Espectrofotometría de ultravioleta visible

Juan Carlosama; Karen Jaramillo; Angela Guztines; Departamento de Biologia; Universidad de

Nariño

Resumen

El objetivo de esta práctica fue determinar el valor de la absortividad molar en una molécula, y
determinar la concentración de muestras desconocidas a través de la curva de calibración. Para la
curva de calibración con 5 diluciones de KMno4 donde se obtuvo la absorbancia, con la formula
obtenida de la curva de calibración se procedió a calcular la concentración de la muestra
desconocida

Introducción

La espectrofotometría UV-visible es mediante la medición de su absorción

una técnica analítica que permite
determinar la concentración de un
compuesto en solución. Se basa en
que las moléculas que absorben las
radiaciones electromagnéticas y a su
vez que la cantidad de luz absorbida
dependen de forma lineal de la
concentración. Además es usada
para identificar compuestos por su
espectro de absorción y conocer la
concentración de un material o
sustancia, esto último permite, seguir
el curso de reacciones químicas y
enzimáticas así como determinar
enzimas y proteínas incluso ácidos
nucleicos.
Para hacer este tipo de medidas se
emplea un espectrofotómetro, como
ya sabemos es un equipo de
laboratorio que mide la cantidad de
luz que pasa por medio de una
longitud de onda especifica. La
cantidad de luz absorbida por un
medio es proporcional a la
concentración del soluto presente, es
entonces así que la concentración de
un soluto colorido en solución puede
ser determinada en el laboratorio
de luz a una longitud de onda
específica.
Las muestras en estos equipos se
utilizan en estado líquido y se colocan
en el compartimiento de las muestras
de celdas transparentes de diferentes
tamaños y materiales.
En espectroscopia el término luz no
sólo se aplica a la forma visible de
radiación electromagnética, sino
también a las formas UV e IR, que
son invisibles. En espectrofotometría
de absorbancia se utilizan las
regiones del ultravioleta (UV cercano,
de 195-400 nm) y el visible (400-780
nm).
La región UV se define como el
rango de longitudes de onda de 195 a
400 nm. Es una región de energía
muy alta.
En la región visible apreciamos el
color visible de una solución y que
corresponde a las longitudes de onda
de luz que transmite, no que absorbe.
El color que absorbe es el
complementario del color que
transmite.
Por tanto, para realizar mediciones de
absorción es necesario utilizar la
longitud de onda en la que absorbe
luz la solución coloreada.
La fuente de radiación visible suele
ser una lámpara de tungsteno y no
proporciona suficiente energía por
debajo de 320 nm.
La transmitancia(T) de una
sustancia en solución es la relación
entre la cantidad de luz transmitida
que llega al detector una vez que ha
atravesado la muestra y l a
absorbancia (A) es un concepto más
relacionado con la muestra puesto
que nos indica la cantidad de luz
absorbida por la misma,
Ley de Lambert-Beer
Metodología
Análisis de resultados
Tabla 1.
Concentración (M) Absorbancia obtenida (nm)
1x10-4
8x10-5
6x10-5
4x10-5
2x10-5
Muestra PROBLEMA (m6)
Grafica 1.
Esta ley expresa la relación entre
absorbancia de luz monocromática
(de longitud de onda fija) y
concentración de un cromóforo en
solución:
A = log I/Io = ε·c·l
La absorbancia de una solución es
directamente proporcional a su
concentración – a mayor número de
moléculas mayor interacción de la luz
con ellas-; también depende de la
distancia que recorre la luz por la
solución –a igual concentración,
cuanto mayor distancia recorre la luz
por la muestra más moléculas se
encontrará- ; y por último, depende
de ε, una constante de
proporcionalidad -denominada
coeficiente de extinción- que es
específica de cada cromóforo.(1)
0,266
0,224
0,160
0,114
0,064
0,820
Y=mx+b Donde (m) seria εb, (y) seria Absorbancia y (x) seria concentración

Y=2570X+0.0114

Concentración de la muestra problema

0,820 − 0,0114
𝑥= = 3,18𝑥10ˉ⁴𝑚𝑜𝑙/𝐿
2570
Con respecto a la gráfica obtenida los cambios en la linealidad entre la concentración y la
absorbancia son debido a la alta concentración de la solución de KMnO4 con una concentración de
0,0002 M y al tratarse de soluciones diluidas se presentó variación debido al efecto matriz, donde
puede aumentar o reducir la señal de absorbancia y aumentar el porcentaje de error.

Por lo general los iones y los complejos de los elementos de las dos primeras series de transición
absorben bandas anchas de radiación visible al menos en uno de sus estados de oxidación y, por
consecuencia, son coloreados . En este caso la absorción implica transiciones entre orbitales d
ocupados y libres con energía que dependen de los ligandos unidos a los iones metálicos .(2)

Para fines cuantitativos, la absorción por transferencia de carga es de particular importancia

debido que las absortividades molares son muy altas (ε máx.> 10.000). Esta circunstancia permite
tener una sensibilidad muy elevada.(2)

Para calcular la absortividad molar y su porcentaje de error se tomó el mayor pico de absorbancia
y su respectiva concentración, teniendo en cuenta la información hallado en dos artículos para
encontrar el porcentaje de error. 3
0,266
ε = 0,0001mol/L∗1cm = 2660𝐿 𝑚𝑜𝑙ˉ1cm-1

Valor 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑐𝑜 − 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙

%𝐸𝑅𝑅𝑂𝑅 = ∗ 100
valor 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑐𝑜
 2300 − 2660
%error = ∗ 100 = −15,65%
2300

CONCLUSIONES

Preguntas

1. ¿Qué complejos se utilizan para la determinación de fosfatos en muestras de aguas para

análisis ambientales?

Determinación de fosfatos por colorimetría (método amarillo del ácido

vanadomolbdofosfórico). En una solución diluida de ortofosfato, el molibdato amónico
reacciona en condiciones ácidas para formar un heteropoliácido, ácido molibdofosfórico. En
presencia de vanadio forma ácido vanadomolibdofosfórico amarillo. La intensidad del color
amarillo es proporcional a la concentración de fosfatos .

Determinación de fosfatos por colorimetría (método azul del ácido ascórbico). Este método
se aplica a la determinación de P inorgánico u ortofosfatos. Se basa en la reacción en medio
ácido entre el anión fosfato y el molibdato amónico en presencia de tartrato de K y Sb, para
generar ácido fosfomolíbdico el cual es reducido mediante ácido ascórbico generando una
coloración azul debida al Mo y susceptible de determinación colorimétrica.

Método colorimétrico del fósforo total. La digestión con persulfato amónico de la muestra
convierte la mayoría de compuestos orgánicos de P, polifosfatos, hexametafosfatos y fosfitos
inorgánicos en ortofosfatos susceptibles en las determinaciones colorimétricas explicadas en
los puntos anteriores. (3)

2. Consulte cuales técnicas son usadas para la determinación de la capacidad antioxidante de

compuestos o extractos usando espectrofotometría UV-Visible. ¿Cuáles son las longitudes
de onda de los máximos de absorción que se utilizan?

Método ABTS

Según la metodología desarrollada por RE et al. [38] y descrita por KUSKOSKI et al. [25] el radical
ABTS•+ se obtiene tras la reacción de ABTS (7 mM) con persulfato potásico (2,45 mM,
concentración final) incubados a temperatura ambiente (±25ºC) y en la oscuridad durante 16 h.
Una vez formado el radical ABTS•+ se diluye con etanol hasta obtener un valor de absorbancia
comprendido entre 0,70 (±0,1) a 754 nm (longitud de onda de máxima absorción). Las muestras
filtradas (antocianos) se diluyen con etanol hasta que se produce una inhibición del 20 al 80%, en
comparación con la absorbancia del blanco, tras añadir 20 µL de la muestra. A 980 µL de dilución
del radical ABTS•+ así generado se le determina la A754 a 30ºC, se añade 20 µL de la muestra
(dilución de antocianos) y se mide de nuevo la A754 pasado 1 minuto

Método DPPH

Este método, desarrollado por BRAND-WILLAMS et al.[6], se basa en la reducción de la

absorbancia medida a 515 nm del radical DPPH•, por antioxidantes. Con modificaciones el método
descrito por KIM et al.[23], se basa en la medida de la absorbancia del radical DPPH• 100 µM (3,9
mL) disuelto en metanol al 80%, a la longitud de onda de 517 nm. Se añade 0,1 mL de la muestra
o patrón, la mezcla se homogeniza cuidadosamente, y se mantiene en la oscuridad durante 30
minutos. Las medidas de absorbancia a 517 nm se realizan antes de añadir la muestra (A0) y
pasados los 30 y 60 minutos (Af). La concentración de DPPH• en el medio de reacción se calcula a
partir de una curva de calibrado obtenida por regresión lineal.

Método DMPD

Se determina la actividad antioxidante aplicando el método propuesto por FOGLIANO et al. [11].
Este se basa en añadir 1 mL de la disolución de DMPD 100 mM a 100 mL de disolución tamponada
con ácido acético/ acetato de sodio 0,1 M (pH 5,25). Tras la adición de 0,2 mL de una disolución de
cloruro férrico 0,05 M (concentración final de 0,1 mM) se forman radicales cationes coloreados
(DMPD•). Un mililitro de esta disolución se traslada a una cubeta midiéndose su absorbancia,
comprendida entre 0,90 (±0,1), a 506 nm. Se añade 50 µL de una disolución patrón de
antioxidante o de muestras diluidas y transcurridos diez minutos (a 25ºC) se hace otra medida de
absorbancia a 506 nm. (4)

Referencias Bibliografícas

1. https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETRIA.pdf

2. Skoog D., West D., Holler F.J., Crouch S. Fundamentos de Química analítica. Novena edición.
Edit Cengage Learning. México. 2015.

3. Bustos, D,Contenido de antocianinas en líneas de trigo púrpura (Triticum aestivum L.). Efecto
del genotipo y del calibre de grano y desarrollo de métodos indirectos de cuantificación.
UNIVERSIDAD AUSTRIAL DE CHILE---determinación conductimétrica de TDS y Valoración
conductimétrica, Universidad Agraria La molina.

”
4.VALIDACIÓN DE LA METODOLOGÍA ANALÍTICA PARA LA DETERMINACIÓN DE FÓSFATO EN AGUA
POTABLE POR ESPECTROFOTOMETRÍA ULTRAVIOLETA-VISIBLE-MÉTODO DEL AZUL DE MOLIBDENO
CON ÁCIDO ASCÓRBICO; JAIRO E. MERCADO CAMARGO, Q.F. Msc; Universidad de Cartagena

5.Aplicación de diversos métodos químicos para determinar actividad antioxidante en pulpa de

frutos ; Revista de ciencia tecnología de alimentos vol.25 no.4 Campinas Oct./Dec. 2005