METODOS OPTICOS DE ANALISIS CLINICO

Se define como aquellos que miden la radiación electromagnética que emana o interactúa con la
materia. Estos métodos tienen como objeto la medida de la radiación que es emitida, absorbida, o
transmitida al interactuar el campo eléctrico o magnético de la radiación con los campos
eléctricos o magnéticos de la materia; o bien la medida de la radiación que es reflejada,
refractada, difractada, polarizada o dispersada cuando interactúa con la materia.

Los métodos ópticos se dividen en espectroscópicos y no espectroscópicos.

Los primeros miden la radiación absorbida por átomos, moléculas o iones y se conocen como
métodos espectroscópicos de absorción, y según sea la radiación absorbida, se conocen como:

- métodos de absorción de rayos X

- absorción en el ultravioleta
- absorción en el visible
- absorción infrarroja

Si se mide la radiación emitida por átomos, moléculas o iones, los métodos se conocen como
métodos espectroscópicos de emisión y según sea la radiación emitida se conoce como:

- métodos de emisión de rayos X

- fluorecencia atómica
- flurescencia molecular
- fosforecencia que pueden ocurrir en el visible o ultravioleta

Los segundos, no espectroscópicos miden cambios en la dirección de la propagación de la luz,

entre ellos se tienen la refratometria, polarimetría, medidas de reflectancia entre otros.

ESPECTROFOTOMETRIA

Se aprovecha la absorción de radiación electromagnética en la zona del ultravioleta y visible del

espectro. La muestra absorbe parte de la radiación incidente en este espectro y promueve la
transición del analito hacia un estado excitado, transmitiendo un haz de menor energía radiante.

En esta técnica se mide la cantidad de luz absorbida como función de la longitud de onda
utilizada. La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la
estructura de las moléculas y es característica de cada sustancia química.

La espectrofotometría ultravioleta-visible utiliza haces de radiación del espectro

electromagnético, en el rango UV de 180 a 380nm, y en ek de la luz visible de 380 a 780nm, por
lo que es de caracterizar los materiales en la región ultravioleta y visible del espectro.

Todos los colores que percibimos a nuestro alrededor como el verde de las plantas o el llamativo
de los colores de las flores, son el resultado de la capacidad de algunas moléculas de absorber luz
en algunas longitudes de onda del espectro visible .
Cuando la luz blanca incide sobre una molécula coloreada, esta absorbe cierta longitud de onda
del espectro, permitiendo que nuestros ojos capten solo aquellos que no han sido absorbidas por
la molécula lo que determina el color de la misma.

La espectrofotometría utiliza esta propiedad para la identificación o cuantificación de moléculas

en el laboratorio.

ESPECTROFOTOMETRO

Es un instrumento que nos permite medir la absorción.

Un espectrofotómetro típico posee cuatro componentes básicos:

1. fuente de luz: que tiene intensidad constante en el rango de longitud de onda que cubre.
2. Monocromador: que separa la banda de longitud deseada y la dispersa al compartimiento
de la muestra.
3. Compartimiento para la muestra
4. Fotodetector: que mide la radiación que atraviesa la muestra, sin ser absorbida por la
misma.
5. Rendija de entrada
6. Rendija de salida
7. Cubeta
8. Medidor

La absorción de la luz de una muestra medida a diferente longitud de onda se corresponde con su
espectro, de absorción es un dato básico en la caracterización de una molécula, porque cada
molécula que absorbe luz, tiene un espectro de absorción característico, por lo tanto realiza el
espectro de absorción de una muestra nos puede ayudar a analizar cuantitativamente las
moléculas que la componen.

Vamos a realizar el espectro de absorción entre las longitudes de onda 400 700nm de un extracto
de hoja de espinaca, en la que la clorofila es el compuesto coloreado más abundante.

Ponemos parte del extracto en una cubeta para análisis con luz visible teniendo precausion de no
tocar las dos caras transparentes de la misma.

Colocamos la cubeta en el espectrofotómetro, orientada de tal manera que el haz de luz atraviese
la cubeta por estas dos caras transparentes.

En este espectrofotómetro el haz pasa de derecha a izquierda.

Cuando presionamos para comenzar observamos como en un plano cartesiano se va viendo

progresivamente representada la absorbancia de la muestra, eje de ordenadas a distintas
longitudes de onda, eje de aftisas desplazándonos sobre el plano averiguaremos a que longitud de
onda corresponde cada pico de la grafica y que absorbancia tiene.

El primer pico se ha observado a los 663nm y tiene una absorbancia de 0,568

El segundo pico es de 468nm y tiene una absorbancia de 1,023

De esta forma sabemos que las dos áreas de absorción una alrededor de 650nm y otra de 450nm,
delimitan una zona de reflexión de luz entre 500 y 600nm.

Este ensayo nos indica que cuando la luz solar incide sobre las hojas estas absorben los rayos de
las zonas azul violeta y rojo del espectro dejando pasar solo los de la zona del verde que es lo que
percibimos las hojas de este color.

Cuando mayor sea el número de moléculas que el haz de luz encuentre en su paso mas luz
quedara absorbida por las mismas por ello la absorbancia de una muestra será mayor cuando
mayor sea la distancia que atraviese el haz de luz y también será directamente proporcional a la
concentración de moléculas en la muestra.

Por otra parte la luz en las zonas visibles infravioletas del espectro que cada una de las moléculas
de una muestra es capaz de absorber depende básicamente del número del doble enlaces
conjugados que posee características que queda expresada en su coeficiente de extinción molar,
una constante que indica el valor de la absorbancia de una sustancia que se encuentra a una
concentración un molar cuando se mide en una cubeta de 1 cm de lado.

Esta constante varia según la longitud de onda de trabajo.

La absorbancia de una sustancia es directamente proporcional a su coeficiente de extinción molar

a la concentración de dicha sustancia y a la anchura de la cubeta de medida que es siempre de
1cm. Esto viene en la:

LEY DE LAMBERT BEER

Nos sirve para determinar la concentración de una molécula en disolución simplemente midiendo
su absorbancia y siempre que conozcamos de antemano su coeficiente de extinción molar a la
longitud de onda de trabajo.

C: A

Tiene aplicación en el estudio de las reacciones enzimáticas para ello es necesario que un sustrato
o un producto de la reacción puedan absorber luz en las zonas ultravioletas o visible de espectro,
por sus características especificas espectrofotométricas el par NAD / NADH es especialmente
conveniente para estos ensayos, en su forma oxidada este cofactor tiene un máximo de absorsion
a 260nm. La forma reducida tiene además un pico de absorción a 340nm. En una reacción de este
tipo catalizada por una enzima E, en la que partimos NAD como sustrato podremos monitorizar
como procede la reacción, midiendo la aparición de NADH por el aumento de absorbancia a
340nm, además como conocemos el coeficientes de extinción molar NADH a 340nm podremos
calcular la cantidad de NADH, acumulada en un lapso de tiempo concreto y asi determinar la
actividad de la enzima E.
Ley que respalda estos análisis

1. Ley de beer: afirma que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la
concentración de la solución.
2. Ley de lamber: la cantidad de luz absorbida de un objeto depende de la distancia recorrida
por la luz.

ESPECTROFOTOMETRIA VISIBLE ULTRAVIOLETA

Se usa para identificar algunos grupos funcionales de moléculas y además determinar el

contenido de fuerza de una sustancia, se usa en la determinación cuantitativa de los componentes
de solución, iones de metales de tracción y compuestos orgánicos.

USOS Y APLICACIÓN

 Determinar la cantidad de concentración de una solución de algún compuesto utilizado y

basándonos en las leyes descritas
 Determinación de estructuras moleculares
 Identificación de unidades estructurales específicas que estos tienen distintos tipos de
absorbancia
 Determinar constantes de disociación de indicadores acido-base.