PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA
UNIVERSIDAD DE CALDAS

GUÍAS DE
LABORATORIO
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS
María Marcela Martínez Miranda
Bacterióloga y laboratorista clínico
M.Sc. Ciencias Microbiología
PhD. Ciencias Biomédicas

2022-2

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[CARRERA 35 # 60–160 SEDE SANCANCIO BLOQUE B PISO 4TEL.:8781587]
Práctica 9. Determinación de esporas de Clostridium sulfito reductor (ECSR)

I. Introducción

El grupo bacteriano sulfito reductor está integrado por gérmenes pertenecientes al

género Clostridium, que tienen la propiedad de reducir el ion sulfito a sulfuro en
presencia del citrato férrico u otra sal de metales pesados, formando colonias negras
características. Se caracterizan por tener una morfología bacilar, ser Gram positivos,
anaerobios estrictos o facultativos y formar esporas (Acosta y González, 1995, p 298).
Las bacterias del género Clostridium son ubicuas en el medio ambiente, y sus esporas se
encuentran habitualmente en el suelo, polvo, sedimentos, medio acuático, vegetación
en descomposición y en el tracto digestivo de los animales, incluido el hombre. En
consecuencia, pueden transmitirse a una amplia gama de alimentos, tanto crudos, como
parcialmente tratados tales como las carnes curadas (principalmente embutidos),
conservas, fermentados, ahumados, productos envasados al vacío, semiconservas
vegetales y las especias.

Dentro de este grupo existen dos especies importantes para la industria alimentaria por
su capacidad de producir toxi-infecciones: Cl. perfringens y Cl. botulinum. La enfermedad
alimentaria causada por Cl. perfringens puede ocurrir cuando los alimentos como la
carne se cocinan sin el mantenimiento del calentamiento o la refrigeración adecuados
antes de servir. Los síntomas, que incluyen calambres abdominales intensos y diarrea,
se han atribuido a una enterotoxina producida durante la esporulación del organismo
en el intestino (Rhodehamel & Harmon, 2001).

La intoxicación causada por Cl. botulinum o botulismo alimentario se presenta tras un

período de incubación de 24 horas a 4 días después de la absorción de la toxina, varía
desde formas leves que no requieren atención médica hasta un cuadro grave que puede
provocar la muerte en 24 horas por una insuficiencia respiratoria. Los síntomas
comienzan con afectación de los nervios craneales, agravándose progresivamente la
debilidad motora. Puede haber náuseas, vómitos y dolor abdominal antes o después del
comienzo de la parálisis, además de mareos, visión borrosa y boca seca (Pérez-Pérez,
2003).

El recuento de Clostridium sulfito reductor se suele usar para evaluar la calidad higiénica
del agua y productos de origen animal y vegetal, y se basa en el recuento de colonias de
células vegetativas o sus esporas con capacidad sulfito-reductora, desarrolladas en un
medio de cultivo específico e incubadas en condiciones anaeróbicas durante un tiempo
y temperatura determinadas.

El propósito de esta práctica de laboratorio es brindar a los estudiantes las herramientas

necesarias para determinar el número de esporas de Clostridium sulfito reductor (ECSR)
a partir de una muestra de alimento por métodos de siembra profunda en tubo.

II. Insumos, materiales y equipos

- Muestra de alimento: leche en polvo, mermelada, salsa de tomate, agua saborizada,

productos cárnicos procesados no enlatados, etc.

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- Agar sulfito polimixina-sulfadiazina (SPS).
- Agua peptonada tamponada 0,1% (diluyente).
- Parafina estéril o ágar-ágar.
- Pipetas de 10 mL.
- Pipetas de 1 mL.
- Gradillas para tubos.
- Frascos con 90 mL de agua peptonada tamponada 1%.
- Tubos de ensayo con 3 mL de parafina o agar-agar estéril.
- Tubos de ensayo vacíos estériles.
- Tubos de ensayo con 10 mL de agar SPS fundido.
- Tubos de ensayo con 9 mL de diluyente.
- Recipiente con agua con hielo.
- Balanza.
- Licuadora.
- Agitador excéntrico.
- Baño de agua con temperatura constante a 80°C.
- Baño de agua con temperatura constante a 45°C.
- Incubadora regulada a 37°C.
- Cámara de anaerobiosis.

III. Procedimiento

1. A partir de la muestra seleccionada para la práctica, pesar 10 g o medir 10 mL y

depositarlos en un frasco con 90 mL de diluyente.

2. Homogenizar en frasco de licuadora durante 1 – 2 min.

3. Preparas las diluciones decimales sucesivas necesarias.

4. Escoger dos diluciones consecutivas y llevar los tubos a un baño de agua a 80°C
durante 10 min, seguido de un enfriamiento rápido en agua con hielo.

5. Tomar 4 tubos con agar SPS fundido y proceder a la inoculación profunda de las dos
diluciones consecutivas seleccionadas por duplicado, de la siguiente manera:

• Sembrar 1 mL de cada dilución en un tubo con 10 mL de agar SPS fundido a 45°C.

• Con mucho cuidado se va depositando la muestra, de abajo hacían arriba en

forma de zigzag, procurando que el total de ésta quede en el agar y no se airee.

• Rápidamente pasar el tubo de agar SPS a la llave del agua para enfriarlo y dejar
que se solidifique.

• Una vez sólido, añadir una capa de parafina o agar-agar estéril de unos 3 cm de
espesor para conseguir condiciones de anaerobiosis.

• Este procedimiento se repite con los 3 tubos restantes.

6. Una vez inoculados todos los tubos, incubar a 37°C durante 24 a 48 h.

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7. Transcurrido el período de incubación, contar en los tubos que contengan menos de
50 colonias negras rodeadas de una zona negra debido a la formación de sulfuro
ferroso.

8. Calcular los resultados usando la siguiente fórmula:

𝐶×𝐷
𝑁=
𝑉
9. Registrar los resultados de ECSR como UFC por gramo o mililitro en el Anexo P9.

Bibliografía

ACOSTA, E y GONZALEZ ORTIZ, L (1995). Fundamentos para el análisis microbiológico de

los alimentos. Barranquilla.

AYCACHI, R. Práctica No. 14. Aislamiento e Identificación de Clostridium perfringens.

Escuela Profesional de Biología. Universidad de Nacional Pedro Ruiz Gallo.

INTERNATIONAL ORGANIZATION OF STANDARIZATION (2003). Método horizontal para

el recuento de bacterias sulfito reductoras que crecen en anaerobiosis. ISO 15213

INTERNATIONAL ORGANIZATION OF STANDARIZATION (2004). Método horizontal para

la enumeración de Clostridium perfringens. Técnica de recuento de colonias. ISO 7937.

MARTINEZ, K. Guía Práctica No. 6. Recuento de Clostridium sulfito reductor-Esterilidad

Comercial. Universidad de Santander.

PASCUAL, M.R y CALDERÓN, V. (1999) Microbiología alimentaria. Metodología analítica

para alimentos y bebidas. 2° Ed. Ediciones Días de Santos.

PEREZ-PEREZ, H, Rubio C, Pozuelo MR, Revert C y Hardisson A. (2003). Botulismo y toxina

botulínica. Rev. Toxicol. 20: 8-12

RHODEHAMEL, EJ & Harmon, SM (2001). BAM: Clostridium perfringens. Disponible en:

http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070878.htm
Consultado 12 de mayo de 2014

WIKIPEDIA. La enciclopedia libre (2014). Clostridium. Disponible en:

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Clostridium&oldid=73821102 Fecha de
consulta: 21 de mayo del 2014.

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Anexo P9

Universidad de Caldas

Programa de Ingeniería de Alimentos

INFORME DE LABORATORIO
Práctica de Laboratorio de Microbiología de Alimentos
DATOS GENERALES
Nombre del análisis: Fecha de ejecución de la práctica:
dd/mm/aaaa

Nombre completo de los estudiantes:

1. ________________________________________ Nota de la práctica: _______

2. ________________________________________ Nota de la práctica: _______

3. ________________________________________ Nota de la práctica: _______

4. ________________________________________ Nota de la práctica: _______

DATOS DE LA MUESTRA
Tipo de muestra: Presentación de la muestra:

Nombre comercial del producto: Cantidad de muestra (peso neto):

Fecha de vencimiento: Número de lote:

Información adicional pertinente:

REGISTRO DE RESULTADOS
Dilución seleccionada para hacer el cálculo preliminar:

Dilución sembrada Volumen sembrado (V) Número de colonias (C)

𝐶×𝐷
Cálculo: 𝑁 =
𝑉
Reporte definitivo:
Norma microbiológica que establece los criterios microbiológicos que debe cumplir el
alimento analizado: ________________________
m=
M=

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Interpretación de los resultados:

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