Análisis bioquímico David Mateos Jaén

Práctica UD 2

Práctica 5: Determinación de hemoglobina A2.

INTRODUCCIÓN
La Hb A2 es una proteína compuesta por 2 cadenas polipeptídicas alfa y 2
delta. La activación del gen que codifica para las cadenas tiene lugar poco
antes del nacimiento, de manera que los niveles en el recién nacido son bajos
(alrededor del 0,5%) y alcanzan los valores normales del adulto
aproximadamente a los 6 meses de vida.
A pesar de que la concentración de esta Hb es baja en sujetos normales, su
determinación es muy importante para el diagnóstico de algunos tipos de
hemoglobinopatías cuantitativas como pueden ser las talasemias.

FUNDAMENTO
La cromatografía es una técnica capaz de separar los analitos presentes en
una muestra basándose en la diferente velocidad de desplazamiento de estos
al ser arrastrados por una fase móvil a través de una fase estacionaria (lecho
cromatográfico).
La separación tiene lugar como consecuencia de la interacción (equilibrios) en-
tre los analitos presentes en la fase móvil y la fase estacionaria.

MATERIALES Y REACTIVOS
Equipo
Espectrofotómetro.

Materiales
Papel de filtro
Vaso de precipitado.
Parafilm
Pipeta Pasteur
Soporte
Cubetas de espectrofotómetria (3).
Columna de comatrografía.
Gradilla
Tubo de ensayo
Gradilla tubos eppendorf
Micropipeta de 1000ul
Tubo eppendorf
Pipeta.
Cremallera
Reactivos
Sangre
Agua destilada
Reactivo 1

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Práctica UD 2

PROCEDIMIENTO.
➢ Limpiar la zona de trabajo.
➢ Colocar el papel de filtro.
➢ Colocarnos la bata y loas guantes una vez que nos hemos lavado las
manos.
➢ Colocamos los materiales necesarios para realizar la práctica en la zona
de trabajo.
➢ Cogemos con la micropipeta 50 ul de sangre y verterlo en un tubo
eppendorf.
➢ En este ultimo ubo eppendorf vertemos 200ul de agua destilada y
dejamos reposar 10 minutos aproximadamente para que se produzca la
rotura de lla membrana de los hematíes.
➢ Vertemos 50ul del tubo eppendorff despues de de esperar los 10
minutos y lo vertemos en la columna de cromatografía una vez que esta
la hemos vaciado.
➢ Hechamos 200ul del reactiv 1 en la columna para que pase la muestra
del dico a la resina más facilmente.
➢ Añadimos 3ml de reactivo 1 en la columna y ponemos el tubo de ensayo
debajo ya que a medida que la muestra cae por la columna recogemos
lo que nos interesa.
➢ Mientras obtenemos la hemoglobina A2 preparamo la hemoglobina total
vertiendo 12 con un auxiliar de cremallera y utilizando una pipeta de 20
ml en un tubo de ensayo, colocamos el parafilm y homogenizamos la
muestra.
➢ Cogemos 3 cubetas y 3 pipetas pasteur, con la pipeta absorbemos y
vertemos Hb A2 en una cubeta hasta llegr a la flecha. Luego con otra
pipeta vertemos Hb total en otra cubeta y en la tercera cubeta añadimos
agua destilada para hacer el branco.
➢ Por ultimo vamos al espectrofotómetro y medimos la absorbancia a una
longuitud de onda de 415nm.
➢ Limpiamos los materiales recogemos la zona de trabajo y apagamos el
espectrofotómetro dejando dentro el soporte.

CÁLCULOS Y RESULTADOS
En el espectrofotómetro hemos obtenido los siguientes resultados:
• Hb total: 0,215.
• Hb A2: 0,051.
OPERACIONES:

(0,051 x 3ml/0,215 x 12)x 100 = 5,9%

PREGUNTA:
Diagnóstico en base a los resultados obtenidos.

Los valores normales de hemoglobina A2 oscila entre 1,8 – 3,2% por lo que el
paciente tiene valores altos, por lo que lo más probable es que nuestro pacien-
te padezca policitemia .

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Práctica UD 2

INCIDENCIAS
Algunas columnas estaban en mal estado por lo que la muestra no se podia
filtrar correctamente, a demas el reactivo 1 estaba caducado por lo que la
columna ha retendido mayor cantidad de particulas a las deseadas.

CONCLUSIÓN.
La determinación de la Hb A2 es un estudio indispensable en el diagnóstico de
las talasemias y de utilidad en otras entidades hematológicas como la
deficiencia de hierro y los síndromes de insuficiencia medular, por tanto esta
técnica es capaz de detectarnos valores de hemoglobina A2 para poder
analizar los valores normales y compararlos con los valores obtenidos para
realizar un diagnostico correcto.

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