RESULTADOS

Tabla 1. Producción de azúcares reductores en función de la concentración de sacarosa a 60

°C
Tabla 1 Producción de azúcares reductores en función de la concentración de sacarosa a 60
°C

Muestra Sacarosa g/L DO1 DO2 Promedio Dilucion Az. Red mg/LCi mmol/L Az Red mmolSac. Hid mmol/L
S1 1 0.004 0.012 0.008 SD 86.5 2.923976608 0.48055556 0.24027778
S2 5 0.062 0.002 0.032 SD 146.5 14.61988304 0.81388889 0.40694444
S3 10 0.059 0.073 0.066 SD 231.5 29.23976608 1.28611111 0.64305556
S4 20 0.071 0.088 0.0795 SD 265.25 58.47953216 1.47361111 0.73680556
S5 30 0.133 0.12 0.1265 SD 382.75 87.71929825 2.12638889 1.06319444
S6 40 0.149 0.153 0.151 SD 444 116.9590643 2.46666667 1.23333333
S7 50 0.141 0.111 0.126 SD 381.5 146.1988304 2.11944444 1.05972222
S8 60 0.146 0.159 0.1525 SD 447.75 175.4385965 2.4875 1.24375
S9 70 0.133 0.123 0.128 SD 386.5 204.6783626 2.14722222 1.07361111
S10 80 0.184 0.114 0.149 SD 439 233.9181287 2.43888889 1.21944444

La tabla 1 nos muestra que al aumentar la concentración de sacarosa (g/L) de igual manera
aumentan las concentraciones de azucares reductores (tanto mg/L y mmol/L) y sacarosa
hidrolizada (mmol/L) a una temperatura de 60°C.
Para la determinación de los azucares reductores en la muestra se utilizó la ecuación obtenida en la
práctica 1, y = 0.0004x – 0.0266 (Grafica 1), donde x es la concentración de azucares reductores y
esta expresado en mg/L. DO, es el promedio de las DO obtenidas. Así mismo involucramos el factor
de dilución de nuestra muestra que en este caso no fue necesario.

 Az. Reduc. (mg/L).

Por ec de práctica 1: y=0.0004 x – 0.0266

y +0.0266
‫؞‬x= 0.0004
∗factor de dilución

*Para 80g de sacarosa

0.149+0.0266 mg
x= =439
0.0004 L

Convertimos estos datos a mmol/L, teniendo en cuenta la equivalencia correspondiente, y el peso

molecular de los azucares reductores, dado que solo tenemos glucosa y fructosa como azúcar
reductor consideramos que el PM de un azúcar reductor es de 180 g/mol.
 Az. Reduc. (µmol/L)

* Para 80g de sacarosa

mg Azucar R . 1g
439
L (
1000 mg )( 1180molg Azucar R 1000 mmol
Azucar R )( 1mol )
=2.43
mmol Azucar R
L
 Para obtener los mmol Sacarosa hidrolizada /L tenemos que tomar en cuenta la relación
estequiometria que existe en la reacción.

1 Sacarosa
1 Glucosa + 1 Fructosa

Por lo tanto, por cada mol de sacarosa obtenemos 2 moles de azucares reductores.
 Sacarosa hidrolizada (mmol/L)
*Para 80g de sacarosa
mmol Azucar R 1 mmol sacarosa mmol sacarosa
2.4388
L (
2 mmol az reductor
=1.2194
L )
Tabla 2 Contenido de proteína soluble en la solución de invertasa

DO Promedio Dilucion Concentracion mg/L

DO1 0.417 0.424 1:5 82.312253
DO2 0.431

La tabla 2 nos muestra las D.O de la enzima invertasa obtenidas, y su respectiva

concentración calculada por la ecuación obtenida en la practica 1.

Para la determinación de proteína se utilizó la ecuación obtenida en la práctica 1,

y=0.0253x+0.0075 (Grafica 2), donde x es la concentración de proteínas y esta expresado en mg/L.
DO, es el promedio de las DO obtenidas. Así mismo involucramos el factor de dilución de nuestra
muestra (1:5).

Por la ecuación y=0.0253x+0.0075

y−0.0075
‫؞‬x= 0.0253
∗factor de dilución

0.424−0.0075 mg 1g
x=
0.0253
(5)= 82.3122 (
l 1000 mg
=0.08231 g /l )( )
Tabla 3 Actividad específica y volumétrica de la invertasa a diferentes
concentraciones de sacarosa

S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
UII 1.60E-02 2.71E-02 4.29E-02 4.91E-02 7.09E-02 8.22E-02 7.06E-02 8.29E-02 7.16E-02 8.13E-02
UIEI 1.17E-03 1.98E-03 3.12E-03 3.58E-03 5.17E-03 5.99E-03 5.15E-03 6.04E-03 5.22E-03 5.93E-03

Sust. Hidroli 0.2403 0.4069 0.6431 0.7368 1.0632 1.2333 1.0597 1.2438 1.0736 1.2194
Sust inicial 2.9240 14.6199 29.2398 58.4795 87.7193 116.9591 146.1988 175.4386 204.6784 233.9181
% Sust. Cons. 8.218 2.784 2.199 1.260 1.212 1.055 0.725 0.709 0.525 0.521
En la tabla 3 podemos notar que la UIEI y UII aumentan conforme aumenta la concentración
de sacarosa. En cuanto le porcentaje de sustrato consumido no siempre es el mismo valor,
el valor más alto lo encontramos en S1 con un 8.22%, mientras que el porcentaje más bajo
esta dado por S10 con un 0.522%.

Para calcular la velocidad de hidrolisis en UIEI tomamos el valor correspondiente de la fila de tabla 1
(Sacarosa Hidrolizada mmol/L). Teniendo en cuenta las equivalencias correspondientes, la
concentración de la proteína (82.3122mg/L) y el tiempo (15 min).

 UIEI
*Para 80g de sacarosa

( 1.21 mmol sacarosa

l solución )( 1
15 min )=0.0813
mmol sacarosa
l min

( 0.0813 mmol
l min
sacarosa
)( 1 L solución
13.72 mg proteina )=0.00593
mmol sacarosa
mg proteina(min)

Para calcular la velocidad de hidrólisis en UEI de igual forma tomamos el valor de sacarosa
hidrolizada (mmol/L) de la tabla 1, multiplicamos por el volumen tomado (5ml) y dividimos sobre el
tiempo de la reacción

 UII
*Para 80g de sacarosa

( 1.21 mmol sacarosa

l solución )( 1
15 min )=0.0813
mmol sacarosa
l min

Para obtener el sustrato hidrolizado en mmol, tomamos el valor de sacarosa hidrolizada (mmol/L) de
la tabla 1, teniendo en cuenta el volumen de la muestra .

 Sustrato hidrolizado
*Para 80g de sacarosa

mmol Azucar R 1 mmol sacarosa mmol sacarosa

2.4388
L (
2 mmol az reductor )
=1.2194
L

En el caso del sustrato inicial en mmol, tomamos el valor de concentración de sacarosa (g/L) (fila 2
de la tabla 1) y teniendo en cuenta el PM de la sacarosa (342 g/mol), las equivalencias
correspondientes.

*Para 80g de sacarosa

 sustrato inicial
( 80l gsolución
sacarosa 1mol sacarosa
)( 342.29 1000mmol
g sacarosa )( 1 mol )
=233.91 mmol sacarosa

Por último, para calcular el porcentaje de sustrato hidrolizado, ocupamos la ecuación:

Sustrato hidrolizado
% sustrato hidrolizado= x 100
Sustrato inicial
 % sustrato consumido
*Para 80g de sacarosa

% sustrato hidrolizado= ( 1.2194

233.91 )
×100=0.521 %
Determinación de parámetros cinético

Tabla 4 Sacarosa (mmol) vs UIEI

Sacarosa UIEI
mmol mmol saca
L mg prote∗min
2.923976608 1.17E-03
14.61988304 1.98E-03
29.23976608 3.12E-03
58.47953216 3.58E-03
87.71929825 5.17E-03

116.9590643 5.99E-03
146.1988304 5.15E-03
175.4385965 6.04E-03
204.6783626 5.22E-03
233.9181287 5.93E-03

Tabla 4 Sacarosa (mmol/L) vs UIEI, usada para la obtención de la gráfica de Michaelis Menten, se
puede apreciar que al aumentar la concentración aumenta la velocidad de hidrolisis (UIEI).

Grafica 1 UIEI vs [sacarosa]

7.00E-03
f(x) = 0 x + 0
6.00E-03 R² = 0.74

5.00E-03

4.00E-03
UIEI

3.00E-03
Linear ()
2.00E-03

1.00E-03

0.00E+00
0 50 100 150 200 250
Sacarosa

La grafica 1 describe el comportamiento de la velocidad como una función dependiente de la

concentración de sustrato, estos valores corresponden a una temperatura de 60°C con un tiempo de
reacción de 15 min. Se observan intervalos que salen considerablemente de la línea de tendencia,
podemos decir que las variaciones están dadas por los factores de dilución y temperatura usados.
Determinación de los parámetros cinéticos (Km y Vmax) de la invertasa por el método
de:

 Lineweaver-Burk
Ecuación linealizada de M-M, Lineweaver-Burk

1 KM 1 1
= +
v V max Cs V max

Tabla 5 tabulación 1/V vs 1/S

1 1
Cs v
1 1
mmol /l mmol
mg proteina( min)
0.342 856.428
0.068 505.673
0.034 320.004
0.017 279.288
0.011 193.549
0.009 166.849
0.007 194.184
0.006 165.452
0.005 191.671
0.004 168.749

Grafica 2, 1/V vs 1/S (Lineweaver-Burk)

Lineweaver-Burk
900.000
800.000 f(x) = 2015 x + 202.76
R² = 0.91
700.000
600.000
500.000 UIEI
1/V

400.000 Linear (UIEI)

300.000
200.000
100.000
0.000
0.0000.0500.1000.1500.2000.2500.3000.3500.400
1/S

La grafica 2 representa la linealizacion de la ecuación de M-M, nos servirá para la determinación de

los parámetros cinéticos, arroja la ecuación y= 2015x + 202.76 con una R² = 0.90, los valores
presentan una tendencia casi lineal, se puede observar que el coeficiente de determinación es más
alto que en la gráfica 1 (R2=0.74 - R2=0.90 respectivamente).

Tabla 6. Parámetros cinéticos obtenidos por método Lineweaver-Burk

V max Km

1 K
b= m= m
V max V max
1 1 mmol
V max = = =4.9 E−03
b 202.76 mg proteina ( min )K m =mV max =( 2015 ) ( 4.1 E−03 )=8.26
mmol/ L
¿ 4.9 E−03 UIEI

Tabla 6 muestra los valores obtenidos por el método Lineweaver-Burk, resultando V max =
4.9E-03 UIEI y Km=. 9.94E-03mmol/L Considerando una R2=0.90

 Hanes-Woolf
Ecuación linealizada de M-M, Hanes-Woolf

Cs 1 K
= C s+ M
v V max V max

Tabla 7 tabulación S/V vs S

Cs Cs/v
2.923976608 2.50E+03
14.61988304 7.39E+03
29.23976608 9.36E+03
58.47953216 1.63E+04
87.71929825 1.70E+04
116.9590643 1.95E+04
146.1988304 2.84E+04
175.4385965 2.90E+04
204.6783626 3.92E+04
233.9181287 3.95E+04
 Grafica 3, S/V vs S (Hanes-Woolf)

4.50E+04 Hanes Woolf

4.00E+04
f(x) = 155.41 x + 4188.86
3.50E+04 R² = 0.97

3.00E+04
2.50E+04
Cs/V

Linear ()
2.00E+04
1.50E+04
1.00E+04
5.00E+03
0.00E+00
0 50 100
Cs 150 200 250

La grafica 3 representa la linealizacion de la ecuación de M-M, nos servirá para la determinación de

los parámetros cinéticos, arroja la ecuación y= 155.41x +4188.9 con una R² = 0.97, los valores
presentan una tendencia lineal.

Tabla 8. Parámetros cinéticos obtenidos por método Hanes-Woolf

Km V max

Km 1
b= m=
V max V max

K m =b V max =( 4188.9 ) ( 6.43 E−03 ) 1 1 mmol

V max = = =6.43E-03
m 155.41 mg proteina(min)
¿ 26.95 mmol/ L
¿ 6.43E-03 UIEI

Tabla 8 muestra los valores obtenidos por el método Hanes-Woolf, resultando V max =6.43E-
03 UIEI y K m =26.95 mmol /L Considerando una R2=0.97. En comparación con Line Weaver-
Burke Tenemos una R2 mucho más confiable pasando de R2=0.90 a R2= 0.97
  Eadie-Hofstee
Ecuación linealizada de M-M, Eadie-Hofstee

V
v=−K M +V max
CS

Tabla 9, tabulación V vs V/S

V/Cs V
3.99E-04 1.17E-03
0.00013526
5 1.98E-03
0.00010687
4 3.12E-03
6.12272E-05 3.58E-03
5.88997E-05 5.17E-03
5.12439E-05 5.99E-03
3.52244E-05 5.15E-03
3.44511E-05 6.04E-03
2.549E-05 5.22E-03
2.53334E-05 5.93E-03

Grafica 4, V vs V/S (Eadie-Hofstee)

7.00E-03
Eadie-Hofstee
6.00E-03

5.00E-03 f(x) = − 12.75 x + 0.01

R² = 0.67
4.00E-03
Linear ()
V

3.00E-03

2.00E-03

1.00E-03

0.00E+00
0.00E+00 2.00E-04 4.00E-04 6.00E-04
V/Cs

La grafica 4 representa la linealizacion de la ecuación de M-M, nos servirá para la determinación de

los parámetros cinéticos, arroja la ecuación y= -12.753x + 0.0055 con una R² = 0.67, los valores no
presentan una tendencia lineal, se observa a simple vista que los valores no son consistentes, el
coeficiente de determinación (R² = 0.67) es bajo, lo cual la fiabilidad de los datos es cuestionable
para el cálculo de los parámetros cinéticos.

Tabla 10. Parámetros cinéticos obtenidos por método Eadie-Hofstee

V max Km
b=V max m=−K m

mmol K m =−m=−(−12.753 ) =12.753 mmol/L

V max =b=0.0055
mg proteina(min)
¿ 0.0055 UIEI

Tabla 10 muestra los valores obtenidos por el método Eadie-Hofstee, Considerando una
R2=0.67.

Tabla 11. Valores de los parámetros cinéticos por los tres métodos
Parámetros cinéticos
Vmax (UIEI ) Km R2
(mmol/L)
Lineweaver-Burk 4.9E-03 8.2615 0.90
Hanes-Woolf 6.43E-03 26.95 0.97
Eadie-Hofstee 0.0055 12.753 0.67

Tabla 11 muestra los valores obtenidos de los parámetros cinéticos (V max y K m ) resultado del cálculo
de los tres métodos (Lineweaver-Burk, Hanes-Woolf y Eadie-Hofstee) y sus respectivos coeficiente
de determinación, encontrando que el mejor método (para este caso) es Hanes-Woolf ya que nos
arroja un valor de R2= 0.97, lo cual lo vuelve muy fiable.

Comparaciones de los 3 métodos cinéticos para velocidad de

reacción.

Para realizar la comparación de la velocidad de reacción de la Invertasa entre los datos

obtenidos experimentalmente y las ecuaciones cinéticas de cada modelo se realizaron los
siguientes cálculos:

Linewearer-Burk 
mmol sac . hidro .
V=
Vmax∗[ S ]
=
( 0.00419
mg prot .∗min )
∗[2.9239]

Km+ [ S ]
(8.2615 mmols
L )
+[2.9239]

Hanes-Wolf
V=
Vmax∗[ S ]
=
( 0.00643 mmol sac . hidro .
mg prot .∗min )
∗[2.9239]

Km+ [ S ]
(26.95 mmols
L )
+[ 2.9239]

Eadie-Hofsree
mmol sac . hidro .
V=
Vmax∗[ S ]
=
( 0.005
mg prot .∗min )
∗[2.9239]

Km+ [ S ] (12.753 mmols/ L)+[2.9239]

Tabla 12 Datos para la comparación de la Actividad enzimática experimental con los

diferentes modelos.
Lineweaver-Burk Hanes-Woolf Eadie-Hofstee
Concentración mmol sacarosa mmol sacarosa mmol sacarosa mmol sacarosa
de sustrato hidrolizada / (mg hidrolizada / (mg hidrolizada / (mg hidrolizada / (mg
(mmol/L) Prot*min) Prot*min) Prot*min) Prot*min)
2.923976 0.0017 0.001280901 0.000629349 0.000857965
14.6198 0.00198 0.003130811 0.002261385 0.002456858
29.2397 0.00312 0.003820532 0.00334601 0.003203
58.4795 0.00358 0.004293456 0.004401561 0.003776446
87.7192 0.00517 0.004478234 0.004918796 0.004016119
116.959 0.00599 0.004576719 0.005225847 0.004147738
146.1988 0.00515 0.004637917 0.005429193 0.004230933
175.4385 0.00604 0.004679633 0.005573783 0.004288276
204.6783 0.00522 0.004709893 0.005681868 0.004330196
233.9181 0.00593 0.004732846 0.005765724 0.004362178
 0.01
Velocidad de hidrolisis [mmolp/(mgprot*min)
0.01

0.01

0
0 50 100 150 200 250
Sustrato

Grafica 5, Comparación de velocidad de reacción de los tres métodos cinéticos.

La ecuación de Michaelis Menten corresponde a la hipérbola que se obtiene cuando se
representa la velocidad inicial de la rección frente a la concentración de sustrato, y que
define el comportamiento de saturación y el momento donde se alcanza la Vmax. Esta
ecuación se puede transformar en una ecuación de la recta, lo cual permite calcular
fácilmente los valores experimentales de los parámetros cinéticos Km y Vmax. [CITATION
Fra05 \p 302 \l 3082 ]

Se compara la ecuación de Michaels Menten con las trasformaciones lineales Hanes-Woolf,

Lineweaver Burk y Eadie Hofstee.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
En esta práctica se estudió la velocidad de las reacciones que se denominan
cinética, y el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas
(cinetica enzimática).Una descripción cinética de la actividad de una enzima ayuda a
comprender como funcionan las enzima, al igual se realizó la determinación de los
parámetros cinéticos Km y Vmax de la invertasa. Para esto de determinó la
velocidad de reacción a diferentes de concentración de sustrato y a una temperatura
de 60°C. Como se observa en la tabla 1 se utilizaron 8 concentraciones de
sacarosa: 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 y 80g/L, estas muestras se denominaron
S1 hasta S10, respectivamente. En base a la densidad óptica promedio se
determinó la concentración de azucares reducidos, y con éstos últimos se determinó
la concentración de sacarosa hidrolizada (mmol/L),
Para medir la constante de constante de afinidad y la Vmax de la invertasa hicimos uso de
la curva de calibración del método DNS y del método Bradford que fueron calculadas en la
práctica 1.

Se observa que los valores de los azúcares reductores van aumentando dado que su
producción es función de la concentración de sacarosa. Ya que se ha cuantificado la
sacarosa hidrolizada se puede proceder a calcular la velocidad de la reacción, y para ello en
cada tubo de ensayo a las diferentes concentraciones de sacarosa se adiciona 1 ml de la
solución de enzima, a una temperatura de 60°C, es decir se realizó un análisis de la
actividad específica y volumétrica de la invertasa a diferentes concentraciones de
sacarosa: 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 y 80 g/L. Como se observa en la tabla 3, se
determinó las Unidades Internacionales de Invertasa (UII), las Unidades
Internacionales Especificas de Invertasa (UIEI) y el porcentaje de sustrato
consumido. En el caso de la UII el menor valor en la muestra S1 y el mayor valor en
la muestra S10
La concentración de azucares reductores se calcula con la ecuación del método DNS,
y=0.0004x-0.0266, donde se sustituye el promedio de la densidad óptica “y” para obtener la
concentración “x”. El valor de la D.O. determina que hubo formación glucosa y fructosa.
Posteriormente se calcula la concentración de sacarosa hidrolizada empleando la
estequiometria de la reacción, donde por cada mol de sacarosa se forma un mol de glucosa
y un mol de fructosa.

Ecuación del Método de Bradford y=0.0075 x – 0.0253

0.417−0.0075 mg
concentración de la enzima= =16.18
0.0253 L
0.431−0.0075 mg
concentración de la enzima= =16.73
0.0253 L
La concentración de enzima con el promedio de la D.O.
0.424−0.0075 mg
concentración de la enzima= =16.46
0.0253 L
En este caso la concentración de enzima es muy aproximado al valor teórico.

.Otro punto importante fue el pH donde, El pH óptimo para la invertasa es de 4.6 y de

acuerdo con la literatura la invertasa tiene mayor actividad enzimática a 55°C. Es importante
que el pH de la solución enzimatica y de las soluciones de sacarosa se encuentren a pH 4.6
debido a que a este pH la actividad enzimática de la invertasa es la óptima, es decir en
donde se observa la mayor velocidad de la enzima.

Dado que tanto el pH como la temperatura tienen efecto directo sobre la reacción
enzimática, en esta ocasión el pH se mantiene constante y la única variable es la
concentración de sustrato. La cantidad de azucares reductores va a variar dependido de la
temperatura a la cual se llevó la reacción, entonces se espera que a 40 y 50°C la
producción de azucares reductores sea menor a las concentraciones con una temperatura
de 60°C.

Con la ecuación de Bradford (de práctica 1) se calculó la concentración de enzima para la

producción de azucares reductores, la cual se lleva a cabo con unca concentración de 82.31
mg/L de enzima.
AL aumentar la concentración de sacarosa, aumentará la velocidad de reacción enzimática,
hasta llegar al punto donde se satura la enzima y por más que se le adicione sacarosa al
medio, la velocidad de la enzima es la Vmáx, y esta se mantendrá constante.

Los valores numéricos de la Vmax y km que se determinaron con Michaelis Menten son
muy similares a los valores que se obtienen de los métodos Hanes-Woolf, Lineweaver Burk
y Eadie Hofstee

Los valores de Vmax calculados por los cuatro métodos son muy cercanos, sin embargo, el
método que nos da más certidumbre es Hanes-Woolf ya tiene un coeficiente R2= 0.9708.

La Km nos indica la afinidad que tiene la enzima por el sustrato, si se reporta un valor
pequeño significa que se requiere poca cantidad de sustrato para alcanzar la mitad de la
velocidad máxima y por lo tanto la afinidad de la invertasa por la sacarosa es elevada. Y por
consiguiente se consigue una gran eficacia catalítica a bajas concentraciones de sustrato.

CONCLUSIÓN
En esta practica fue indispensable tener buenas condiciones en la enzima y su
actividad para tener una buena reacción enzimática.
Se logro comprender el efecto que tiene la concentración de sustrato sobre la
velocidad de actividad enzimática de la invertasa, logrando estimar parámetros que
describen el comportamiento observado experimentalmente, mediante la ecuación
de Michael Mendel. De igual manera se comparó los diferentes métodos lineales de
estimación de parámetros cinéticos, observando cuál de ellos dio un mejor ajuste.