
- Alcohol.
- 1 autoclave para esterilización
IV MÉTODOLOGÍA (PROCEDIMIENTO)
AGAR BAIRD PARKER

 Limpiar la mesa de trabajo con alcohol y luego prender el mechero bunsen.

 Limpiar el envase del producto con un algodón empapado en alcohol.
 Abrir el envase y tomar asépticamente 10 g o ml de la muestra y poner en
90 ml de agua buferada estéril , agitar 30 veces esta será la dilución 10 -1 ,
tomar 1 ml de esta solución y poner en 9 ml de agua buferada estéril esta
será la dilución 10-2.
 Previamente poner el agar templado a 45ºC los suplementos (yema de
huevo telurito) y poner aproximadamente de 15 a 20 mL en 7 cajas
estériles y dejar solidificar.
 Utilizar 3 cajas para la primera dilución, 3 cajas para la segunda dilución y
1 para el blanco.

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 Poner 1 ml (0,3 mL, 0,3 mL y 0,4 mL) repartido en las tres cajas de la
primera dilución, de la misma manera para la segunda dilución
 Con una aza de vidrio esparcir el inóculo en las cajas petri utilizar una aza
de vidrio para cada dilución.
 Colocar la caja petri en forma invertida en la incubadora a 35 º C por 48
horas.
 Realizar el conteo entre 15-150 colonias.
 Las colonias presuntivas se deberán confirmar con las pruebas de catalasa
y coagulasa.

Recuperación de la cepa

- Con ayuda del cuadro, determinar el número de colonias a evaluar,

tomando en cuenta el número de colonias típicas de S. aureus obtenidas
en el agar Baird-Parker. Así mismo seleccionar las colonias para realizar
las pruebas cuantitativas y cualitativas; dentro de estas últimas están
comprendidas la coagulasa y la termonucleasa.

- Reinocular cada una de las colonias aisladas y seleccionadas, que son

características de este microorganismo, utilizando asa bacteriológica
recta estéril, en tubos que contengan 5ml de caldo infusión cerebro
corazón. Incubar a 35°C durante 24 h.

Pruebas bioquímicas

Realizar la confirmación bioquímica del microorganismo, haciendo las

pruebas de presencia de las enzimas: coagulasa y termonucleasa.

- Prueba de la presencia de la enzima coagulasa.

1. Con una pipeta estéril, tomar 0.1 ml de la suspensión del

microorganismo que desarrolló en el caldo infusión cerebro corazón,
adicionar 0.3 ml de plasma de conejo. Dicho plasma previamente
diluido volumen a volumen con solución salina estéril.
2. Incubar en baño María o en incubadora, entre 35 y 37°C y observar
durante 6 h. en intervalos de 1 hora; en caso de no presentarse

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formación de coágulo, prolongar el período de observación hasta
por 24 h.
3. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo, tomar 0.5
ml de plasma reconstituido y depositarlo en un tubo de 13 X 100
mm, posteriormente añadir una gota de cloruro de calcio al 5%; se
debe formar un coágulo entre 10 a 15 segundos.

PLACAS PETRIFILM

 Ponga la placa sobre una superficie plana e inocule 1 ml de cada dilución

en el centro de la placa, baje suavemente la tapa, distribuya esta
suspensión con el disco, no hacer demasiada presión, para evitar que
entren burbujas. Dejar solidificar 1 minuto. Esparza la muestra en cada
placa individual antes de inocular la siguiente. Esto es importante puesto
que el gel en la placa Staph express Petrifilm se forma rápidamente.
 Incubar las placas en posición horizontal para permitir que el gel se
solidifique, a 35 +/- 1 ºC por 24 +/- 2 horas
 Si no hay colonias presentes después de 24 +/- 2 horas de incubación, el
recuento es de cero y la prueba se considera terminada.
 Cuente las colonias rojo-violetas como S. Aureus. Las placas petrifilm se
pueden contar en un contador de colonias corriente o con una lupa
iluminada.
 Si se encuentran presentes otros colores de colonias además del rojo
violeta utilice un disco staph Express Petrifilm, remueva el disco de su
empaque individual agarrando la pestaña. Levante la película superior de la
placa Petrifilm y coloque el disco en la cavidad de la placa. Baje la película
superior. Aplique presión al área del disco, incluyendo los bordes del
mismo deslizando un dedo firmemente a lo largo de la película superior.
Esto garantizará un contacto uniforme del disco del gel y eliminará
cualquier burbuja de aire.
 Incube las placas con los discos insertados en pilas de no más de 20
placas por 1 a 3 horas a 35 ºC +/- 1 ºC.
 Cuente todas las zonas rosadas sea o no que se encuentre presente una
colonia. El S. Aureus (y posiblemente el S.hycus y el S. Intermedius)
aparecen como zonas rosadas.
 Si desea una mayor identificación, levante la película superior y recoja la
colonia del gel.

V RESULTADOS OBTENIDOS
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Calcular las UFC/g de alimentos para cada uno de los métodos de ensayo,
recuento de Staphylococcus aureus y evaluar los resultados frente a una norma
técnica de referencia.
Recuento en placas petrifilm

Para diferenciar las colonias de Staphylococcus aureus en las placas petrifilm,

busque algunas de las siguientes características típicas del cultivo: colonias de
color rojo violeta. Luego de haber colocado el disco Staph Express las colonias
presentes forman un halo de color rosa, descartar como Staphylococcus aureus
las colonias que no presenten este halo de color rosa.

Para calcular el contaje de S. aureus, multiplicar el número total de colonias de

Staphylococcus aureus por placa por el respectivo factor de dilución.
Cuando se hace el contaje en placas por duplicado en diluciones consecutivas,
calcule el número promedio de colonias de cada dilución antes de determinar el
contaje total de lavaduras y mohos.

Se puede hacer contajes estimados en placas con más de 150 colonias y puede
ser reportado como contaje estimado. Al realizar dichos contajes determinar el
contaje promedio / 1cm 2 y multiplicar por 30 (área de crecimiento circular de 30
cm2.

Staphylococcus aureus: = Número de colonias X Inverso de la dilución

Los resultados se expresan en UFC/g o ml de alimento y en forma exponencial.

Agar Baird Parker

 Para diferenciar las colonias de S. aureus busque colonias negras con un halo
alrededor. Cuente las colonias de las tres cajas este será el total de la primera
dilución y el de la segunda.
 Para calcular el contaje de S. aureus, multiplicar el número total de colonias de S.
aureus por placa por el respectivo factor de dilución.
 Recuento de S. aureus: No de colonias x factor de dilución.
 Las unidades son ufc/ml (Unidad formadora de colonia por ml de muestra)

Eliminar los residuos en autoclave a 121°C por 15 minutos a 15 PSI, controlar con cinta
de esterilización para comprobar tiempo, temperatura y presión. Una vez destruidos poner
en la funda roja para desechar.
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Promedio N ° de colonias
ufc=
dilución x volumen inoculado

VI CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Las conclusiones y recomendaciones son referentes a la práctica realizada.

VII. BIBLIOGRAFÍA

- Bennett, R. y Lancette, G. 2001. Bacteriological Analytical Manual.

Staphylococcus aureus. Ch. 12.
- AOAC (Official Methods of Analysis. Microbiological Methods). 2005. AOAC
2001.05. Método rápido PetrifilmTM para el recuento Staphylococcus aureus en
alimentos. Ch. 17, Ed. 18.
- Guía de interpretación. 3MTM PetrifilmTM
- Bibek, R; Arun, B. (2008). Fundamentos de microbiología de los alimentos.
Editorial McGraw Hill.

VIII. ANEXO

FIGURAS EXPLICATIVAS

8. 1 Diagrama de siembra para recuento de Staphylococcos aureus

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Figura de siembra en placas petrifilm

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8. 3 Figuras de colonias de Staphylococcus aureus

Prueba presuntiva Prueba confirmatoria

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8.4 Figuras de recuento de Stafilococos aureus en agar baird parker

8.5 Prueba de coagulasa

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