Miércoles 8 a 12

pm

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE QUIMICA E INGENIERÍA QUÍMICA

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA

ORGÁNICA

LABORATORIO BIOQUÍMICA

PRÁCTICA N° 2

ESPECTROMETRÍA

DOCENTE: Mg. Juan Carlos Woolcoot Hurtado

ALUMNO: Jimenez Zarate, Angelica Jasmin
16070084

Fecha de realización de la práctica:

26/10/2021

LIMA-PERÚ
2021-II

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Tabla de contenido

INTRODUCCION....................................................................................................................... 3

FUNDAMENTOS TEÓRICOS ................................................................................................. 4

CONCLUSIONES ....................................................................................................................... 7

CUESTIONARIO ....................................................................................................................... 7

BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................................... 9

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 INTRODUCCION
Si se observa una disolución acuosa de Cu2+ al trasluz se percibe un color azulado. Esta
coloración se debe a la interacción de los iones cobre con la radiación lumínica que
atraviesa la disolución. En concreto, se debe a la absorción de algunas radiaciones
lumínicas que corresponden al color complementario (en este caso el amarillo) Las
radiaciones no absorbidas son las que atraviesan la disolución sin obstáculo alguno y
llegan a nuestro ojo. Estas radiaciones transmitidas corresponden al color azul. Además,
si comparamos el color de dos disoluciones de Cu2+ con diferente concentración,
observamos que a mayor concentración corresponde una mayor intensidad del color azul
de la disolución. Por lo tanto, se puede conocer la sustancia que hay en una disolución,
según el color de esta, y también se puede hallar la cantidad de esa sustancia, según la
intensidad de ese color. Esta propiedad de interacción de la luz con una gran cantidad de
especies químicas que permite identificar y cuantificar analitos. La espectrofotometría
significa medida del espectro de la luz y se refiere a la medida del tipo y cantidad de luz
que se obtiene de una disolución.
Los objetivos de esta práctica fueron los siguientes:
❑ Conocer el uso y aplicación del espectrofotómetro.
❑ Aplicar la Ley de Lambert - Beer en el empleo del espectrofotómetro.
❑ Determinar una curva de calibración, usando la solución de azul de metileno.

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 FUNDAMENTOS TEÓRICOS
En esta práctica estudiaremos la absorción de luz en el ultravioleta cercano (λ≈325-420
nm) y en el visible (λ≈420-900 nm). Cuando una molécula absorbe un fotón en este
intervalo espectral, se excita pasando un electrón de un orbital del estado fundamental a
un orbital excitado de energía superior. De esta manera la molécula almacena la energía
del fotón:
𝐴 + ℎ𝑣 → 𝐴∗
𝐸(𝐴∗ ) = 𝐸(𝐴) + 𝐸𝑓𝑜𝑡𝑜𝑛

Como la energía se conserva, la diferencia de energía entre el estado fundamental de la

molécula (A) y su estado excitado (A* ) debe ser exactamente igual a la energía del fotón.
Es decir, una molécula sólo puede absorber fotones cuya energía h⋅ν sea igual a la energía
de un estado molecular excitado. Cada molécula tiene una serie de estados excitados
discretos (o bandas) que dependen de su estructura electrónica y que la distinguen del
resto de moléculas. Como consecuencia, el espectro de absorción, es decir, la luz
absorbida en función de la longitud de onda constituye una verdadera seña de identidad
de cada sustancia o molécula. Las radiaciones más importantes con aplicación al análisis
químico son:

En una ampliación a esta práctica, se puede detectar una mezcla de dos colorantes
alimentarios, el rojo E-124 y un colorante verde midiendo su espectro de
ultravioleta/visible. Cuando dos o más sustancias aparecen mezcladas en una misma
muestra sus espectros de absorción aparecen superpuestos tal como se representa en la
siguiente figura:

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Los espectros de absorción se miden mediante un instrumento denominado
espectrómetro. Los instrumentos que vamos a usar en esta práctica constan de una fuente
de luz “blanca” caracterizada por un espectro de emisión continuo en un intervalo amplio
de longitudes de onda (en nuestro caso 325 nm-900 nm) y de un monocromador que actúa
como filtro óptico transmitiendo un haz de luz de longitud de onda fija λ e intensidad I0.
Este haz de luz penetra en la cubeta de análisis donde se encuentra la muestra. Un detector
sensible a la luz mide la intensidad del haz a la salida If .

La intensidad del haz de luz se va atenuando a medida que atraviesa la cubeta debido a la
absorción de las moléculas de la muestra. El ritmo de absorción depende de la intensidad
inicial de luz y de la concentración de moléculas.
De esta manera, cuando un haz de luz de intensidad I recorre una distancia dL en una
muestra con una concentración de moléculas [B], se produce una atenuación de intensidad
dI dada por:
𝑑𝐼 = −𝑘 𝑥 [𝐵] 𝑥 𝐼 𝑥 𝑑𝐿

La constante k se denomina coeficiente de absortividad molar. La expresión anterior se

puede integrar de la siguiente forma:

lo cual da lugar a la ley de Beer-Lambert para la absorción que relaciona la intensidad a

la salida de la muestra If , con la intensidad inicial I0, la concentración de moléculas y la
distancia recorrida por la luz en la muestra, L:

𝐼𝑓 = 𝐼0 𝑥 𝑒 −𝑘 𝑥 [𝐵]𝑥 𝐿

El espectrofotómetro, en lugar de la intensidad, mide la absorbancia A que se define por:

𝐼0
𝐴 = 𝐿𝑛 ( ) = 𝑘 𝑥 [𝐵]𝑥 𝐿
𝐼𝑓

La utilización de la absorbancia al realizar los espectros tiene la ventaja de ser

directamente proporcional a la concentración de moléculas en la muestra.

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Calibración.
Dado que hay una serie de fenómenos que no permiten la aplicación de la ley de Beer, en
la práctica se realiza siempre una calibración de la técnica de medida, con la cual
obtenemos una relación matemática entre la concentración y la absorbancia. El
procedimiento de la calibración se basa en medir la absorbancia de varias disoluciones
patrón (de concentración conocida), en las mismas condiciones que se mide la
absorbancia de la disolución problema, y se hace una interpolación.
Parámetros de Calidad.
La calidad de una técnica espectrofotométrica expresada en términos de incertidumbre se
basa esencialmente en tres parámetros: sensibilidad, límite de detección y rango de
linealidad.
Sensibilidad: Es la concentración requerida para dar un 1% de absorbancia (99% de
transmitancia o lo que es lo mismo 0,0044 unidades de absorbancia. A medida que esta
concentración es menor, la sensibilidad de la técnica es mayor porque es necesaria menos
concentración para producir una señal en el detector.
Límite de detección: Es la mínima concentración que se puede medir con la técnica y
con un elevado nivel de certidumbre. Está relacionado con el ruido de fondo del aparato,
es decir la señal que mide el aparato cuando se introduce un blanco. Una manera de
calcularlo es multiplicar por tres la señal correspondiente al ruido de fondo.
Rango de linealidad: Es el intervalo de concentraciones dentro del cual podemos medir
una muestra problema con un elevado nivel de certidumbre. Generalmente a partir del
valor máximo de este rango, la señal (absorbancia) deja de tener una relación lineal con
la concentración y la curva se hace horizontal, tendiendo a un valor máximo de
absorbancia. Las muestras o patrones que están fuera de este rango no se pueden medir
con seguridad con la técnica empleada.

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 CONCLUSIONES
Su utilidad se basa en la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un
sistema químico en función de la longitud de onda y su aplicación, en la estandarización
de colores y determinación de impurezas en reactivos y/o alimentos.

La parte experimental de la curva de calibración usando el azul de metileno, no se pudo

determinar la absorbancia por la falta de datos y tampoco se pudo ver la aplicación de la
ley de Lambert – Beer.

CUESTIONARIO
1. ¿Qué es un espectro de absorción?
El espectro de absorción es una representación gráfica que indica cantidad de luz
absorbida (ε) a diferentes valores de λ.

2. ¿Qué características deben tener el/los compuestos para ser cuantificados por
espectrofotometría ultravioleta/visible?
Deben tener la característica que al ser analizadas deben ser muestras coloreadas, ya
que en la región visible se aprecia el color visible de una solución y que corresponde
a las longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe
es el complementario del color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de
absorción es necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la solución
coloreada.

3. ¿En qué se basa la Ley de Lambert-Beer?

Se basa en la absorción selectiva de radiación en la zona visible del espectro
electromagnético que se produce cuando dicha radiación, atraviesa una solución
coloreada que contiene al analito de interés y que se coloca en una celda, dando lugar
a que el rayo emergente difiera del incidente

4. ¿Es siempre la absorbancia proporcional a la concentración? Explique

No, debido que a concentraciones altas se rompe la linealidad debido a que las
moléculas interactúen entre sí en concentraciones más altas

Esto se explica que a medida que

aumenta la concentración, P, la
radiación que llega al detector, se
vuelve más pequeña. Si la
concentración es lo suficientemente
alta, la muestra absorbe gran parte
de la radiación incidente y P se
vuelve mucho más pequeña.

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5. ¿Por qué elige una longitud de onda máxima para la valoración de una muestra?
La longitud de onda de trabajo corresponde, generalmente, a la longitud de onda en
la cual la absorbancia del analito (sustancia a analizar) es máxima, y recibe la
denominación de Lambda máximo (λmax). Para seleccionar el λmax., se hace un
espectro de absorción o curva espectral, y que consiste en una gráfica de la
absorbancia de una solución de la sustancia absorbente de concentración adecuada,
medida a distintas longitudes de onda y en ella se determina el λmax.

6. ¿Qué es una curva de calibración? ¿Cómo se prepara y por qué?

Una curva de calibración es la representación gráfica de una señal medida como una
función de la concentración de un analito. La calibración incluye seleccionar un
modelo para estimar los parámetros que determinan la linealidad de esa curva. y, en
consecuencia, la capacidad de un método analítico para obtener resultados
directamente proporcionales a la concentración de un compuesto en una muestra,
dentro de un cierto rango de trabajo.
En la práctica para construir la curva de calibración se utilizan disoluciones que
contienen concentraciones conocidas de analito, llamadas disoluciones patrón o
estándar. Los estándares o disoluciones patrón para construir la recta de calibrado
deben ser preparadas en forma independiente, a partir de una o varias soluciones
madre; el número de puntos a escoger dependerá del uso que se dé a la recta de
calibrado. Si bien con dos puntos se puede construir una curva, estadísticamente se
requieren por los menos tres para que la curva sea confiable
La curva de calibración se prepara porque permite calcular la concentración de la
muestra problema, medir la absorbancia de estas muestras y medir la absorbancia de
la muestra problema

7. ¿Qué es un estándar de referencia?

Un Estándar de Referencia es una muestra altamente caracterizada y de alto nivel de
pureza que se utiliza en comparación con la muestra problema para la determinación
de concentraciones, identidad, entre otros.
8. ¿Cómo se usa en una valoración?
La determinación de la cantidad de una sustancia específica (analito) contenida en
una muestra mediante la adición controlada de un reactivo (valorante) con una
concentración conocida. Esta técnica se basa en la reacción química completa entre
la sustancia y el reactivo. El valorante se añade hasta que la reacción haya finalizado

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 BIBLIOGRAFÍA
❑ Harris, D. C. Análisis Químico Cuantitativo. 3a ed. Capítulo 18. Ed. Reverté,
2007.
❑ Higson, S. P. J. Química Analítica. 1a ed. Capítulo 5. Ed. Mc Graw Hill. 2007.
❑ Martínez Urreaga, J.; Narros Sierra, A.; De La Fuente García-Soto, M.M.; Pozas
Requejo, F.; Díaz Lorente, V.M. Experimentación en Química General. Capítulo
5. Ed. Thomson Paraninfo, 2006.
❑ Hernández-Hernández, L.; González-Pérez, C. Introducción al análisis
instrumental. Capítulo 3. Ed. Ariel Ciencia, 2002.
❑ Beer’s Law [Internet]. Chemistry LibreTexts. 2021 [cited 30 October 2021].
Available from:
https://chem.libretexts.org/Bookshelves/Analytical_Chemistry/Molecular_and_
Atomic_Spectroscopy_(Wenzel)/1%3A_General_Background_on_Molecular_S
pectroscopy/1.2%3A_Beers_Law