1 | ESCUELA DE INGENIERÍA CIVIL BIOMÉDICA - UNIVERSIDAD DE VALPARAÍSO

Fotocolorimetría
Christian Contreras, Michelle Olivares, Nataly Rivera, Barbara Terzan, María José Vargas.
Escuela de Ingeniería Civil Biomédica
Facultad de Ingeniería, Universidad de Valparaíso, Chile

Palabras Clave: Fotometría, Espectrofotometría, Longitud de onda, Colorimetría.

Introducción

La luz visible es una onda electromagnética que viaja por el

espacio a una velocidad de 3*10-8 [m/s]. La luz consta de un
campo magnético y un campo eléctrico, perpendiculares
entre sí. Cuando una de las ondas electromagnéticas
encuentra en su camino una molécula o un átomo puede ser
reflejada, quiere decir que altera la dirección de propagación
o absorbida, parte de su energía se transfiere a la molécula.

Este trabajo da a conocer una técnica que utilizan los

laboratorios químicos para analizar muestras clínicas,
bromatológicas1 o bioquímicas, la cual está basada en el
estudio de la fotometría2.
Desarrollo
Descripción general
Antes de explicar que es la Fotocolorimetría, se definirán los
conceptos de Espectroscopia y Espectrofotometría para un
mejor entendimiento.
Espectroscopia: es el estudio de absorción y medición de
radiación electromagnética por la materia. El color es el
resultado de la cantidad de absorción de la luz por parte de
esta, por ejemplo, la clorofila es verde porque absorbe todas
las radiaciones del espectro visible excepto el verde.
Figura 1: Espectro de la absorción de la molécula de clorofila.
Espectrofotometría: en UV y espectro visible (figura 2), es
un método analítico que permite medir cuánta radiación
electromagnética absorbe una muestra de materia en una
solución, midiendo la intensidad de la luz cuando un haz
luminoso pasa a través de la solución, con base en la ley de
Beer-Lambert [2]. Las moléculas absorben las radiaciones
electromagnéticas y a su vez la cantidad de luz absorbida
depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este
tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que
se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa
por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la
misma.

En análisis bioquímicos es muy utilizada permitiendo

analizar pequeñas cantidades de sustancias. Las longitudes
de onda y la eficiencia con que se absorben dependen de la
estructura atómica de la molécula como del medio donde se
encuentra (pH, temperatura, fuerza iónica, constante
dieléctrica). Logrando que la espectroscopia sea útil en la
detección y caracterización de las moléculas. [1] Figura 2: Rango fotométrico. UV: ultra violeta, VIS: espectro
_____________ visible, NIR: infrarojo.
1 Es la ciencia que estudia en profundidad todo aquello que
esté relacionado con los alimentos.
Los rayos UV provocan daño al ojo humano. Pero en
2 Es un método de medición para analizar soluciones
los compuestos con dobles enlaces aislados, triples enlaces,
(acuosas) por medio de una fuente de luz.
enlaces peptídicos, sistemas aromáticos, grupos carbonilos y
otros heteroátomos tienen su máxima absorbancia en la
región UV, por lo que ésta es muy importante para la
determinación cualitativa y cuantitativa de compuestos
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orgánicos. Diversos factores -como pH, concentración de sal
y el disolvente- que alteran la carga de las moléculas,
provocan desplazamientos de los espectros UV.
En la región VIS apreciamos el color visible de una
solución y que corresponde a las longitudes de onda de luz
que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el
complementario del color que transmite. Por tanto, para
realizar mediciones de absorción es necesario utilizar la
longitud de onda en la que absorbe luz la solución
coloreada.
La Colorimetría y la Fotocolorimetría son técnicas
espectrofotométricas, las cuales trabajan en la zona visible
pero con sustancias coloreadas. En algunas ocasiones la
muestra que se quiere analizar no posee color por si misma,
por lo cual se implementa un desarrollo de color empleando
reactivos que dan lugar a sustancias coloradas con la
muestra que se desea estudiar.
La diferencia entre ambas técnicas es el tipo de equipo
utilizado, de forma que se denomina colorímetro a aquellos
aparatos en los que la longitud con la que vamos a trabajar
se selecciona por medio de filtros ópticos y en los
fotocolorímetros la longitud de onda se selecciona mediante
dis­positivos mono-cromadores. [3]
Técnicas de Medición
El fundamento de la espectrofotometría se debe a la
capacidad de las moléculas para absorber radiaciones
electromagnéticas, la cual trabaja con las leyes de
Transmitancia y absorbancia además de Ley de
Lambert-Beer.
Transmitancia y Absorbancia: cuando un rayo de luz, con
una longitud de onda de intensidad 𝐼𝑜 incide
perpendicularmente sobre una disolución de un compuesto
químico que absorbe luz, el compuesto absorbe una parte de
la radiación incidente 𝐼𝑎 y deja pasar el resto 𝐼𝑡 , por lo que
cumple:
𝐼𝑜 = 𝐼𝑎 + 𝐼𝑡
Figura 3: Demostración de la intensidad incidente.
La transmitancia (T) de una sustancia en solución es la
relación entre la cantidad de luz transmitida que llega al
detector una vez atravesada la muestra 𝐼𝑡 y la cantidad de luz
que incide sobre ella 𝐼𝑜 , representado por:
𝐼𝑡
𝑇% = × 100
𝐼𝑜
La absorbancia (A) está relacionada con la muestra, ya
que nos indica la cantidad de luz absorbida y se define como
1
el logaritmo de 𝑇 , por lo que:
1 𝐼
𝐴 = 𝑙𝑜𝑔( 𝑇 ) = − 𝑙𝑜𝑔 (𝑇) = − 𝑙𝑜𝑔 ( 𝐼 𝑡 )
𝑜
Ley de Lambert-Beer: la relación entre la cantidad de
energía absorbida y la cantidad de materia viene establecida
por la ley Beer y Lambert. Indica que la cantidad de luz
absorbida por un medio es independiente de la intensidad de
la radiación y dependiente del espesor de la muestra y
características de la misma.
Esta ley expresa la relación entre la absorbancia de la
luz monocromática de longitud de onda fija y la
concentración de un cromóforo en solución:
𝐼
𝐴 = 𝑙𝑜𝑔 ( 𝐼 ) = ε · 𝑐 · 𝐼
𝑜
La absorbancia de una solución es proporcional a su
concentración, donde ‘ε’ es una constante de
proporcionalidad, denominada coeficiente de extinción. Al
ser ‘A’ adimensional, la dimensión de ‘ε’ depende de la de
‘c’ e ‘I’, siendo la primera y segunda magnitud
respectivamente. La segunda magnitud se expresa en
centímetros (cm), mientras que la primera, siempre que sea
posible en mega (M). En término de unidad de
concentración molar, se denomina extinción molar.
La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas,
para valores altos de ‘c’, ‘ε’ varía con la concentración,
debido a los fenómenos de dispersión de la luz. [4]
Consideraciones especiales
La exactitud fotométrica es el grado de concordancia entre
la absorbancia real y la medida, el error al leer una
absorbancia respecto de una de referencia es una inexactitud
fotométrica. Esta consiste en la medición de absorbancias de
soluciones certificadas y en la comparación de valores
hallados con los de referencia.
(𝐴𝑏𝑠. ℎ𝑎𝑙𝑙𝑎𝑑𝑎−𝐴𝑏𝑠. 𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎)
𝐼𝑛𝑒𝑥𝑎𝑐𝑡𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑓𝑜𝑡𝑜𝑚é𝑡𝑟𝑖𝑐𝑎 = 𝐴𝑏𝑠. 𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎
× 100
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La capacidad de respuesta lineal de un

espectrofotómetro a diferentes concentraciones de sustancias
debe cumplir la ley de Beer. Este estudio permite establecer
el rango de absorbancias en el que el instrumento obtiene las
respuestas proporcionales a los cambios de concentración.
Para el cálculo se realiza una regresión lineal de la recta
hallada.

𝑌 = 𝑎 + 𝑏𝑋
Donde ‘b’ es la pendiente, representando la linealidad
fotométrica, y ‘a’ la ordenada al origen. La recta ideal es
representada por Y=X

Luz parasitaria, se denomina como toda la radiación

electromagnética de longitud de onda distinta a la
seleccionada por el monocromador que alcanza el detector,
quedando registrada por el fotocolorímetro. El control se
basa en la medida del porcentaje de transmitancia de una
solución de nitrito de sodio de 50 g/L. Esta sustancia tiene la
propiedad de que las soluciones absorban toda la radiación
incidente de longitudes de onda menores a 390 nm,
estableciéndose ópticamente como opaca a la luz. Por lo que
la transmitancia a 340 nm de esta solución debe ser igual a
cero y toda transmitancia detectada corresponde a luz
parasitaria.
(2−𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎)
𝐿𝑢𝑧 𝑝𝑎𝑟𝑎𝑠𝑖𝑡𝑎𝑟𝑖𝑎 = 𝑇𝑟𝑎𝑛𝑠𝑚𝑖𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎% = 10
El valor de transmitancia porcentual es definido como
la luz parasitaria existente en la zona espectral.
El control de precisión fotométrica es la medida de
dispersión de una serie de mediciones de transmitancia o
absorbancia alrededor de la media, se expresa como
coeficiente de variación porcentual
𝐷𝐸 ×100
𝑃𝑟𝑒𝑐𝑖𝑠𝑖ó𝑛 𝑓𝑜𝑡𝑜𝑚é𝑡𝑟𝑖𝑐𝑎 = 𝐶𝑉% = 𝑋
En que la ‘X’ representa la desviación estándar de las
absorbancias y ‘DE’ la media aritmética. Para una precisión
óptima se requiere un CV% menor de 0.5%, y para una
precisión aceptable un CV% menor de 1%.
Se denomina estabilidad fotométrica a la capacidad del
fotocolorímetro de mantener constante la absorbancia en
función del tiempo. Cuando se producen variaciones
constantes y continuas se habla de deriva fotométrica, en
cambio, cuando se producen variaciones al azar se está en
presencia de ruido fotométrico.
Figura 4: Variaciones en la estabilidad fotométrica demostradas
con tablas
(𝐴𝑏𝑠. 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 − 𝐴𝑏𝑠. 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙)
𝐷𝑒𝑟𝑖𝑣𝑎 = 𝐴𝑏𝑠. 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
× 100
𝑅𝑢𝑖𝑑𝑜 =
𝑑𝑒𝑠𝑣𝑖𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟
× 100
𝐴𝑏𝑠. 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎
El límite de aceptabilidad determina una estabilidad óptima
al ruido y deriva menor a 0.5%, y como precisión aceptable
menor a 1%. [5]
Fotómetros
Los primeros fotómetros se remontan de finales del siglo
XIX a mediados del XX, sin embargo no estaban
disponibles de manera generalizada. El primer
espectrofotómetro comercial se introdujo en el año 1941, el
cual separaba la luz en distintas longitudes de onda mediante
un prisma, y media la luz visible y la ultravioleta. Estos
espectrofotómetros eran relativamente caros, por lo que en
los análisis de laboratorio de rutina se empleaban
colorimetros fotoeléctricos, estos estaban compuestos por
una fuente de luz, filtros de color, un elemento sensible a la
luz que la convertia en energia electrica, y un
microamperimetro que registraba el nivel de energia.[6]
Aplicaciones biomédicas:
Los equipos de fotocolorimetría son usados en los
laboratorios para el análisis de muestras fisiológicas, esta
técnica es usada para cuantificar la cantidad de luz
absorbida por alguna sustancia previamente coloreada como
la albúmina, la hemoglobina, entre otros. La absorción de las
radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la
estructura de las moléculas y es característica para cada
sustancia química. También permite que enfermedades
como cáncer, hepatitis y sida, entre otras, que ocasionan que
la concentración y cantidad de algunas sustancias en fluidos
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corporales se modifique, por lo que su medición puede Disponible::

servir como técnica diagnóstica usando la fotocolorimetría. https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/08
El funcionamiento de los fotocolorímetros es similar en la _ESPECTROFOTOMETRIA.pdf.
mayoría de los dispositivos, ejemplo de ello son los [5] C. Duymovich, R. Acheme, S. Sesini, D. Mazziotta.
espectrofotómetros FastTrack UV/VIS. En estos Espectrofotómetros y Fotocolorímetros Guía práctica
dispositivos, la muestra se coloca en el equipo, se mide la de actualización, “ABCL” [en linea].Vol: 39. no: 529
transmitancia o absorbancia con un haz de luz que se 2005. Disponible en:
selecciona mediante un filtro de radiación visible. La https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=53539414
radiación que procede de una lámpara atraviesa un filtro de [6] Los colorímetros fotoeléctricos y espectro
vidrio coloreado, que sólo deja pasar una banda limitada de fotoeléctricos. [Online]. Disponible:
radiación y que atraviesa la muestra colocada en una cubeta https://www.grifols.com/es/-/photoelectric-colorimeters
transparente. Esta radiación se transforma luego en una -and-spectrophotometers
señal eléctrica que puede observarse en el medidor del [7] Fotocolorímetro. [Online]. Disponible:
equipo mediante una escala que va de 0 a 100. http://fiq.unl.edu.ar/museo/archivo/colecciones/fotocol
orimetro/

Figura 5: Espectrofotómetros UV7 de METTLER TOLEDO

De acuerdo a lo que establece la ley de Lambert-Beer, la

absorción es proporcional a la concentración de la sustancia
atravesada por la radiación monocromática. Se realiza el
análisis cuantitativo a través de una curva de calibrado
(obtenida a partir de un patrón) que permite el cálculo de la
concentración de la muestra. La constante de
proporcionalidad, denominada absortividad, depende de
cada sustancia en particular y varía con la longitud de onda.
Por lo tanto, la medida de absorbancia depende de la
longitud de onda. [7]

Referencias:

[1] E. Lopez Rico, C. Anzola Velasco. Guias de

laboratorio de Bioquímica. 2da Ed. Colombia. 2005.
[2] P. Roca, J. Oliver, A. Rodriguez. Bioquímica Técnica y
Métodos. 1ra. España: Ed. Elice. 2003.
[3] E. Aparicio Canela. Técnicas Colorimétricas. 2017
[4] N. Abril Díaz, J. Bárcena Ruiz, E. Fernández Reyes, A.
Galván Cejudo, J. Jorrín Novo, J. Peinado Peinado, F.
Toribio Meléndez-Valdés, I. Túnez Fiñana.
Espectrofometría: Espectros de absorción y
cuantificación colorimétrica de biomoléculas. Online.