INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE CIENCIAS

DE LA SALUD

UNIDAD MILPA ALTA

LICENCIATURA EN NUTRICIÓN

MICROBIOLOGIA SANITARIA

PRÁCTICA N. 4 AISLAMIENTO POR LA TÉCNICA DE DILUCIONES

Y VACIADO EN PLACA

EQUIPO 7
ARREDONDO HERNÁNDEZ MONSERRATH
ESTRELLA MORALES KAREN ALELI
HERNÁNDEZ HERNÁNDEZ CINDY SUNEM
SILVA PEGUERO ANDREA
SILVA PEGUERO MARIA FERNANDA
MORELOS BALDERAS ANGELICA

GENERACIÓN 52 GRUPO
 INTRODUCCIÓN
Existen varios procedimientos especiales e indispensables en el laboratorio de
Microbiología, y entre ellos están las técnicas estándar del vaciado en placa a
partir de diluciones. Este método tiene la ventaja de ser muy eficaz, tanto para
poner de manifiesto el número total de microorganismos presentes en una
determinada muestra, como para el aislamiento de diferentes microorganismos
presentes en especímenes de cargas microbianas muy altas y conteniendo
diferentes géneros y especies. Se debe a Roberto Koch la introducción de esta
técnica, de la cual es precursor. Hoy en día la técnica consiste en enfriar un medio
fundido que contenga agar, hasta aproximadamente 42-25°C, e inocular el medio
con un espécimen, inmediatamente antes de vaciarlo a una caja de Petri estéril.
Por lo tanto, las bacterias se distribuyen en todo el agar y quedan atrapadas en
cierta posición cuando se solidifica el medio. Existen algunas desventajas en esta
técnica, como son similitud en las colonias de diferentes especies de bacteria, falta
de crecimiento de alguna especie bacteriana, y no se pueden separar colonias
para realizar estudios subsecuentes

OBJETIVO

 Explicar el fundamento de diferentes medios de cultivo y condiciones

de incubación para el aislamiento de microorganismos con
características específicas.
 Aplicar diferentes técnicas para el aislamiento de microorganismos.
 Comparar con cepas de referencia la eficiencia de las técnicas de siembra,
medios de cultivo y condiciones de incubación empleadas para el
aislamiento de microorganismos.
 Obtener y comprobar la pureza de los cultivos aislados.

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-092-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS.

MÉTODO PARA LA CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA.
1. Objetivo y campo de aplicación
1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece el método para estimar la cantidad de
microorganismos viables presentes en un alimento, agua potable y agua
purificada, por la cuenta de colonias en un medio sólido, incubado aeróbicamente.
1.2 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el Territorio
Nacional para las personas físicas o morales que requieran efectuar este método
en productos nacionales y de importación, para fines oficiales.
Fundamento
El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en
el medio de elección después de un cierto tiempo y temperatura de incubación,
presuponiendo que cada colonia proviene de un microorganismo de la muestra
bajo estudio. El método admite numerosas fuentes de variación, algunas de ellas
controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores.

MATERIAL
 Agar MB
 Medio MB  Pipetas graduadas de 1ml. Estériles
 Agar nutritivo  Tubos de Durham con caldo
 Agua para consumo humano (4ml) lactosado e indicador ácido-base.
 Muestra de leche de 250ml con  Incubadora o estufa de laboratorio
medio de agar nutritivo estéril  Cintas masking tape
 Cajas de Petri estériles  Plumón indeleble de punto fino o
 Baño María controlado a 65°C bolígrafo
 Tubos con 9ml de regulador de  Trapo o año de limpieza.
fosfatos estériles
 Mechero Bunzen

PROCEDIMIENTOS

MUESTRA DE LECHE
1. Tomar una de las cajas estériles y rotularlas con los siguientes datos:
equipo, fecha, tipo de leche, grupo y dilución realizada.
2. Colocar 1ml de leche en una caja de Petri rotulada como “Agar EMB”.
Colocar otro ml de leche en uno de los tubos de regulador de fosfatos y
agitar suavemente y uniformemente para homogenizar la muestra, será la
disolución 1:10. Después pasar 1ml de la dilución a una caja de Petri
marcada para este propósito, que recibirá agar nutritivo.
 3. A partir del tubo anterior que co ntiene la muestra diluida 1:10, tomar 1ml y
pasar al segundo tubo con regulador de fosfatos, agitar nuevamente para
homogenizar la muestra, será la disolución 1:100. Después pasar 1ml de esta
disolución a una caja de Petri marcada para este propósito que recibirá agar
nutritivo.
4. A partir de tubo anterior que contiene la muestra diluida 1:100, tomar 1ml y
pasar al segundo tubo con regulador de fosfatos, agitar nuevamente para
homogenizar la muestra; será la disolución 1:000. Después pasar 1ml de
esta disolución a una caja de Petri marcada para este propósito, que
recibirá agar nutritivo.
5. Adicionar el agar nutritivo fundido a 45°C a la serie de las cajas con dilución
de 1:10, 1:100 y 1:1000 y el medio de EMB a la caja de con la muestra
original mezclar lentamente con movimientos rotatorios. Las cajas de agar
nutritivo servirán para obtener la cuenta general de colonias o mesofilicos
en la muestra original, y la caja de EMB para la cuenta de coliformes.
6. Dejar solidificar y llevar a incubar a 37°C por 24-48hrs.

MUESTRA DE AGUA
1. Rotular el tubo Durham y las cajas de Petri con: núm. De equipo, tipo de
muestra y grupo.
2. Tomar 1ml de la muestra de agua y pasarlo al tubo Durham con indicador
ácido-base. Llevar a incubar por 24-48hrs a 37°C. Esta será la prueba
presuntiva de coliformes.
3. Tomar 1ml de la muestra de agua y colocarlo en una caja de Petri estéril
vacía. Añadirle de 18-18 ml de agar nutritivo fundido, agitar suavemente,
dejar solidificar y llevar a incubar a 37°C durante 24-48hrs. Este medio
servirá para la cuenta de mesofilcos.
4. Tomar 1ml de la muestra de agua y colocarlo en una caja de Petri estéril,
vierte de 15-18ml de medio EMB, agita con movimientos suaves, deja
solidificar y lleva a incubar a 37°C durante 24-48hrs. Este medio será la
prueba confirmativa de coliformes.
 LECHE REPORTE
9,013.33 ufc/ml
1. Número de mesofilicos por ml. de leche
(1/100)
2. Número de coliformes por ml de. De leche
3. Decide si tu leche es consumible o no, y clasifica el tipo de leche de
acuerdo con los estándares microbiológicos vigentes
4. Lectura del tubo Durham, indica con signo +/- la producción de ácido y la
producción de gas, de acuerdo a los fundamentos
5. Número de mesofilicos por ml, de agua
6. Número de coliformes por ml. de agua
7. Reporta si el agua era potable o no, de acuerdo con el estándar
microbiológico
8. Añade la resolución del siguiente cuestionario a tu reporte

RESULTADOS

1 # Mesofilicos por ml. de 2 # Coliformes por ml. de

Leche Leche
9,013.33 (UFC/ML)
(1/100

3 LECHE BRONCA

4 LECTURA DURHAM

AGUA
1,062 ufc/ml
 5 # Mesofilicos por ml. de 6 # Mesofilicos por ml. de
Agua Agua

7 AGUA POTABLE

CUESTIONARIO
1- Investiga el número máximo de microorganismos permitidos para el agua y para los diferentes
tipos de leche de tipo mesofilico aerobio y de coliformes.

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-181-SSA1-1998, SALUD AMBIENTAL. AGUA

PARA USO Y CONSUMO HUMANO. REQUISITOS SANITARIOS QUE DEBEN
CUMPLIR LAS SUSTANCIAS GERMICIDAS PARA TRATAMIENTO DE AGUA,
DE TIPO DOMÉSTICO.
La prueba de potabilidad es aceptable, cuando el porcentaje DE reducción
bacteriana es igual o mayor a 95% para organismos mesófilos aerobios e igual o
mayor a 99.99% para organismos coliformes totales .
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-091-SSA1-1994. BIENES Y SERVICIOS.
LECHE PASTEURIZADA DE VACA. DISPOSICIONES Y ESPECIFICACIONES
SANITARIAS.
ESPECIFICACIONES LIMITE MAXIMO
Mesofílicos aerobios UFC/ml 30 000
Organismos Coliformes totales UFC/ml en planta 10
 Organismos Coliformes totales UFC/ml en punto de venta 20

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-184-SSA1-2002, PRODUCTOS Y

SERVICIOS. LECHE, FÓRMULA LÁCTEA Y PRODUCTO LÁCTEO
COMBINADO. ESPECIFICACIONES SANITARIAS.

2- ¿Qué significado o importancia sanitaria tienen los organismos de tipo mesofilico y coliformes en el
agua y la leche?

La presencia de coliformes en el agua indica que el agua de su pozo está

contaminada con excremento o desechos de alcantarillas, y tiene el potencial de
causar enfermedades. 
Bacterias mesófilas aerobias que reflejan la exposición de la muestra a la
contaminación en general, la existencia de condiciones favorables para la
multiplicación de microorganismos y la presencia de materia orgánica.