“Año del Fortalecimiento de la Soberanía Nacional”

LABORATORIO DE ENZIMOLOGÍA 2022-I

Tema:
Actividad de la fosfatasa ácida en hígado

Profesora de práctica: Ana Kitazono Sugahara

Número de mesa: 1

Integrantes:

1. Rivadeneyra Cardenas, Ector Adrian (20180120) - 33.33%

2. Gutiérrez Rojas, Johnny Omar (20181008) - 33.33%
3. Quispe Huaman, Miguel Angel (20200145) - 33.33%

“Todo el mundo tiene metas o aspiraciones y todos hemos pasado por ese momento de la vida
en el que nadie creía en nosotros”
(Eminem. 2018)

Introducción
La fosfatasa ácida es una enzima presente en diversas fuentes como en hígado, próstata,
cerebro, papa, cerdo, etc. Las fosfatasa de bajo peso molecular no requieren de un cofactor para
su actividad, facilitando la experimentación y la obtención de resultados con fosfatasas de bajo
peso molecular. Se puede medir la cantidad de enzima presente de forma indirecta mediante la
concentración de sustrato proveniente de su actividad enzimática. Para la presente práctica, se
usó el p-nitrofenilfosfato, un fosfomonoéster, el cuál es catalizado por la enzima fosfatasa para
generar una molécula de p-nitrofenol y la liberación de un fosfato inorgánico (Guija et al,2007).
La molécula de p-nitrofenol se une con un grupo hidroxilo para formar p-nitrofenolato, cuya
concentración en la muestra es detectada mediante el espectrofotómetro.
Altos niveles de concentración de la fosfatasa ácida está relacionado con carcinoma de próstata,
destrucción de plaquetas, tromboembolismo, hepatitis, ictericia, cirrosis hepática,
hipertiroidismo, etc (Guija et al,2007). Por lo que mediante técnicas de medición de los
productos generados por la enzima fosfatasa se podría determinar una alteración en la salud del
organismo del cual se extrajo una muestra que contiene a la enzima.
El experimento realizado por Guija et al (2007), cuyo objetivo fue medir el efecto del glicerol
sobre la hidrólisis del p-nitrofenol fosfato a pH 5 de la fosfatasa ácida de bajo peso molecular
de hígado de alpaca, utilizaron una metodología similar para la medición de la concentración
de p-nitrofenol y fosfato inorgánico y luego medir el efecto del glicerol. Para la medición de la
actividad enzimática utilizaron 2 mL de tampón acetato, un medio con pH 5, EDTA, 2 µmol
de p-nitrofenilfosfato y una determinada cantidad de enzima fosfatasa ácida; cesaron la
reacción añadiendo NaOH. El p-nitrofenolato liberado se midió en el espectrofotómetro a 400
nm, utilizando un blanco carente de la enzima; utilizaron un coeficiente de extinción molar de
1.8x104 M-1cm-1.
En esta práctica se utilizaron distintas concentraciones de enzima provenientes de distintos
volúmenes de extracto crudo de hígado (ECH), a diferencia de la metodología explicada en el
párrafo anterior en el que se limitó a una determinada concentración enzimática. Los pasos
siguientes para la medición de la actividad enzimática fueron similares. Para esta práctica se
utilizó un valor de 402 nm y 18400 M-1cm-1 a diferencia de la metodología de Guija et al (2007)
en el que usaron valores de 400 nm y 18000 M-1cm-1, para las mediciones en el
espectrofotómetro y para la ley de Lambert Beer, respectivamente. La presente práctica tuvo
como objetivo determinar la actividad enzimática de la fosfatasa ácido presente en el hígado
de res para diferentes volúmenes de extracto crudo de hígado.

Materiales

Equipos de laboratorio:
- 1 Centrifugadora
- 1 Espectrofotómetro
- 5 Tubos de ensayo
- 1 Beaker
- 3 Micropipetas de diferentes rangos(100-200 uL; 100-1000 uL;1000-5000 uL)
- 1 Piceta
- 1 Homogeneizador de vidrio
- 1 Tubo de ensayo de plástico - tapa con diseño de rosca
- 1 Gradilla

Reactivos y muestras orgánicas:

- Hígado de res
 - Agua destilada
- Buffer acetato 0.01M
- Solución de paranitrofenilfosfato (preparación especial del laboratorio Q4 UNALM)
- Solución de NaOH 1M

Metodología

Se utilizó la técnica enseñada en clase, la cuál posee los siguientes pasos:

a) Se procede a homogeneizar el hígado de res hasta formar el ECH (Extracto crudo de hígado).

Imagen Nº1: Homogeneizador para formar el ECH

Fuente: elaboración propia

b) El ECH se vierte en un tubo de ensayo de plástico - tapa con diseño de rosca y se envía a
centrifugar por un periodo de 15 a 20 minutos.

Imagen Nº2: Tubo de ensayo de plástico - tapa con diseño de rosca

 Fuente: elaboración propia
c) Una vez centrifugado, se podrá observar claramente el sobrenadante y el analito. En la
técnica, solo se utilizará el sobrenadante.
d) Se procede a elaborar las 3 soluciones que se evaluarán en el estudio. La B (Blanco), la M
(Muestra) y la RM (Repetición de la muestra). Para preparar dichas soluciones, se deben añadir
los siguientes reactivos que se presentan en la tabla, en la cual se debe respetar las indicaciones
y el orden establecido:

Tabla Nº1: Preparación de las soluciones B-M-RM

Reactivos B M RM

2.5 mL de Buffer Acetato 0.01M ✅ ✅ ✅

Sol. Paranitrofenilfosfato (Q4) ✅ ✅ ✅

Incubar a 37ºC por 5 minutos

La adición de ECH para M y RM es con una diferencia de 30 segundos

100 uL de ECH ❌ ✅ ✅

Se deja reposar por 2 minutos

La adición de NaOH para M y RM es con una diferencia de 30 segundos

1 mL NaOH 1M ✅ ✅ ✅

100 uL de ECH ✅ ❌ ❌

Fuente: Elaboración propia

e) Se mantiene en incubación a 37ºC hasta llevar las soluciones a su evaluación con el
espectrofotómetro. Donde se analizará la absorbancia del paranitrofenolato (pNF) para una
longitud de onda de 402 nm, compuesto formado apartir de la reacción de paranitrofenilfosfato
con NaOH, amarillo en contacto con este y el indicador de la actividad de fosfatasa ácida en el
ECH del presente estudio.

Imagen Nº3: Incubación de las soluciones

Fuente: elaboración propia

f) Se procede a verter, uno por uno, el contenido de los tubos de ensayo en la cubeta del
espectrofotómetro.
g) Se coloca primero, con el objetivo de calibrar el espectrofotómetro, la solución blanco.
h) Una vez calibrado con el blanco (B), se evalúan y anotan las absorbancias obtenidas de la
solución M y RM.
Resultados

Tabla Nº2: Resultados obtenidos de las mesas del Laboratorio de Química Q4 de la UNALM

Número de mesa ECH (mL) Abs. M Abs. RM

M1 0.1 0.101 0.111

M2 0.2 0.419 0.643

M3 0.3 0.769 1.042

M4 0.05 0.070 0.082

M5 0.025 -0.029 -0.012

M6 0.1 (Dil 1/10) 0.033 0.039

Fuente: Laboratorio Q4 de la Universidad Nacional Agraria La Molina

Se conoce que la medida del paso óptico es de 1 cm y que el coeficiente de extinción molar del
pNF, el cual es 18400 M-1 cm-1
Al valor negativo, se le tomará valor absoluto con el fin de facilitar los cálculos.

Tabla Nº3: Actividad enzimática de la fosfatasa ácida en ECH

Actividad enzimática de la fosfatasa ácida en ECH

Número de mesa ECH (mL) (U/mL)

M RM

M1 0.1 2.7446 x10-4 3.0163 x10-4

M2 0.2 2.2771 x10-3 3.4946x10-3

M3 0.3 6.2690x10-3 8.4946x10-3

M4 0.05 9.5109x10-5 1.1141x10-4

M5 0.025 1.9701x10-5 8.1522x10-6

M6 0.1 (Dil 1/10) 8.9674x10-6 1.05978x10-5

Fuente: elaboración propia

Gráfica Nº1: Relación de la actividad enzimática de la fosfatasa ácida en ECH para M

Fuente: elaboración propia

Gráfica Nº2: Relación de la actividad enzimática de la fosfatasa ácida en ECH para RM

Fuente: elaboración propia

Discusión

- Se obtuvieron datos diferentes en la Abs. M y la Abs. RM esto debido a factores

externos al experimento como por ejemplo un cambio en la temperatura del agua
diferente a 37 ºC, una incorrecta limpieza en los materiales utilizados, etc. La
absorbancia obtenida en la M5 es producto de una disminución de la intensidad en el
haz de luz producido dentro del espectrofotómetro, esto puede deberse a la baja cantidad
de ECH en las muestras. Según los datos obtenidos de un informe que trata sobre la
actividad enzimática en la fosfatasa ácida en 10 gramos de germen de trigo, usando un
buffer citrato y determinando la absorbancia a 660 nm, obtuvieron diferentes datos en
la absorbancia a pesar de haber usado la misma cantidad de sustrato, podemos afirmar
que pudimos haber obtenido una mayor variedad en los datos de actividad enzimática
con la utilización de inhibidores por ejemplo. La actividad enzimática aumenta a mayor
cantidad de sustrato, entonces podemos decir que a mayores concentraciones de
sustrato, la velocidad aumenta a incrementos de la concentración de sustrato, hasta que
la velocidad se incrementa cada vez menos con respecto al incremento de concentración
de sustrato (Lehninger, 2009).

Conclusiones
- La actividad enzimática aumenta a medida que la concentración de sustrato también
aumenta.
- Los datos obtenidos pueden variar conforme a diversos factores externos, pero no en
gran medida, excepto por las concentraciones más bajas.

Referencias bibliográficas
- Guija, E; Arauco, F; Haak-Mares, H; & Soberón, M. (2007). Efecto del glicerol sobre
la catálisis por fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de alpaca (Lama
pacos). In Anales de la Facultad de Medicina (Vol. 68, No. 4, pp.307-313). UNMSM.
Facultad de Medicina.
- M. Real y J. Vargas. (2021). ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA FOSFATASA
ÁCIDA. https://www.studocu.com/co/document/universidad-de-la-
sabana/bioquimica/informe-4-fosfatasa-acida/18341990
- Wasserman, S. (2022). Lehninger Principios De Bioquímica / 5 Ed. / Pd. Ediciones
Omega.