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Aislamiento de Bacterias y Arqueobacterias

termófilas de aguas termales de Paipa Boyacá con


potencial enzimático para la degradación de aceite
de cocina usado
Acevedo P. Ernesto J.1, García H. Israel R.2, Rojas C. Daniela S.3, Rueda C. Sergio D.4
1: ernesdjes@hotmail.com, 2: richar_2110@hotmail.com, 3: Daniela_stefan_rojas@hotmail.com,
4: sdavidrc97@gmail.com
1, 2, 3, 4: Estudiantes de Microbiología industrial, Facultad de ciencias exactas, físicas y naturales,
Universidad de Santander (UDES), Bucaramanga-Santander, Colombia

Resumen
Las aguas termales son aguas ricas en minerales y con temperaturas más altas que la temperatura del lugar de donde brotan. Las
aguas termales de Paipa tienen una temperatura aproximada de 60°C, alcalinas, bicarbonatadas y altamente ricas en azufre; abarcan
una diversidad microbiana en donde viven bacterias Extremófilas y arqueas las cuales son consideradas importantes en la industria por
la producción de enzimas termoestables. Las lipasas y esterasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de ácidos grasos que
constituyen el 5% de los aceites de cocina usados y que son potencialmente contaminantes de tuberías cuando se desechan después
de haberse utilizado con fines domésticos. El objetivo de este proyecto fue aislar e identificar preliminarmente por pruebas bioquímicas
y microbiológicas Arqueobacterias termófilas con potencial enzimático para la degradación de aceite de cocina usado a partir de una
muestra de agua termal del municipio de Paipa en el departamento de Boyacá. Para la realización de este estudio las muestras fueron
tomadas de tres pozos de aguas termales en Paipa-Boyacá, posteriormente se realizó aislamiento en agar nutritivo, se identificaron los
microrganismos aislados por pruebas bioquímicas y tinción de Gram, y finalmente se evaluó la producción de lipasas utilizando aceite
quemado de cocina al 0.5%v/v en agar nutritivo. Los nueve microrganismos aislados son presuntivamente bacterias Extremófilas y
arqueas, éstas últimas en mayor proporción; todos los microrganismos aislados tuvieron la capacidad de crecer en medio con aceite de
cocina quemado como única fuente de carbono lo cual se considera potencial en la producción de enzimas termoestables para ser
utilizado en industrias y procesos de biorremediación en suelos y aguas contaminados con grasas.

Abstract
The hot springs are mineral rich waters with temperatures higher than the temperature of the place where they sprout. The the rmal
waters of Paipa have an approximate temperature of 60 ° C, alkaline, bicarbonated and highly rich in sulfur; Encompass a microbial
diversity where Extremophilic and Archaea bacteria live which are considered important in the industry for the production of thermostable
enzymes. Lipases and esterases are enzymes that catalyze the hydrolysis of fatty acids which make up 5% of used cooking oils and
which are potentially contaminants of pipes when disposed of after being used for domestic purposes. In order to carry out this study,
the samples were taken from three thermal water wells in Paipa-Boyacá, nutrient agar isolation was performed, microorganisms isolated
by biochemical tests and Gram staining were identified and lipase production was finally evaluated Using 0.5% v/v cooking oil burned on
nutritive agar. The nine microorganisms isolated are presumably Extremophilic and Archaea bacteria, the latter in greater proportion; All
isolated microorganisms had the capacity to grow in medium with cooking oil burnt as the only source of carbon which is considered
potential in the production of thermostable enzymes to be used in industries and processes of bioremediation in soils and water
contaminated with fats.

Palabras clave: Lipasas, Bacterias termófilas, Degradación de aceite, Arqueas.

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Aislamiento de Bacterias y Arqueobacterias termófilas de aguas termales de Paipa Boyacá con potencial enzimático
para la degradación de aceite de cocina usado
Introducción de las arqueas y las bacterias extremófilas es muy alto, al tener
enzimas capaces de soportar estas condiciones, se hacen
Las aguas termales son aguas minerales que se encuentran en indispensables en la industria en las que se necesitan este tipo
el seno de la tierra y emanan del suelo con una temperatura de enzimas estables a temperaturas altas, por ejemplo. Una de
5°C más alta que la temperatura media anual del lugar de las principales enzimas de interés industrial son las lipasas. Las
donde surge. Proceden de capas subterráneas de la tierra que lipasas (glicerol-éster hidrolasas) son enzimas que catalizan la
se llenan por acuíferos subterráneos, se calientan y evaporan hidrólisis de los enlaces éster presentes en los acilgliceroles in
y se condensan cuando llegan a la superficie. Las aguas de vivo. Además, pueden catalizar la hidrólisis o síntesis de un
Paipa son clasificadas como hipertermales por poseer grupo amplio de ésteres carboxílicos (Bornscheuer et al. 1994).
temperaturas en algunos pozos que superan los 60°C, Estas enzimas están ampliamente distribuidas en la
pertenecen al grupo de las aguas alcalinas, sulfatadas, naturaleza, y se encuentran en microorganismos, plantas y
cloruradas y bicarbonatadas, contienen carbonato de animales (Bouzas, barros y González, 2006).
magnesio, cloruro de litio, arsénico, estroncio, ácido fosfórico,
ácido sílico, ácido sulfhídrico, ácido carbónico, nitrógeno, El agua es un reservorio natural de microrganismos y que al
oxígeno, hidrógeno, helio y emanación radioactiva con altos ser contaminado con sustancias tóxicas se genera un
contenidos de sodio y carbonato de calcio. (Barco y Méndez, desequilibrio ambiental. Son los aceites de cocina sustancias
2010) La diversidad microbiana existente en las termales es que se producen a partir de semillas y frutos, químicamente
más grande de lo que se cree, estos ambientes extremos son son lípidos formado por 95% de glicéridos y 5% de ácido
el hábitat de bacterias extremófilas y Arqueobacterias grasos, esteroles y ceras unidos con enlaces carbono-carbono
(Arqueas) que tienen características especiales que les sencillo, doble y triple y enlaces éster. Pero el que es utilizado
permiten sobrevivir en esos ambientes. Las Arqueas son un para fritar alimentos en los hogares, hotelerías y restaurantes
dominio filogenético de microorganismos que carecen de se desecha por tuberías e inodoros que interrumpen la red de
núcleo diferenciado por una membrana y cuya membrana saneamiento, por esto se consideran potenciales
citoplasmática contiene lípidos con enlaces éter; son capaces contaminantes en efluentes como ríos y lagos. El objetivo de
de sobrevivir en ambientes extremos posiblemente por las este proyecto de aula fue aislar e identificar preliminarmente
condiciones iniciales de la tierra primitiva de donde surgieron; por pruebas bioquímicas y microbiológicas Arqueobacterias
El dominio Arquea dio lugar a una pequeña pero diversa termófilas con potencial enzimático para la degradación de
colección de fenotipos, como metanógenos, halófilos aceite de cocina usado a partir de una muestra de agua termal
extremos, termófilos extremos con metabolismo dependiente del municipio de Paipa en el departamento de Boyacá.
de azufre, y especies termófilas reductoras de sulfato. Las
arqueas tienen propiedades fisiológicas definidas que les Materiales y métodos
conceden propiedades particulares, por ejemplo, tienen
Recolección de muestras
membranas citoplasmáticas características desde el punto de
vista químico, con hidrocarburos ramificados y enlaces éter, a Las muestras de agua fueron tomadas en el municipio de Paipa
diferencia de los ácidos grasos de cadena lineal y enlaces éster en el departamento de Boyacá de los nacimientos naturales de
que se encuentran en las membranas del resto de los demás las aguas termales, lejos de los sitios de entretenimiento. Se
organismos. Algunas forman tetra éteres y tienen membranas recolectaron de 2 formas, primero en termos para garantizar la
en mono capa en lugar de las típicas bicapas lipídicas. En vez preservación del calor y segundo en una cava en frascos de
de peptidoglicano típico del dominio Bacteria, sus paredes 500mL y viales de 10 mL estériles cubiertas con hielo seco.
celulares están formadas por proteínas y glicoproteínas, los
cofactores metabólicos de Arquea difieren de los de Bacteria y
Eucaria y comprenden la coenzima M (que interviene en el
metabolismo de los compuestos de un átomo de carbono, Ci),
el factor F420 (que participa en el transporte de electrones), el
fosfato de 7-mercaptoheptanoiltreonina (que interviene en la
Metanogénesis) y la tetrahidrometanopterina en lugar de folato
(Atlas, y Bartha, 2002).

Por su parte las bacterias extremófilas, que se hallan en este


tipo de aguas son microorganismos para los que vivir en este
tipo de ambientes no sólo es normal, sino que en la mayoría de
los casos es esencial para su desarrollo. Están adaptados a
temperaturas altas, elevadas dosis de radiación,
concentraciones altas de sal y de otros solutos, pH altos y bajos
entre otros. Para sobrevivir en estos ambientes tan adversos,
han desarrollado diversas estrategias de adaptación físico-
químicos para vivir en estos ambientes, como enzimas y otras
estrategias (Granada, 2010) Dicho esto, el potencial enzimático

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0.5% de glucosa como enriquecimiento. Para el aislamiento de
Bacterias termófilas se sembró 1mL de muestra en 9ml de
caldo nutritivo y agua termal con 0.5% de glucosa como
enriquecimiento, posteriormente los medios de cultivos
incubaron a 60°C durante 8 días. De este enriquecimiento se
eligieron algunas de las muestras para obtener cultivo axénico.

Caracterización bioquímica

Después de haber aislado los microrganismos se procedió a


realizar una identificación presuntiva utilizando ocho (8)
pruebas bioquímicas; Catalasa, Oxidasa, Lisina Hierro Agar
(LIA), Sulfuro Indol Movilidad (SIM), Citrato de Simmons,
Ureasa, Hierro triple azúcar (TSI) y Voges Proskauer, las
cuales se incubaron a 60°C durante 24h y finalmente se
observaron variaciones de color y se revelaron.

Evaluación producción de lipasas

Para la evaluación de la producción de lipasas por parte de los


Imagen 1. Zonas de muestreo seleccionadas de las aguas microorganismos termófilos aislados se prepararon medios de
termales, en el municipio de Paipa, Boyacá (2017 Google). cultivo modificados líquido y sólido, teniendo como base el agar
nutritivo y caldo nutritivo, a los cuales se cambió la fuente de
Se dividieron en sitios estratégicos el sitio 0, piscinas termales
carbono (pluripeptona) por el aceite quemado a una
los delfines a 3,6 kilómetros del pozo azul en la principal boca
concentración de 0.5% v/v, posterior a esto se inocularon
del volcán. El sitio 1, pozo principal pozo azul y sitio 2 pozo del
tomando alícuotas de las colonias anteriormente aisladas y se
diablo a 100 metros del pozo azul. (Características de los
incubaron a 60 °C durante 24.
pozos, anexo 1).

Medios de cultivo y asilamiento Nomenclatura de las cepas aisladas


Se realizó por 2 números separados por un punto, el numero
Inicialmente se prepararon 20 medios líquidos cada uno con
de la izquierda indica la cepa y el numero de la derecha indica
9mL, diez con caldo nutritivo y diez con agua termal y glucosa
el sitio de donde fue tomada. 0, pozo el delfín 1. Pozo azul y 2.
al 0.5% como enriquecimiento. Además, veinte (20) medios
Pozo del diablo.
sólidos, diez agares nutritivos y diez medios con agua termal y

Resultados

Imagen 3. Posible efecto de la tinción de Gram en


Arqueobacterias, A. Perdida de la pared celular S de
Arqueobacterias antes y después de la tinción de Gram (Terry
Imagen 2. Macroscopía y Microscopía de bacterias y arqueas J. Beveridge and Susanne Schultze-Lam ,1996) B. Tinción de
termófilas a (60° C) aisladas de las aguas termales de Paipa, Gram de las posibles Arqueobacterias aisladas, imagen propia.
Boyacá.

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TABLA 1. Resultados de caracterización bioquímica de las cepas aisladas.

Pruebas Cepa 1.0 Cepa 3.0 Cepa 1.1 Cepa 2.1 Cepa 1.2 Cepa 2.2 Cepa 3.2 Cepa 4.2 Cepa 5.2
Cocos
Arqueas Arqueas
Cocos Arqueas Arqueas Gram Arqueas Arqueas
Arqueas en en
Gram (+) en en positivos en forma en forma
Forma en forma forma forma
en diplos forma forma en pleiforme cicrular
bacilar circular circular
bacilar circular cadenas
irregular irregular
Oxidasa Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
Catalasa Positivo Negativo Positivo Positivo Positivo Positivo Negativo Negativo Positivo
LIA Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Positivo
SIM Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
Citrato Negativo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Negativo Positivo Positivo
Ureasa Positivo Negativa Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo
TSI A/A A/A K/K K/K K/A K/K K/K A/A A/A
VP Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo
Gas Si Si No No Si Si No No No
Género Methanobact Halobaculum Rubrobacter sp Thermococcus Methanobact Halobaculum Streptococcus Halobacter Thermococcus
sp
presuntivo erium sp sp erium sp sp thermophilus ium sp sp

A/A: Fermentación de glucosa K/K: Microorganismo no fermentador K/A: Fermentación de glucosa y lactosa y/o sacarosa

cambiando su composición original lo que hizo que las


bacterias y arqueas no proliferaran abundantemente.

La morfología encontrada en el Gram del primer aislamiento de


las muestras fue variada, en el anexo 2 se muestran los datos
correspondientes a esta etapa, pero al realizar el cultivo
axénico de las muestras elegidas se redujo a morfologías más
definidas encontrando diplococos (Imagen 2 – 1.1), cocos en
cadenas Gram positivos (Imagen 2 – 1,2) y rastros no definidos
de bacilos Gram negativos y cocos positivos (Imagen 2 – 5.2).
La Macroscopía de los aislados fueron colonias puntiformes
blancas (Imagen 2-5.2 Imagen 4 – 2.1), Colonias redondas
blancas (Imagen 2 y 4 – 1.2) y crecimiento abundante de color
blanco no definidas por colonias.
Imagen 4. Resultado de la evaluación de la capacidad
degradadora de aceite quemado de cocina al 0,5% v/v de las
diferentes cepas de microorganismos termófilos aislados en las Existen varios grupos de arqueas como las metanogénicas que
aguas termales de Paipa, Boyacá, el primer número se diferencian entre sí por su morfología entre las que se
corresponde a la cepa y el siguiente (de izquierda a derecha) pueden encontrar bacilos y cocos filamentosos, agrupados en
corresponde al lugar donde se tomó la muestra, se evidencia
cadenas, diplococos, tétradas y racimos. Pueden desarrollarse
crecimiento en todas las cepas evaluadas, por lo que se
a temperaturas que van desde a 38°C a 75°C y su afinidad al
presume son capaces de utilizar el aceite quemado de cocina
Gram es variable (Rittmann B, 2000). La tinción de Gram no es
como fuente de carbono
precisa para Arqueobacterias por la falta de membrana celular
Discusión y por su delgada pared celular S lo que hace que se pierda de
alguna manera la forma definida de su estructura y su
Esta investigación permitió aislar Bacterias y posibles intensidad a la tinción.
Arqueobacterias de 3 sitios distintos de muestra tomadas de
las aguas termales del municipio de Paipa en Boyacá (Anexo En la imagen 3, A. Se observa un estudio en el que por medio
1), El crecimiento fue favorable a 60°C en los medios de cultivo de la Microscopia Electrónica de Transmisión MET muestra
agar nutritivo y medio modificado, en este último se observó un secciones delgadas de arqueas simples en forma de (Pared
celular) S antes y después de la tinción de Gram, ambas
secciones fueron teñidas con sales de metales pesados para
menor crecimiento y creemos que fue por autoclavar el agua aumentar el contraste y mostrar que la mayor parte de la
termal que se desestabilizaron los nutrientes disponibles, sustancia celular se ha perdido durante la reacción, dejando
así un rastro de la célula lisada que aumenta si las células son

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para la degradación de aceite de cocina usado
cultivadas a más de 70°C (Terry J. Beveridge and Susanne son considerados quimiorganótrofos, requieren compuestos
Schultze-Lam ,1996). en contraste con la imagen 3, B podemos como extracto de levadura, triptona, peptona, y aminoácidos
observar morfologías similares a bacilos, pero no definidas por libres para utilizarlos como fuentes de carbono que están
la tinción dejando así un rastro de un exudado en la lámina que disponibles en su entorno, utilizan el piruvato como sustrato
comparando con el estudio mencionado se observan pocas para producir metano y además pueden asimilar disacáridos
sustancias celulares en estas células después de la tinción de como la maltosa.
Gram característica típica de posibles Arqueobacterias
además de agregados de cristal violeta que podrían ser
filamentos terminales en las células. Las arqueas poseen una diversidad fisiológica y morfológica
muy alta, estas Pseudobacterias no tienen núcleo u otros
organelos dentro de sus células; en el pasado se les
En general, los microorganismos pertenecientes al dominio
consideraba como bacterias peculiares y raras, pero como las
Archaea presentan tipos de metabolismo diversos y las fuentes
arqueas tienen una historia evolutiva independiente y muestran
nutricionales son variables; como son microrganismos que
muchas diferencias en su bioquímica de otras formas de vida,
viven en condiciones ambientales extremas exhiben una
ahora se clasifican como un dominio separado. Las arqueas
diversidad de procesos metabólicos con multitud de donadores incluyen microorganismos unicelulares adaptados a una
y aceptores de electrones. En la tabla 1. Se observa los variedad de condiciones ambientales, sobre todo extremas,
resultados de las pruebas bioquímicas realizadas para la que se hallan en los lugares más hostiles como los termales de
caracterización de los microrganismos aislados; en donde la Paipa, donde las condiciones fisiológicas para el crecimiento
mayoría exponen que prefieren utilizar otros compuestos bacteriano son extremas. Luego de realizar las microscopías y
fermentables como fuente de Carbono diferentes a la glucosa. de hacer contrastes entre la literatura referente a arqueas y los
Las archeas catalizan una gran de sustratos que tienen resultados obtenidos en el Gram, se pudo concluir que se
disponibles en los ambientes extremos donde habitan, en lograron aislar algunos morfotipos que concuerdan en algunos
general el metabolismo de estos microrganismos implica en aspectos con este tipo de microorganismos. Estos géneros
poca proporción la utilización de azúcares básicos como la presuntivos de arqueas evidencian que existen
glucosa catalizada por las ruta Entner-Doudoroff pero con microorganismos aerobios o facultativos, no móviles, Gram
algunas modificaciones debido a que su arsenal enzimático es positivos y Gram negativos que crecen en condiciones
diferente al de las bacterias, esto es evidente debido a que la alcalinas, concordando parcialmente con el ambiente dado
mayoría de los microrganismos aislados no utilizó la glucosa para su crecimiento y los resultados obtenidos en las diferentes
proporcionada como fuente de Carbono y energía (cepa 1.3, pruebas bioquímicas realizadas (Tabla 1). Entre estos géneros
3.0, 4.2 y 5.2) según Olsen y Woese (1997) la mayoría de éstos presuntivos se encuentra una gama variada de morfologías
microrganismos utilizan fuentes altamente accesibles dentro que coinciden con las de cocos, estreptococos, diplococos y
bacilos vistas al microscopio de los microorganismos aislados
de su entorno, el sulfuro de hidrógeno, metano, azufre,
de las muestras de agua termal, un ejemplo de estos géneros
nitrógeno y sales como citrato que se encuentras distribuidas
de arqueas es Halobaculum, cuyas células son cocoides en
en ambientes extremos (cepa 1.0, 4.2 y 5.2) son todos fuentes
todas las condiciones de crecimiento, crecen solos, en parejas,
de energía potenciales, Además, la mayoría de estas arqueas
tétradas, o racimos irregulares, no son móviles, son aerobios y
son también Quimiolitrotofos, lo que significa que deben tomar
algunas células han sido teñidas como Gram positivas, además
su energía de fuentes inorgánicas. de que no pueden crecer en medios con fuentes de carbono
simples. Crecen en concentraciones de sal y de pH altos,
Los microrganismos pertenecientes a este extremófilos son aunque este último varía desde 5 hasta 8. Otro de los géneros
considerados primitivos y las fuentes de energía muestran la de arqueas que encajan con las microscopías es
utilización de compuestos que estaban fácilmente disponibles Methanobacterium, bacilos curvados, torcidos o rectos, largos
en la tierra primitiva que es similar al ambiente en que cual y filamentosos, son facultativos, producen metano, no son
habitan: Altas temperaturas, salinos, pH básicos y móviles, pero pueden llegar a serlo y suelen teñirse como Gram
concentración de compuestos como metano, sulfuros, hierros positivos. Por otro lado, también se encontraron en las
y sales; Amend y Shock (2001) afirman que muchos de las muestras morfologías típicas bacterianas que concuerdan con
archeas tienen a ser en su mayoría metanogénicos, el género Streptococcus thermophilus, que son cocos Gram
dependientes de sulfuros, ácidos, alcoholes, aminoácidos y positivos dispuestos en pares o en cadenas, no móviles,
utilizan mezclas complejas de polipéptidos y algunos sustratos facultativos distribuidos en ambientes extremos.
inorgánicos como hierro, CO2, sulfuros y sulfatos como fuentes
En la evaluación de la degradación de aceite por parte de las
asimilables de energía.
bacterias aisladas, se logró apreciar que todas las cepas
Por otra parte, las bacterias termófilas exhiben tipo de
analizadas presentaron crecimiento en los medios modificados
metabolismo en el cual pueden utilizar la glucosa a través de la donde la única fuente de carbono presente era el aceite
ruta fermentativa Embden-Meyerhof como fuente de carbono, agregado a una concentración del 5%, por tal motivo se cree
pero muchos de ellos son dependientes de azufre, lo oxidan y que los microorganismos lograron hacer uso del aceite como
lo reducen con el fin de obtener energía. Los cocos termófilos

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su fuente de carbono llegando incluso a una degradación total esterasas termoresistentes. En el caso de las arqueas que
o mineralización del aceite. presumiblemente fueron obtenidas en el laboratorio aún sin
tener una identificación completa Camacho, M et. Al., (2005)
Las enzimas capaces de realizar tal proceso son las lipasas o reportaron que las arqueas analizadas en ese estudio las
también llamadas enzimas lipolíticas, Beisson et al., 2000 cuales fueron Natronococcus sp, Halobacterium sp y
mencionan que las enzimas lipolíticas juegan un rol importante Haloarcula marismortui, el proceso se llevó a cabo en medio
en la movilización de lípidos entre células individuales de los solido con baja aw en el medio dando como resultado una mejor
organismos como también en la transferencia de los lípidos de producción de biomasa y de la actividad esterasa – lipasa, a
un organismo a otro estas son de gran importancia no solo por pesar que en el laboratorio no se llegó a una identificación
su importancia biológica para el microorganismo sino también completa de los microorganismos encontrados este autor
por la utilidad a nivel industrial que estas pueden tener sobre también resalta que gran variedad de arqueas son capaces de
todo sin hacemos referencia a que en este caso en específico producir esta enzima cuando se encuentran en condiciones
estamos tratando con enzimas termoestables o resistente a adecuadas o de estrés osmótico.
elevadas temperaturas.
Según lo obtenido en el laboratorio se puede decir que los
Es bien conocido a nivel biotecnológico la gran utilidad de las microrganismos aislados poseen la enzima necesaria para
enzimas termoestables las cuales son obtenidas poder usar el aceite como fuente de carbono con base en el
principalmente de microorganismos termófilos, estas se
aplican principalmente en la industria de los detergentes, crecimiento de estos microorganismos en el medio de cultivo
reacciones específicas y el proceso de trans esterificación, en donde la fuente de carbono fue reemplazada por el aceite,
los microorganismos termófilos bien sea bacterias o arqueas, soportado por los distintos estudios citados los cuales
se dice que no se han descrito hasta el momento enzimas concluyen que gran variedad de arqueas posees esta
verdaderamente lipasas haciendo referencia a que no se ha capacidad y si bien los termófilos no poseen enzimas lipasas
descrito una enzima selectiva para los esteres de los ácidos verdaderas, poseen enzimas estereasas las cuales le otorgan
grasos, por otra parte se han descrito gran variedad de esta capacidad.
microorganismos termófilos con la capacidad de producir

fuente de carbono, pero tienen en común la producción o


utilización de azufre para obtener energía.
Conclusiones
Los posibles microorganismos encontrados (Bacterias
Se lograron aislar diferentes morfologías de bacilos y cocos termófilas y arqueas) poseen cierta actividad lipolitica debido a
que concuerdan según la literatura con algunos géneros de que las cepas estudiadas presentan la capacidad de usar el
arqueas en cuanto a sus formas, distribución y tinción, así aceite (girasol) de cocina quemado como fuente de carbono
mismo también se aislaron colonias de cocos Gram positivos permitiendo así su crecimiento en el medio modificado con
dispuestos en cadena que se asemejan a el género bacteriano 0.5% v/v de aceite, logrando poder degradar el aceite.
Streptococcus thermophilus.
Las esterasas y lipasas de arqueas y microorganismos
La tinción de Gram puede ser un factor clave como primer termófilos podrían ser un biocatalizador altamente estable a
acercamiento respuesta en el aislamiento de Arqueobacterias condiciones requeridas en la industria por lo que su búsqueda
ya que comprueba que esta puede estimular la lisis celular de y producción son de alto interés biotecnológico, pudiéndose
arqueas (tiñéndolas de color rosado) y también mostrar los usar para remediar agua o suelo contaminados, así también en
rastros de filamentos celulares (tiñéndolos de color morado). el tratamiento de aguas residuales e infinidad de procesos
industriales.
Los microorganismos termófilos son metabólicamente
complejos, catabolizan una diversidad de mezclas de sustratos
que incluyen compuestos inorgánicos, aminoácidos y azúcares
que se encuentran disponibles en su hábitat extremo como

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para la degradación de aceite de cocina usado
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para la degradación de aceite de cocina usado
Anexo 1
Sitios de muestreo y características

Sitio 0 – Piscinas termales los delfines – a 3,6 km del pozo azul en la principal boca del volcán

Información Valor

Latitud 5,7302N

Longitud -73,11325W

Temperatura 18.3°C
ambiente

Ph 8

Temperatura de la 60°C
termal

Clasificación de la Hipertermofila
termal

Sitio 1 – pozo principal pozo azul

Información Valor

Altura 2556 msnm

Latitud 5,4538N

Longitud 0,5717W

Temperatura 18.3°C
ambiente

pH 8

Temperatura de la 55°C
termal

Clasificación de la Hipertermofila
termal

Sitio 2 – pozo del diablo a 100 metros del pozo azul

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Información Valor

Latitud 5,7678N

Longitud -73,1128W

Temperatura 22.5°C
ambiente

pH 8

Temperatura de la 67.8°C
termal

Clasificación de la Hipertermofila
termal

Anexo 2

Microscopías y microscopias iniciales

Macroscopía

Figura 1. Aislamiento de microorganismos termófilos de la muestra 0 que corresponde a el poso Termal el delfín uno de los pozos de
agua termal más alejada de la boca del volcán y la letra C corresponde a que su preenrriquesimiento se hizo en caldo nutritivo caja
destapada donde se pueden observar colonias típicas de crecimiento bacteriano color crema brillante un poco elevada, de textu ra
cremosa y de borde ondulado, incubado durante 3 días a 60 °C.

Figura 2. Aislamiento de microorganismos termófilos de la muestra 0 que corresponde a el poso termal el delfín uno de los pozos de
agua termal más alejada de la boca del volcán y la letra T corresponde a que su preenrriquesimiento se hizo en caldo preparado con el

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Aislamiento de Bacterias y Arqueobacterias termófilas de aguas termales de Paipa Boyacá con potencial enzimático
para la degradación de aceite de cocina usado
agua termal donde se pueden observar varios tipos de colonias típicas de crecimiento bacteriano 1)color crema brillante un poco elevada,
de textura cremosa y de borde rizado, 2) color amarillento brillante, de textura cremosa y 3) colonia blanca brillante de textura cremosa,
con borde entero plana, incubado durante 3 días a 60 °C.

Figura 3. Aislamiento de microorganismos termófilos de la muestra 2 que corresponde a el poso termal el ojo del diablo uno de los pozos
de agua termal más cercano de la boca del volcán y la letra C corresponde a que su preenrriquesimiento se hizo en caldo nutritivo donde
se pueden observar varios tipos de colonias típicas de crecimiento bacteriano 1) color beige mate un elevada, de textura cremosa y de
borde entero, y 2) color transparente, de textura cremosa con apariencia de gota de agua, incubado durante 3 días a 60 °C.

Figura 4. Aislamiento de microorganismos termófilos de la muestra 2 que corresponde a el poso termal el ojo del diablo uno de los pozos
de agua termal más cercano de la boca del volcán y la letra C corresponde a que su preenrriquesimiento se hizo en caldo nutritivo y el
punto (.) indica que fue tomado del sedimento tomado al momento de realizar la toma de muestra donde se pueden observar varios
tipos de colonias típicas de crecimiento bacteriano color beige brillante de borde rizado, plana y de textura cremosa, incubado durante
3 días a 60 °C.

Figura 5. Aislamiento de microorganismos termófilos de la muestra 1 que corresponde a el poso termal central conocido como la boca
del volcán y la letra C corresponde a que su preenrriquesimiento se hizo en caldo nutritivo donde se pueden observar un crecimiento
masivo de colonias típicas de crecimiento bacteriano color transparente brillante de borde entero, parecido a gotas de agua y de textura
cremosa, incubado durante 3 días a 60 °C.

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Aislamiento de Bacterias y Arqueobacterias termófilas de aguas termales de Paipa Boyacá con potencial enzimático
para la degradación de aceite de cocina usado

Figura 6. Aislamiento de microorganismos termófilos de la muestra 2 que corresponde a el poso termal el ojo del diablo uno de los pozos
de agua termal más cercano de la boca del volcán y la letra T corresponde a que su preenrriquesimiento se hizo en caldo preparado
con agua termal del lugar de la toma de muestras donde se pueden observar varios tipos de colonias típicas de crecimiento bacteriano
1) color blanco brillante de borde entero, elevada y de textura cremosa y 2) colonia color beige brillante, de borde ondulado de
consistencia rugosa, incubado durante 3 días a 60 °C.

Microscopía

Imagen 3. Estreptobacilos Gram negativos largos y cortos en


la muestra de caldo termal. Se observa la morfología típica en
Imagen 1. Cocobacilos y cocos Gram positivos de la muestra
cadena de los Estreptobacilos con diferentes tamaños.
de caldo nutritivo. Se observan morfologías de cocos de
tamaños variables.

Imagen 4, Estreptococos y Estreptobacilos gram positivos


Imagen 2. Bacilos y cocos Gram positivos de la muestra de
junto a estructuras tubulares simétricas desconocidas que se
caldo nutritivo. Se observan morfologías alargadas de
asemejan a las de las algas.
diferentes tamaños, así como cocos de diferentes tamaños.

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