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FACULTAD DE INGENIERA

FACULTAD DE INGENIERIA ESCUELA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL

LABORATORIO N 3 DE ANLISIS

"ESPECTROFOTOMETRA"
CURSO : ANLISIS DE PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES

DOCENTE

SANDRA PAGADOR FLORES

ALUMNO

JAVIER GALICIA CHICCHN. JEAN CALDERON ZAVALETA. GABRIELA PAIS CRUZADO TONNY GADEA GUILLEN

CICLO

TRUJILLO PER 2011

ESPECTROFOTOMETRA I. OBJETIVOS
_Graficar el espectro de pigmentos naturales. _Determinar la longitud de onda mxima absorbancia de una solucin.

II. FUNDAMENTACIN
ESPECTROFOTOMETRIA La espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms usado en las investigaciones biolgicas. El espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. Todas las sustancias pueden absorber energa radiante, aun el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe longitud de ondas que pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la regin del infrarrojo. La absorcin de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica. Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energa es absorbida; la energa radiante no puede producir ningn efecto sin ser absorbida. El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida. MTODOS FOTOMTRICOS DE ANLISIS 1. NATURALEZA DE LA RADIACIN ELECTROMAGNTICA La Radiacin Electromagntica es una forma de Energa radiante que se propaga en forma de ondas. En este fenmeno ondulatorio se define:

a) es la distancia entre dos mximos de un ciclo completo del movimiento ondulatorio. Se expresa, segn el S.I. en nanmetros (nm) y sus equivalencias son: =10 A0 = 10-9 m. b) frmula es: es el nmero de ciclos por segundo. Es inversa a la longitud de onda. Su

c) Fotones: la luz est formada por fotones, y estos son paquetes discontinuos de E. La E de un fotn depende de la frecuencia y de la longitud de onda, segn la siguiente expresin: E = h x =hx (h = Cte. de Planck = 6,62.10-27erg/seg.). La Energa Electromagntica se mide el Ergios. La relacin entre la longitud de onda y la Energa es inversa, por lo tanto a menor longitud de onda mayor Energa y viceversa. d) Espectro Electromagntico: cubre un amplio intervalo de E radiante, desde los rayos de longitud de onda corta hasta las ondas de radio, de longitud de onda larga. Se divide en varias regiones, las ms interesantes para nosotros son: * Regin Ultravioleta: = 10-380 nm * Regin Visible: = 380-780 nm * Regin Infrarroja: = 780-30.000 nm En la Regin Visible, la luz se descompone en colores. La luz blanca contiene todo el espectro de longitudes de onda. Si interacciona con una molcula puede ser dispersada o absorbida.

2. FENMENOS DE INTERACCIN ENTRE LUZ Y MATERIA A. FENMENO DE ABSORCIN Cuando una partcula que se encuentra en estado de reposo o estado fundamental interacciona con un haz de luz, absorbe E y se transforma en una partcula en estado excitado. La molcula absorbe la E de la onda y aumenta su energa, y ese aumento de energa es igual a la E de la Radiacin Electromagntica de forma espontnea a su estado de reposo desprendiendo la E absorbida en forma de calor. Espectro de Absorcin. Cada especie absorbente, que recibe el nombre de cromgeno, tiene un determinado espectro de absorcin. El espectro de absorcin es un grfico donde se representa en ordenadas la Absorbancia y en abcisas la longitud de onda. La medida de la cantidad de luz absorbida por una solucin es el fundamento de la espectrofotometra de absorcin. Por eso es importante trabajar a la longitud de onda a la que la sustancia estudiada absorbe la mayor cantidad de luz (a mayor cantidad de luz, mayor cantidad de sustancia). B. FENMENO DE EMISIN Algunos compuestos, tras ser excitados por la luz, vuelven al estado fundamental produciendo la emisin de energa radiante. En este caso, lo que se mide es la energa emitida y, en este fenmeno se basa la fotometra de llama o la fluorescencia.

3. LEYES DE ABSORCIN Cuando un haz de luz pasa a travs de un medio, se registra una cierta prdida de intensidad, debido a la absorcin por parte de la sustancia. Se llama TRANSMITANCIA (T) a la relacin entre la luz incidente y la luz transmitida: T = Is / I0 ; %T = (Is / I0 ) x 100. Se puede perder intensidad por la interaccin con la cubeta o el solvente. Para evitar este error se hace una primera medida con una solucin de referencia o BLANCO, que contiene todos los posibles compuestos que intervienen en la lectura menos el que vamos a medir. Todas las medidas que se hagan con posterioridad sern referidas a esta medida inicial y se harn en la misma cubeta que se utiliz en la medida del blanco. La Transmitancia se usa poco, se emplea ms la Absorbancia (A) porque la relacin entre A y la concentracin de una solucin es directamente proporcional y la de la T es inversamente proporcional. La relacin entre la absorbancia y la transmitancia es la siguiente: - Si el %T = 100 - Si el %T = 0 A = 2-log T = 2-log 100 = 0 A = 2-log 0 =

En los aparatos que se usan actualmente se presentan absorbancias, pero el aparato lo que mide realmente es %T que luego transforma a absorbancia. 3.1. LEY DE BEER La absorbancia de una solucin es directamente proporcional ala concentracin y a la longitud del paso de la luz. A = . b. c Siendo: A: absorbancia. No tiene unidades. el coeficiente de extincin molar, tambin llamado coeficiente de absorcin. Es constante para un compuesto dado siempre que se fijen condiciones de longitud de onda, de pH, de temperatura, de solventes, etc. Sus unidades son 1/ (mol/cm). b: es la longitud de paso de la luz, en cm. c: es la concentracin del absorbente. Se mide en mol/L.

La aplicacin prctica de la Ley de Beer es, que conociendo la absorbancia de una sustancia podemos averiguar su concentracin y esto lo podemos hacer de dos formas: 1. Por comparacin con una solucin conocida: si tenemos 2 soluciones, una problema (P) y una estndar (S), podemos establecer la siguiente relacin matemtica entre ellas: 2. A travs de una curva de calibracin: la curva de calibracin es la representacin grfica en un eje de coordenadas de la Absorbancia (eje de ordenadas) frente a la Concentracin (eje de abcisas). Se ensayan varias soluciones de concentracin conocida y se determinan sus A, construyndose la curva de calibrado, que es una recta. Una vez ensayadas las soluciones problemas, su concentracin se averigua por interpolacin de las A de las soluciones problema en la curva de calibracin. Hay que tener en cuenta la LINEALIDAD, que es el intervalo de concentraciones del cromgeno entre las cuales existe una relacin lineal entre Absorbancia y Concentracin. Cuando la concentracin del cromgeno sobrepasa los lmites de linealidad se deja de cumplir la Ley de Beer, convirtindose la recta en una curva. La lectura de la Absorbancia fuera de los lmites de linealidad se traduce en una concentracin falsamente baja de cromgeno. En esta situacin, hay que diluir la muestra para que su concentracin entre en los lmites de la linealidad. Empleo de los Factores de Calibracin: Para reactivos estables y sistemas fotomtricos estables, este factor se puede mantener constante, siendo slo necesario ensayar las muestras problema multiplicando la A resultante por el factor F. 4. ESPECTROFOTMETRO Se distinguen dos tipos de aparatos: Fotmetro o Colormetro: se caracterizan porque utilizan filtros que solo permiten el paso de una determinada longitud de onda. Espectrofotmetros: utilizan cromadores. Con ellos se obtiene un haz de luz monocromtico cuya longitud de onda se vara a voluntad. Los monocromadores pueden ser de dos tipos: prismas y redes de difraccin. 4.1 COMPONENTES DEL ESPECTROFOTMETRO 1. Fuente de luz: proporciona energa radiante en forma de luz visible o no visible. Tipos de lmparas: - Lmparas de filamento de tungsteno: se utilizan para longitudes de onda del espectro visible y el ultravioleta prximo. Son fuentes de un espectro continuo de energa radiante entre 360950 nm.

- Lmparas de filamentos de haluros de tungsteno: son de mayor duracin y emiten energa radiante de mayor intensidad. - Lmparas de Hidrgeno y Deuterio: producen un espectro continuo en la regin ultravioleta entre 220-360 nm. - Lmparas de vapores de Mercurio: Emiten un espectro discontinuo o espectro de lneas que se utilizan para calibracin de longitudes de onda, se emplean solo para espectrofotmetros y cromatografa HPLC. 2. Rendija de entrada: tiene como funcin reducir al mximo la luz difusa y evitar que la luz dispersa entre en el sistema de seleccin de longitud de onda. 3. Monocromadores. Pueden ser: - Prismas: son fragmentos con forma de cua de un material que permite el paso de la luz. Ej. De vidrio para trabajar en el espectro visible o cuarzo para trabajar en el ultravioleta lejano. - Redes de difraccin: son un gran nmero de lneas paralelas situadas a distancias iguales entre s y son hendiduras sobre un vidrio o una superficie metlica. Cada una de estas hendiduras se comporta como un pequeo prisma. 4. Rendija de salida: tiene como funcin impedir que la luz difusa atraviese la cubeta de la muestra, que provocara desviaciones a la Ley de Beer. 5. Cubeta: es el recipiente donde se coloca la muestra para la medicin. Pueden ser de distintos tipos y tamaos (cuadradas, rectangulares, redondas). Se obtienen mejores resultados usando cubetas de bordes paralelos. Si se utilizan cubetas redondas se deben marcar e introducir en el aparato siempre en la misma posicin. Suelen estar fabricadas en vidrio o en plstico. 6. Detector. Puede ser de dos tipos: Fotoclulas o clulas fotovoltaicas: Es una lmina de Cobre sobre la que se extiende una capa de Selenio o de xido de Cobre. A sto se le conoce como semiconductor. Sobre el semiconductor hay una capa de metal transparente que sirve de electrodo. La luz incide sobre el Selenio y ste desprende electrones, que pasan a la placa de Cobre originando una diferencia de potencial por existir carga negativa sobre el Cobre y positiva sobre el Selenio. El conjunto se conecta a un ampermetro que seala el paso de corriente. Caractersticas: son resistentes; econmicas; sensibles desde el ultravioleta hasta los 1.000 nm. de longitud de onda; no se requiere batera externa, ni vaco,...; la corriente producida es directamente proporcional a la Energa que llega y tienen efecto fatiga, es decir, que presentan una subida inicial de corriente, que luego decrece progresivamente hasta el equilibrio. Por eso hay que esperar entre 30-60 segundos entre una lectura y otra.

Fototubos multiplicadores: Un fototubo multiplicador es un tubo que contiene un ctodo que emite electrones de forma proporcional a la Energa que incide sobre l. Tiene un nodo que recoge los electrones y la corriente se multiplica varias veces al chocar los electrones sobre sucesivos nodos que van teniendo un voltaje superior al precedente. La seal se amplifica en cientos o miles de veces. Caractersticas: el tiempo de respuesta es muy rpido, no tienen efecto fatiga tan altos como la anterior y son muy sensibles. 7. Medidor: son sistemas de lectura de la Energa elctrica que recoge el detector y que puede ser lectura directa (se utiliza una clula fotovoltaica) o puede ser amplificadores de seal como en el caso del fototubo multiplicador. Los actuales aparatos incorporan lectura digital y clculos automticos de concentraciones con relacin a las curvas de calibracin.

III. MATERIALES Y MTODOS


A) MATERIALES Materia prima vegetal *Zanahoria *Beterraga *Espinaca Acetona Espectrofotmetro Tubos de ensayo Pizetas con agua destilada Morteros Pipetas 10 mL Pipetas 5 mL Embudos Probetas 10 mL Matraces 250 mL Esptulas Cuchillos Tablas de picar Papel filtro Papel toalla

B) MTODOS * Se procedi a acondicionar las muestras en nuestro caso la zanahoria a la cual se pic en trozos muy pequeos para despus triturarlos o machacarlos en un mortero a la cual para esta muestra se le agreg una determinada cantidad de agua que es la solucin extractora de pigmentos , luego que se obtuvo un poco del jugo de la zanahoria se procedi a filtrarlo y poder as obtener el lquido de la zanahoria puro y finalmente verterlo en un tubo de ensayo para llevarlo al espectrofotmetro y hacer las lecturas correspondientes. *Se extrajo el jugo de la muestra de beterraga machacndola en un mortero al que se le agreg acetona, luego se procedi a filtrar la solucin y obtener el lquido libre de slidos para colocarlo en un tubo de ensayo y llevarlo a la lectura en el espectrofotmetro. *Se acondicion la muestra de espinaca, como en los dems casos, se machac en un mortero y se le agrego agua como solucin extractora, luego se filtr el lquido puro y se coloc en un tubo de ensayo para llevarlo al espectrofotmetro.

IV. RESULTADOS Y DISCUSIN


A) RESULTADOS Cuadro 1. Datos Curva Espectral Muestra: Beterraga Abs 1.023 0.628 0.516 0.437 0.360 0.342 0.297 0.291 0.287 0.299 0.327 0.370 0.433 0.520 0.639 0.786 0.937 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 Abs 1.105 1.287 1.380 1.495 1.718 1.970 2.143 2.110 1.881 1.556 1.134 0.735 0.423 0.240 0.140 0.091 470 480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 610 620

Cuadro 2. Datos Curva Espectral Muestra: Zanahoria Abs 2.484 2.142 2.089 2.091 2.007 1.987 2.035 2.002 2.007 1.822 1.839 1.768 1.661 1.607 1.584 1.541 1.474 1.388 1.322 1.271 1.229 1.164 1.132 1.106 1.086 1.056 1.032 1.010 0.987 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 610 620 630 640 650 660 Abs 0.966 0.944 0.925 0.905 0.888 0.871 0.855 0.839 0.825 0.810 0.796 0.783 0.770 0.757 0.746 0.734 0.720 0.711 0.698 0.683 0.673 0.662 0.652 0.643 0.634 0.625 0.616 0.606 0.598 670 680 690 700 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 910 920 930 940 950

Cuadro 2. Datos Curva Espectral Muestra: Espinaca Abs 0.910 0.849 0.789 0.700 0.664 0.602 0.535 0.523 0.425 0.339 0.296 0.271 0.255 0.241 0.230 0.218 0.208 0.200 0.193 0.183 0.177 0.171 0.165 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 610 620 Abs 0.159 0.161 0.164 0.170 0.148 0.125 0.116 0.112 0.107 0.103 0.099 0.096 0.093 0.090 0.087 0.084 0.081 0.079 0.078 0.076 0.074 0.072 0.070 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 810 820 830 840 850

GRFICO N 1: Espectro de Pigmentos de la Betarraga


2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 200 400 600 800 Series1

GRAFICO N2: Espectro de pigmentos de la Zanahoria

3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 200 400 600 800 1000

Series1

GRFICO N 3: Espectro de pigmentos de la Espinaca.

1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 200 400 600 800 1000 Series1

B) DISCUSIN De acuerdo con los resultados obtenidos y con la posterior elaboracin de las graficas correspondientes pudimos observar que en las tres graficas, de betarraga, zanahoria y espinaca, se puede observar un pico, que tomaremos como el valor mximo de absorvancia que poseen los pigmentos. De los tres resultados el ms claro de todos y del que podemos tener un valor ms exacto y preciso es el de la betarraga, que segn la teora la curva debe empezar aumentando, llegar a un pico para luego empezar a disminuir, en este caso empez disminuyendo para luego aumentar alcanzando un pico de: 2.143 abs. y de : 530 nm. Con respecto a la espinaca y zanahoria si bien no empiezan aumentando sus valores conforme iba aumentando la longitud de onda; se puede apreciar en el caso de la espinaca un pico si bien es corto, lo podemos tomar en cuenta como la absorvancia mxima del pigmento de 0.170 abs en una de 660 nm. En el caso de la zanahoria es ms difcil poder apreciar el valor mximo del pigmento por la gran variabilidad de la absorvancia y la constante de disminuir conforme la longitud de onda vaya aumentando V. CONCLUSIONES Se lleg a determinar la absorbancia de los diferentes pigmentos segn la muestra para distintas longitudes de onda. Se lleg a graficar el espectro de los pigmentos naturales y ubicar el punto de mayor absorbancia. VI. BIBLIOGRAFA _Citado el 22.04.2011 (on line) disponible en: http://perso.wanadoo.es/sergioram1/espectrofotometria.htm _Citado el 22.04.2011 (on line) disponible en: http://www.articuloz.com/tecnologia-articulos/definicion-y-componentes-de-un espectrofotometro-3185679.html _Citado el 22.04.2011 (on line) disponible en: www.itescam.edu.mx/principal/sylabus/fpdb/.../r22541.DOC