UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

LA MOLINA

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA

CURSO: QUÍMICA ANALÍTICA – LABORATORIO
INFORME DE PRÁCTICA N0 9

TÍTULO: ESPECTROSCOPIA DE ABSORCION MOLECULAR UV-VIS

DETERMINACION DE ABSORTIVIDAD MOLAR Y LONGITUD DE
ONDA DE MAXIMA ABSORBANCIA

Alumno Código Firma

Allcahuaman Matienzo, Katy Lucía 20160425
Espíritu Canchanya, Oscar Andrés 20160436
Vera Carrasco, Alexandra Fiorella 20160462
Yucra Palacios, Milagros Yenifer 20160465

Facultad y especialidad: Industrias Alimentarias

Horario de práctica (día y hora): lunes, 11am – 1pm
Apellidos y nombres del profesor de laboratorio: Alegría Arnedo, María Cecilia
Fecha de práctica: 02-04-18
Fecha de entrega del informe: 09-04-18

LA MOLINA – LIMA – PERÚ

 1. INTRODUCCIÓN
a) Justificación:
En este trabajo se aprende a utilizar un espectrofotómetro para hallar la la máxima absorbancia
de la sustancia KMnO4 al probar diferentes valores de longitud de onda. Así, al obtener el
espectro de absorción del analito se halla la absorbancia de una muestra que contiene al analito
en la longitud de onda de máxima absorción.

b) Objetivos:
- Calcular en un cromóforo la absortividad molar y la longitud de onda de máxima absorbancia

c) Hipótesis:
- La absorbancia es directamente proporcional a la concentración de las sustancias, se calcula
con la absortividad molar y varía con la longitud de onda (de máxima absorbancia).

2. MARCO TEÓRICO

Espectroscopia de Absorción Molecular UV-VIS

Esta técnica se basa en la absorción, por parte del analito, de radiación electromagnética de la
región ultravioleta (UV) y visible del espectro. La radiación ultravioleta corresponde a longitudes
de onda desde 10 a 380 nm aproximadamente. En la espectroscopia UV se hace uso únicamente
de la región denominada ultravioleta próximo, de 180 a 380 nm, ya que la radiación UV entre 10
y 180 nm (UV lejano) es absorbida por el oxígeno del aire, por lo que se hace necesario llevar a
cabo las medidas en ausencia de este gas, lo que resulta en un mayor grado de complejidad
instrumental. Por otro lado la región visible del espectro se extiende desde los 380 a los 780 nm.

Figura 1: Espectro electromagnético.

La energía asociada a la radiación UV-visible es de magnitud suficiente como para ser absorbida
en transiciones entre niveles energéticos electrónicos. La energía absorbida se disipa
posteriormente en forma de calor. El proceso que tiene lugar se puede representar mediante la
siguiente expresión:
𝐴 + ℎ𝑣 → 𝐴∗ → 𝐴 + 𝑐𝑎𝑙𝑜𝑟

Donde A y A* representan respectivamente a una especie química en estado fundamental y la

misma en estado excitado. El producto hv, donde h es la constante de Planck y v la frecuencia
de la radiación electromagnética incidente, es una forma habitual de representar la energía
correspondiente a dicha radiación.
Cuando la radiación electromagnética incide sobre la materia, ésta absorbe aquellas frecuencias
que proporcionan la energía exacta que corresponde a una transición desde el estado
fundamental a uno o más de los posibles estados excitados.
Un espectro de absorción representa la distribución de la energía absorbida por una especie
química en función de la frecuencia o longitud de onda de la radiación involucrada en el proceso.
Las diferencias energéticas entre el estado fundamental y los estados excitados son únicas para
cada especie, por lo que el análisis de las frecuencias absorbidas aporta información sobre la
identidad de los constituyentes de una muestra.
Por otro lado, la cantidad de energía transferida desde una determinada radiación
monocromática a una especie química concreta depende de la concentración de esta especie
en la muestra analizada. Esta relación proporciona un medio para cuantificar la presencia de un
determinado analito.
La medida de la intensidad (o potencia) de la radiación que ha sido absorbida se realiza
indirectamente a partir de la intensidad (o potencia) de la radiación incidente (I 0) y de la
transmitida (It) a través de la muestra. Para ello es necesario definir dos términos que se
relacionan con los anteriores: la transmitancia y la absorbancia.
La transmitancia se define como la relación entre la intensidad transmitida y la incidencia, siendo
habitual también expresarla como porcentaje:
𝐼 𝐼
𝑇 = 𝑡 O bien: 𝑇(%) = 𝑡 × 100
𝐼0 𝐼0

La absorbancia se define de la siguiente forma:

1
𝐴 = log = 2 − log 𝑇 (%)
𝑇
Es decir, a medida que la energía se transfiere desde la radiación electromagnética a la materia
se produce una disminución de la transmitancia y un aumento de la absorbancia.
Ley de Lambert-Beer
En el caso de que se considere una radiación monocromática se verifica que la absorbancia es
directamente proporcional a la concentración de la especie responsable de la absorción. Esta
relación se conoce como Ley de Lambert-Beer y se representa matemáticamente con la siguiente
ecuación:
𝐴 =𝜀×𝑙×𝑐

 Ɛ representa la absorbancia específica o absortividad de la especie que absorbe.

Depende de la naturaleza del cromóforo y de las condiciones experimentales (disolvente,
temperatura, pH,…); por eso, aunque estos valores se pueden encontrar tabulados para
muchas sustancias químicas, se hace necesario un calibrado analítico para determinar
exactamente la relación entre la absorbancia y la concentración del analito en las
condiciones del análisis.
 L es el paso óptico: longitud atravesada por la radiación electromagnética a través del
medio absorbente.
 C es la concentración de la especie absorbente (o del cromóforo).

Espectrofotómetro
Es el equipo que utilizamos para medir la absorción o transmisión de luz por parte de una
muestra. Consta de los siguientes partes:

 Fuente de luz: suele ser una lámpara que emite una luz (por incandescencia de un
filamento) policromática, es decir que contiene distintas longitudes de onda con distintas
intensidades, I0.
 Sistema óptico: a través de filtros, lentes y redes de difracción se focaliza el haz de luz y
se selecciona una longitud de onda fija.
 Compartimiento muestra: es donde se coloca la muestra, con un espesor conocido,
normalmente disuelta y en una cubeta de 1cm de paso óptico, sobre la que se hace
incidir el haz de luz monocromática.
 Sistema óptico: recibe la luz transmitida por la muestra, la focaliza y selecciona por
longitudes de onda.
 Detector: recibe la señal de la intensidad de la luz transmitida a cada longitud de onda y
la transforma en señal eléctrica que un ordenador pueda procesar.
 Figura 2: Componentes de un Espectrofotómetro.

Recta de calibrado
Seleccionando la longitud de onda máxima a la que absorbe una sustancia y utilizando unas
muestras patrón, de concentración conocida puedo obtener los datos de absorbancia frente a
concentración, A vs [ ] , que debidamente representados dan lugar una recta (Ec. Lambert-Beer)
de calibrado. A través de una recta de calibrado este método nos sirve como análisis cuantitativo
de una sustancia determinada.

Figura 3: Representación gráfica de una curva de calibración.

Para una muestra de concentración desconocida tan solo hay que medir su absorbancia a la
longitud de onda del máximo y extrapolar en la curva de calibrado el valor de la concentración.
Espectro de absorción de una sustancia
Es el gráfico que resulta de relacionar la absorbancia o absortividad molar de una sustancia en
un rango de longitudes de onda.
Espectro de absorción de una sustancia en el rango visible:
Figura 4: Espectro de Absorción: (a) Agua – naranja de xilenol; (b) Zn – naranja de
xilenol.

3. MATERIALES Y METODOLOGÍA
3.1. Requerimientos:
- Laboratorio de química con suministros de agua, energía, desagüe, materiales y
equipo de laboratorio.

- Materiales por mesa

o Pipetas volumétricas de 1,2 5 y 10ml
o Pipetas graduadas de 10ml
o Tubos de ensayo (6 por cada mesa)
o Vaso de precipitado de 100ml
o Vaso de precipitado de 50ml
o 1 piceta con agua destilada
- Reactivos
o Disolución estandarizada de KMnO4 0.02M
o Di solución de H2SO4 0.25M
o Muestras coloreadas (indicadas por el profesor)
- Equipos
o Balanza analítica
o Espectrofotómetro UV-VIS
o Cubetas de plástico o vidrio y cuarzo

3.2. Métodos y procedimiento experimental:

3.2.1. Indicar los colores observados y absorbidos por sustancias coloreadas
- Observar el color de cada una de las muestras indicadas por el profesor y completar
el cuadro de la tabla 1.
3.2.2. Elaborar el espectro de absorción
- Preparar una solución de concentración que cumpla con la ley de Lambert y Beer.
- Completar la tabla 2.
3.2.3. Construcción de una curva de calibración
- Construir la curva de calibración.
- Completar la tabla 3.
3.2.4. Balance de masa de entradas y salidas de materiales
- Identificar y clasificar los residuos generados y disponerlos en los recipientes que
corresponden. Elaborar un esquema de elementos de entrada y salida para cada
experimento o ensayo realizado.
 4. RESULTADOS

Tabla 1: Espectro de absorción: absorbancia vs longitud de onda

Longitud de onda λ Absorbancia de la Absorbancia de la Absorbancia de la

(mn) muestra 2 (A2) muestra 4 (A4) muestra 6 (A6)
500 0.043 0.166 0.152
505 0.049 0.129 0.181
510 0.052 0.133 0.192
515 0.051 0.132 0.192
520 0.058 0.145 0.219
525 0.066 0.158 0.249
530 0.064 0.154 0.243
535 0.058 0.142 0.219
540 0.059 0.144 0.233
545 0.064 0.152 0.242
550 0.058 0.143 0.223
A una absorbancia máxima se encuentra una longitud de onda máxima (λ máx = 525nm).
0.3

0.25
Absorbancia (A)

0.2

0.15 Series1
Series2
0.1

0.05

0
490 500 510 520 530 540 550 560
Longitud de onda (λnm)

Figura: Espectro de absorción (Absorbancia (A2, A4, A6) vs longitud de onda).

Fuente: propia.

Tabla 2: Curva de calibración

A una longitud de onda máxima (λ máx = 525nm).
Preparación de estándares a partir de la solución madre (stock) de KMnO 4 de 0.02M.
Solución madre (1/100): 0.02 x 1 = C x 100
C = 2x10-4

Soluciones estándares
C0 C1 C2 C3 C4 C5 C6
Soluciones 0 0.5 1 2 3 4 5
estándares (mL)
H2SO4 (mL) 10 9.5 9 8 7 6 5
Volumen total (mL) 10 10 10 10 10 10 10
 Soluciones Concentraciones Absorbancia Transmitancia
estándares
C0 (blanco) 0 0 0
C1 1x10-5 0.010 0.977
C2 2x10-5 0.065 0.861
C4 6x10-5 0.157 0.697
C5 8x10-5 0.216 0.608
C6 1x10-4 0.248 0.565

0.3

0.25
Absorbancia (A)

0.2
Series1
0.15

Ecuación de regresión
0.1
y = 2584.43x – 0.0003
0.05
R2 = 0.9889
0
0 0.00002 0.00004 0.00006 0.00008 0.0001 0.00012
Concentración estándar

Figura 2: Curva de calibración (Absorbancia vs concentraciones estándares).

Fuente: propia.

1.2

1
Transmitancia (T)

0.8

0.6
Series1
0.4

0.2

0
0 0.00002 0.00004 0.00006 0.00008 0.0001 0.00012
Concentración estándar

Figura 3: Curva de calibración (Transmitancia vs concentraciones estándares).

Fuente: propia.

Muestra problema (KMnO4) de los 5 grupos

G1 G2 G3 G4 G5
Muestra problema 2 3 4 5 6
(mL)
H2SO4 (mL) 8 7 6 5 4
Volumen total (mL) 10 10 10 10 10
 Grupos Absorbancia Concentraciones de KMnO4
(ppm)
G1 0.248 0.4533
G2 0.339 0.4376
G3 0.449 0.4408
G4 0.550 0.4259
G5 0.674 0.4349

5. DISCUSIÓN
La espectroscopia de absorción es la medida de la cantidad de luz absorbida por un compuesto
en función de la longitud de onda de la luz.
En general, e irradia una muestra con una fuente de luz y se mide la cantidad de luz transmitida
a varias longitudes de onda, utilizando un detector y registrando el
fenómeno en un gráfico. Al contrario que en los ensayos químicos, la mayoría de las técnicas
espectroscópicas no son destructivas, es decir, no destruyen las muestras durante el análisis; se
pueden realizar diferentes tipos de espectros sin pérdida o perdiendo muy poco de muestra
(Bermejo, R.2014).
El espectro de absorción es obtenido variando la longitud de onda de la radiación que incide
sobre la muestra y midiéndose la cantidad de radiación absorbida en un espectrofotómetro.

En la práctica de laboratorio determinamos la gráfica de espectro de absorción, usando varias

longitudes de ondas hallando sus respectivas absorbancias con la finalidad de determinar la
absorbancia máxima y la longitud de onda máxima (λmáx) que fue de 525 nm con absorbancias
de 0.066, 0.158 y 0.249.

Los métodos espectrofotométricos cumplen la ley de Lambert- Beer, indica que la absorbancia
de una sustancia es directamente proporcional a su concentración (Bermejo, R.2014).

Para realizar este análisis deben seguirse pasos o etapas como:

 Selección de la longitud de onda: Se trabaja a la longitud de onda máxima en la que la
absorbancia de la sustancia analizada es máxima. Así se consigue una mayor
selectividad.
 Determinación de la concentración estándares y la absorbancia de estas (curva de
calibración): Tras una preparación adecuada de la muestra, se determina
experimentalmente la relación absorbancia concentración. Lo habitual para esta
determinación es usar varias disoluciones patrón, preparadas en las mismas condiciones
que la muestra, y medir su absorbancia, obteniendo la recta de calibrado (Bermejo,
2014).

En el laboratorio utilizamos la solución de permanganato de sodio de 0.02 M (solución madre)

que por ser muy concentrada se hace su primera dilución a 0.0002 M con un volumen final de 10
mL usando el disolvente de ácido sulfúrico 0.025M que no reaccionara con nuestra sustancia
absorbente. A la longitud de onda máxima 525 nm se obtuvo la curva de calibración con un R2 =
0.984, este resultado es menor al valor normal, se desvía de la ley de Lambert Beer. Esta
desviación puede ser por diferentes factores de error.

6. CONCLUSIONES
 Para hallar la longitud de onda de máxima absorción se necesita probar varias de ellas,
con el fin de postearlas en una gráfica y ver el punto máximo de la curva que se forme.
 La absorbancia es la capacidad que tiene algunos compuestos para absorber la
radiación electromagnética, pudimos observar cómo, dependiendo de la concentración
y la longitud a la cual se le aplique un rayo, puede alcanzar un punto máximo de
absorción.
  Según la concentración varia la absorbancia del compuesto, variando la cantidad de
solvente (Siendo agua destilada) se puede disminuir la absorbancia.
 Para construir la curva de calibración es necesario hacer varias soluciones con
concentración conocida a partir de una solución con el analito, y además se necesita el
blanco.
 Se logró confirmar la hipótesis ya que la absortividad molar y la longitud de onda de
máxima absorbancia depende de cada sustancia y varía con la longitud de onda,
además esta absorbancia es directamente proporcional con la sustancia absorbente
que se tiene como analito a una determinada longitud de onda.
 En esta curva de calibración el gráfico presenta ondulaciones con máximos y mínimos,
para hacer las determinaciones cuantitativas, se elige en general longitud de onda
correspondiente a un máximo, pues el error de medición es mínimo y la sensibilidad es
máxima.
 Por medio de esta práctica se logró familiarizarse y aprender el uso correcto y manejo
del espectrofotómetro de absorción UV-visible por medio de sustancias que presentan
color y que por medio de la espectrofotometría se puede observar su región de
absorbancia en determinada longitud de onda que nosotros podemos manejar de
acuerdo a nuestras necesidades, así como lograr determinar en qué región se encuentra
determinado compuesto si es que este es desconocido, ayudándonos también al
graficarlo para facilitar la determinación del mismo.

7. RECOMENDACIONES

 Limpiar las cubetas con papel tissue para que evitar el error.
 Hacer repeticiones en las medidas para determinar el espectro de absorción.
 Se debe verificar que el equipo esté debidamente calibrado para que el error disminuya.
 Ingresar al laboratorio con los implementos adecuados, ya sea tanto con guantes como
con la bata.
 Verificar que los compuestos con los que se trabajen estén estandarizados y diluir de
manera exacta la cantidad que se pida.
 Manejar el espectrofotómetro de manera indicada por la profesora para evitar
descalibrar el equipo.

8. BIBLIOGRAFÍA

 ANEXO I: ESPECTROSCOPÍA ULTRAVIOLETA-VISIBLE. (s.f.). Obtenido de Conceptos

Previos: http://ocw.uc3m.es/ingenieria-quimica/quimica-ii/practicas-1/PR-F-
Anexos.pdf
 Bermejo Moreno, R., & Moreno Ramirez, A. (2014). Análisis Instrumental. Madrid:
Editorial Síntesis.
 Brown, Glenn H., and Eugene M. Sallee.(1967). Química cuantitativa . Reverté.
Barcelona, España. 759 p.
 Christian, G. D. 2009. Química analítica . Sexta edición. Mc Graw Hill. México. p 379.
 Villegas Casares, W. , Acereto Escoffié, P. , Vargas Quiñones, E. (2006). Guía Para El
Maestro en Las Prácticas de Laboratorio. Universidad Autónoma de Yucatán. Yucatán,
México. 27 p
 Skoog, Douglas A., and Donald M. West. . 2015. Fundamentos de química analítica .
Novena edición. Cengage Learning Editores, S.A. Santa Fe, Colombia. 960 p.
 ZAMARRIPA, J. 2012. La constante de Planck .

9. CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es el propósito e hipótesis de la práctica 9?

Propósito: Calcular la absortividad molar y longitud de onda de máxima absorbancia de un
cromóforo a partir de un espectro de absorción. Así como construir una curva de calibración.

Hipótesis: La absortividad molar y la longitud de onda de máxima absorbancia depende de cada

sustancia y varía con la longitud de onda. La absorbancia varía en forma directamente
proporcional con la concentración de la sustancia absorbente a una determinada longitud de
onda.

2. ¿Cree usted que ha logrado esta competencia?

Consideramos que sí, ya que la práctica ha sido previamente sustentada con la teoría llevada en
el curso, se tuvo cuidado al manipular el espectrofotómetro y se entendió su uso e importancia
de estudio para el análisis.

3. Explique la espectroscopia de absorción molecular UV-VIS. Aplicaciones

La espectroscopia de absorción molecular UV-visible es posiblemente la técnica espectroscópica

más empleada. Presenta un amplio campo de aplicación para la determinación cuantitativa de
gran número de especies químicas. Esta técnica es aplicable fundamentalmente a muestras en
disolución. También es posible su aplicación a muestras gaseosas, utilizando para ello celdas
cilíndricas en las que el paso óptico es mucho mayor que en las cubetas para líquidos, e incluso
a muestras sólidas, mediante la técnica de reflectancia difusa. En principio, cualquier especie
química que absorba radiación electromagnética en las regiones ultravioleta o visible es
susceptible de ser determinada por esta técnica. Además, muchas especies no absorbentes
mediante un tratamiento químico adecuado, pueden transformarse en especies absorbentes. Se
puede utilizar para la determinación directa de un gran número de especies orgánicas,
inorgánicas y bioquímicas. La selectividad de esta técnica es en general alta, basándose en la
elección de una longitud de onda en la que únicamente absorba el analito, de forma que no
interfieren otros componentes de la muestra, no siendo necesario en muchos casos realizar
separaciones previas.

4. ¿Qué son los colores complementarios?

El color de una disolución es el complementario del color que la luz que absorbe, así, por ejemplo,
si nos encontramos a una longitud de onda entre 440 y 470nm, lo que realmente absorbe es la
radiación azul, pero visualmente tenemos una disolución color naranja, este vendría a ser el color
complementario.

5. Explique la ley de Lambert y Beer. Defina transmitancia ya absorbancia y ¿Cuál es la

relación entre ellos?

La ley de Lambert y Beer indica que existe una relación lineal entre absorbancia y la
concentración de la sustancia, ya que para un sistema dado, los parámetros ε (absortividad
molar) y l (espesor de la cubeta) se mantienen constantes. Se verifica la relación “a mayor
concentración de la sustancia mayor absorbancia”. Esto es aplicable dentro de ciertos límites,
fuera de los cuales puede presentar desviaciones.

Transmitancia es aquella fracción de la luz incidida que pasa a través de la sustancia y es

detectada por el equipo espectrofotométrico; por su parte la absorbancia es la fracción que si es
absorbida y se puede relacionar estas 2 partes que provienen de un mismo haz de luz como: A=
-logT.

6. A qué se refiere la naturaleza dual de la radiación electromagnética. ¿Cuáles son las

regiones del espectro electromagnético?. ¿Cuál es la ecuación que relaciona la velocidad
de la luz con frecuencia de radiación? ¿Cuál es la ecuación de Plank?

 La radiación electromagnética se concebía como onda hasta que Einstein propuso que
tiene la posibilidad de comportarse como partícula y aveces como onda. Los electrones
pueden tener carácter dual, es decir, que los electrones, aunque se comportan como
 partículas en varios experimentos, pueden comportarse como ondas en ciertas
circunstancias
 Regiones del espectro electromagnético:
Radio, Microondas, Infrarrojo, Luz Visible, Luz Ultravioleta, Rayos X,Rayos Gamma.
 Ecuación de Planck es la que relaciona la velocidad de la luz con frecuencia de radiación.
E=hf

E= Energía

f= Frecuencia

h= Constante de Planck (6.626 x 10-34 J.s)

7. Dibuje los componentes generales de un espectrofotómetro de absorción molecular.

Indique cual es la función de cada uno.

Cubetas de espectofotometría. En un primer plano, dos de cuarzo aptas para el trabajo con luz
ultravioleta; en segundo plano, de plástico, para colorimetría.

Fuente de luz: La fuente de luz que ilumina la muestra debe cumplir con las siguientes
condiciones: estabilidad, direccionalidad, distribución de energía espectral continua y larga vida.

Monocromador: Aisla las radiaciones de longitud de onda deseada o se reflejan desde el

conjunto, se usa para obtener luz monocromática.

Compartimiento de Muestra: Es donde tiene lugar la interacción R.E.M con la materia.

Detector: Es quien detecta una radiación y a su vez lo deja en evidencia, para posterior estudio.

Registrador: Convierte el fenómeno físico, en números proporcionales al analito en cuestión

Fotodetectores: Una serie de fotodetectores perciben la señal en forma simultánea en longitudes

de onda, cubriendo el espectro visible.

8. ¿Qué es un espectro de absorción, como se construye y qué información permite

obtener? Dibuje y explique

Por medio de un espectro de absorción, se determina la longitud de onda óptima de absorción

de una sustancia dada. Cuando se registra un espectro de absorbancia, primero se registra el
espectro de la línea base con las disoluciones de referencia (disolvente puro o blanco) en las dos
cubetas, la línea de base normalmente presenta pequeñas absorbancias positivas y negativas
9. ¿Qué es
una curva de calibración y cómo se construye? ¿Cómo se demuestra si la relación es
lineal o cumple la ley de Lambert y Beer?

Una curva de calibración o curva estándar es uno de los métodos más utilizados para determinar
la concentración de una muestra problema, se determina, experimentalmente, preparando una
serie de soluciones de concentración conocida y midiendo la absorbancia de cada una de ellas
a la longitud de onda de máxima absorbancia.

Se representa gráficamente Abs = f ( c ) el gráfico teórico obtenido mostrará una relación lineal
entre las dos variables, siempre que se trabaje con luz monocromática y a bajas concentraciones.
Sin embargo, en la práctica esta relación se cumple para algunas sustancias, pero para otras no.
Si se trabaja con una sustancia determinada y al medir la absorbancia de distintas
concentraciones de dicha sustancia se obtiene una representación lineal entre las absorbancias
y las correspondientes concentraciones, entonces esa sustancia cumple la Ley de Lambert-Beer
en el rango de concentraciones usadas.