UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

MICROBIOLOGÍA AGROINDUSTRIAL APLICADA

PRÁCTICA N° 4
RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y E. COLI
Docente: W. Valerio Vasquez Rojas
Jefe de Practica: Ciro Auca
I. OBJETIVOS

- Comprender el procedimiento para el recuento de coliformes totales y E.

coli.
- Aplicar el procedimiento a muestras de alimentos y bebidas

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

La familia Enterobacteriaceae son bacilos Gram negativos oxigénicos y
facultativamente anoxigénicos, no formadores de esporas, que producen ácido
a partir de glucosa y otros hidratos de carbono.
El grupo de los coliformes fecales se limita a los organismos que crecen en el
tracto gastrointestinal de los seres humanos y los animales de sangre caliente
e incluye miembros de al menos tres géneros Escherichia, Klebsiella y
Enterobacter.
La E. coli es una bacteria mesófila y crece desde lo 7 a 50 °C con una óptima
temperatura de 35 °C, el valor de pH para su crecimiento es 5.0, y son
sensibles a tratamiento de calor bajo (pasteurización).
La evaluación de E. coli es un indicativo bacteriano para determinar la
presencia de patógenos entéricos en los alimentos y el agua, y su presencia
puede ser atribuido a contaminación de fuentes medio ambientales y
subsecuentemente el crecimiento en el alimento o producto.

III. MATERIALES Y EQUIPOS

III.1. REACTIVOS
a. Diluyente: Agua peptonada tamponada.
Preparación: Realizar una suspensión de acuerdo a lo estipulado en el
envase y esterilizar a 121 °C por 15 minutos.
b. Medio de cultivo: Brilliance E. Coli/ Coliform Selective Medium.
Preparación: Suspender de acuerdo a los estipulado en el envase, llevar a
ebullición para su dilución completa, esterilizar a 121 °C por 15 minutos.

III.2. MATERIALES
- Placas Petri estériles de 90 mm de diámetro.
- Tubos de ensayo estériles
- Pipetas estériles
- Puntas para micropipetas
- Espátulas
- Vasos de precipitado
- Botellas atuclavables
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
MICROBIOLOGÍA AGROINDUSTRIAL APLICADA

- Mechero bunsen
- Bolsas para homogeneizador de paletas

III.3. EQUIPOS
- Agitador magnético con calefacción
- Baño maría
- Cabina de flujo laminar
- Incubadora
- Micropipetas de 1000 uL
- Autoclave
- Agitador vortex

IV. PROCEDIMIENTO
IV.1. MUESTRA ANALÍTICA
- Homogenizar la bebida o cortar la muestra sólida.
- Medir 1 mL o 1 g de la muestra y transferir a un tubo de ensayo con 9 mL
de agua peptonada (D1: dilución 1/10) y agitar en agitador vortex (de ser el
caso lleve 5 ml o 5 gr a una bolsa con 45 mL de agua peptonada).
- A partir de la dilución (D1), repetir el procedimiento del paso anterior en los
siguientes tubos (1 mL de D1+ 9 ml diuyente y sucesivamente) hasta
obtener las diluciones necesarias (Figura 1), dependiendo de la carga
microbiana.
- Utilizar una punta de micropipeta para cada dilución.
- La siembra debe realizarse dentro los 20 minutos siguientes de la
preparación
- Rotule las placas Petri estériles.
- Transfiera 1 mL de la dilución madre y/o diluciones decimales adecuadas.
- Vierta en cada placa Petri aproximadamente 15 mL del medio de cultivo
enfriado a 47 ± 2°C.
- Mezclar el inóculo con el medio mediante cinco movimientos circulares en
sentido horario, cinco antihorario, cinco en sentido vertical y cinco en
sentido horizontal.
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
MICROBIOLOGÍA AGROINDUSTRIAL APLICADA

Figura 1. Metodología de trabajo

Nota: Se incluyen los controles de esterilidad, tanto del medio como del
diluyente empleado, de la siguiente forma:
- Control de esterilidad del medio: se vierte el medio empleado en una
placa Petri estéril, sin diluyente ni muestra.
- Control de esterilidad del diluyente: se siembra 1 ml de un tubo de
diluyente estéril que se trata como la muestra.
- Dejar solidificar completamente a temperatura ambiente.
- Invertir las placas e incubarlas a 30 ± 1°C durante 24 ± 3 horas.

IV.2. CÁLCULO DE RESULTADOS DE CONTEO

IV.2.1. Recuento de colonias
Contar las placas que contengan entre 1 y 300 colonias. Apuntar
primero los resultados en la placa, luego en el cuaderno de apuntes.

Nota: Cuando las placas de una muestra han sufrido contaminaciones

o por otros motivos no pueden considerarse satisfactorias se marca la
placa con EA (error analítico).

IV.2.2. Cálculo de resultados

 UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
MICROBIOLOGÍA AGROINDUSTRIAL APLICADA

prom∗1
∗1
UFC vol sembrado
=¿UFC
mL dilución

Donde el volumen sembrado es en mL.

IV.2.3. Expresión de resultados
a) Caso general:
El resultado se expresa como un número entre 1 y 9,9 multiplicado por
la potencia de 10 adecuada, o como un número entero con dos cifras
significativas.
b) Nº de colonias entre 4 y 10:
El resultado se expresa como nº estimado de microorganismos por
gramo o ml.
c) Nº de colonias entre 1 y 3:
El resultado se expresa como: “Hay microorganismos presentes, pero a
un nivel inferior a (4 x d) por gramo o ml”
d) Nº de colonias mayor de 300:
El resultado se expresa como: “más de 300/d” donde d es el factor de
dilución correspondiente a la última dilución inoculada
e) No hay colonias:
El resultado se expresa como: “Menos de 1/d microorganismos por
gramo o ml” donde d es el factor de dilución de la suspensión inicial, o
de la primera dilución inoculada o escogida.
V. RESULTADOS Y DISCUSIONES
 Describir los pasos realizado según la guía. Indicar cualquier
modificación. Agregar fotos, imágenes, tablas o lo que considere.
 Realizar un resumen flujo de los procedimientos
 Comparar los resultados con la “Norma Sanitaria que establece los
criterios microbiológicos de calidad sanitaria e inocuidad para los
alimentos y bebidas de consumo”
 Explicar, discutir, comparar y/o sugerir según los resultados y la
teoría. (brevemente, solo aspectos importantes)

VI. CONCLUSIONES

VII.TAREA
Resumir Paper: FECAL CONTAMINATION OF FRUITS AND VEGETABLES
DURING CULTIVATION AND PROCESSING FOR MARKET. A REVIEW
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0362028X23006531
Estudiar para evaluación práctica, las siguientes partes:
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
MICROBIOLOGÍA AGROINDUSTRIAL APLICADA

 Abstract, introducción
 Pathogenic micboorganisms
 Epidemiological evidence
 Pathogen survival and detection on farm produce
 Recommended quality goals
 Summary

VIII. BIBLIOGRAFÍA
Manual de la Calidad de la USTA. Capítulo T-4. Métodos de Ensayo y
Calibración. Validación de Métodos.
Norma AFNOR NF V 08-051 Microbiología alimentaria – Recuento de
microorganismos por contaje de colonias obtenidas a 30ºC. Método de rutina.
Norma UNE-EN ISO 7218 Microbiología de los alimentos para consumo
humano y alimentación – Requisitos generales y guía para el examen
microbiológico