ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA

AMILASA SALIVAL
 INTRODUCCIÓN

La saliva es un fluido biológico de gran importancia, ya que, además de

mantener la homeostasis en la cavidad oral, es un medio perfecto para monitorear la
salud en general. Está compuesta de una variedad de enzimas, hormonas, anticuerpos
y proteínas, dentro de lascuales la de mayor concentración es la α-amilasa, proteína
secretada por el páncreas y glándulas salivales, ambas de carácter enzimático.
En la saliva comienza la digestión de los alimentos, especialmente de los
almidones ingeridos,gracias a la actividad enzimática de la α-amilasa salival, el
presente trabajo tendrá como objetivo general el estudio de esta actividad y la
modificación de la misma por diversos factores, desglosándose en distintos objetivos
específicos:
1. Definir laConstante de Michaelis-Menden (Km) y velocidad máxima (Vmax).
2. Describir la función biológica de la amilasa y su importancia biomédica.
3. Describir como varia la actividad enzimática en función de la concentración
de sustrato y concentración de enzima.
4. Determinar la actividad de la amilasa salival a pH 3, 5, 7, 8 y 11 bajo
concentraciones saturantes de sustrato.
5. Determinar la actividad de la amilasa salival a temperaturas de 0, 37, 40 y
50°C bajo concentraciones saturantes de sustrato.
6. Determinar el efecto de la acarbosa, el ácido sulfúrico y cloruro de sodio
sobre la actividad de la enzima amilasa bajo concentraciones saturantes de
sustrato.
7. Elaborar las gráficas de la actividad enzimática en función de la concentración
de sustrato, variación de pH, variación de temperatura y variación en
presencia de inhibidores.
 REPORTE DE RESULTADOS
B) Efecto de la concentración de sustrato en la actividad enzimática
B.1. Preparación de los tubos experimentales y la absorbancia correspondiente
Tiempo
Buffer
Sustrato Incubación Enzima de Lugol Agua Abs a
pH 7,2
(ml) por 5 min (ml) reacción (ml) (ml) 600 nm
(ml)
(min)
1.0 1 37°C 0.5 2 min 1 ml 6.5 0.218
1.5 1 37°C 0.5 2 min 1 ml 6.0 0.306
2.0 1 37°C 0.5 2 min 1 ml 5.5 0.455
2.5 1 37°C 0.5 2 min 1 ml 5.0 0.172
3.0 1 37°C 0.5 2 min 1 ml 4.5 1.249
FUENTE: DATOS OBTENIDOS EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD DE
ORIENTE, NÚCLEO DE BOLÍVAR.

B.2. Preparación de los tubos control y la absorbancia correspondiente

Tiempo
Buffer Abs a
Sustrato Incubación Lugol de Agua
Controles pH 7,2 600
(ml) por 5 min (ml) reacción (ml)
(ml) nm
(min)
C1 1.0 1 37°C 1 ml 2 mi 7.0 0.895
C2 1.5 1 37°C 1 ml 2 min 6.5 1.600
C3 2.0 1 37°C 1 ml 2 min 6.0 2.206
C4 2.5 1 37°C 1ml 2min 5.5 2.893
C5 3.0 1 37°C 1 ml 2 min 5.0 3.506
FUENTE: DATOS OBTENIDOS EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD DE
ORIENTE, NÚCLEO DE BOLÍVAR.

B.3. Calculo de mmoles totales de almidón(CT)

Partiendo de la cantidad de almidón agregado en cada tubo, peso molecular
del sustrato en estudio, transformación de moles a mmoles y el volumen de almidón
expresado en litros, se obtiene:

T.1. 0,8 gr x 1 mol x 1000 mmoles x volumen 0,001 L =2,33x10-3mmol/L

L 342,2 g/mol 1 mol (1 ml)

T.2. 0,8 gr x 1 mol x 1000 mmoles x volumen 0,0015 L =3,51x10-3 mmol/L

L 342,2 g/mol 1 mol (1.5 ml)
T.3. 0,8 gr x 1 mol x 1000 mmoles x volumen 0,002 L =4,68x10-3 mmol/L
L 342,2 g/mol 1 mol (2 ml)

T.4. 0,8 gr x 1 mol x 1000 mmoles x volumen 0,0025 L =5,84x10-3 mmol/L

L 342,2 g/mol 1 mol (2,5 ml)

T.5. 0,8 gr x 1 mol x 1000 mmoles x volumen 0,003 L =7,01x10-3 mmol/L

L 342,2 g/mol 1 mol (3 ml)

B.4. Calculo de mmoles de almidón no metabolizados (CN)

Se construye una gráfica de tendencia, a partir de la absorbancia obtenida de
los tubos controles y, los mmoles de almidón totales correspondientes a los
anteriores. Se realiza extrapolación de la misma, a partir de las absorbancias
experimentales, para la obtención de mmoles de almidón no metabolizados (CN).

GRÁFICA 1.Gráfica de tendencia del almidón en función de la absorbancia.

FUENTE: DATOS OBTENIDOS EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD DE

ORIENTE, NÚCLEO DE BOLÍVAR.
B.5. Calculo de mmoles de almidón metabolizados (CS)
Mediante diferencia entre CT y CN.
T1.2,33x10-3– 0,3x10-3=2,03x10-3mmol/l
T2.3,51x10-3– 0,5x10-3=3,01x10-3mmol/l
T3.4,68x10-3– 0,8x10-3=3,88x10-3mmol/l
T4.5,84x10-3– 2,2x10-3=3,64x10-3mmol/l
T5.7,01x10-3– 2,6x10-3=4,41x10-3mmol/l

B.6.Cálculo de la velocidad inicial(Vo)

Mmoles de almidón metabolizados ÷ Tiempo de reacción.

T.1.2,03x10-3mmol/l = 1,015x10-3mmol/min
2 minutos

T.2.3,01x10-3mmol/l = 1,505x10-3mmol/min
2 minutos

T.3.3,88x10-3mmol/l = 1,94x10-3mmol/min
2 minutos

T.4.3,64x10-3mmol/l = 1,82x10-3mmol/min
2 minutos

T.5.4,41x10-3mmol/l = 2,205x10-3mmol/min
2 minutos
B.7. Tabla de resultados

Sustrato CT CN CS
Vo (Cs/Tr)
(ml) (mmoles/l) (mmoles/l) (mmol/l)
1,0 2,33x10-3 0,3x10-3 2,03x10-3 1,015x10-3
-3
1,5 3,51x10 0,5x10-3 3,01x10-3 1,505x10-3
2,0 4,68x10-3 0,8x10-3 3,88x10-3 1,94x10-3
2,5 5,84x10-3 2,2x10-3 3,64x10-3 1,82x10-3
-3
3,0 7,01x10 2,6x10-3 4,41x10-3 2,205x10-3
FUENTE: DATOS OBTENIDOS EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD DE
ORIENTE, NÚCLEO DE BOLÍVAR.

B.8. GRÁFICA 2.Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad inicial en

la hidrólisis del almidón.

FUENTE: DATOS OBTENIDOS EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD DE

ORIENTE, NÚCLEO DE BOLÍVAR.
C) Efecto de la concentración de enzimaen la actividad enzimática
C.1 Preparación de los tubos experimentales

Tiempo
Buffer
Sustrato Incubación Enzima de Lugol Agua Abs a
pH 7,2
(ml) por 5 min (ml) reacción (ml) (ml) 600 nm
(ml)
(min)
1 1 37°C 0.2 2 min 1 ml 6.8 0.781
1 1 37°C 0.4 2 min 1 ml 6.6 0.575
1 1 37°C 0.6 2 min 1 ml 6.4 0.390
1 1 37°C 0.8 2 min 1 ml 6.2 0.210
FUENTE: DATOS OBTENIDOS EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD DE
ORIENTE, NÚCLEO DE BOLÍVAR.

C.2. Preparación del único tubo control

Buffer
Sustrato Incubación Lugol Tr Agua Abs a
Controles pH 7,2
(ml) por 5 min (ml) (min) (ml) 600 nm
(ml)
CENZIMA 1.0 1 37°C 1 ml 1 ml 6.8 0.781
FUENTE: DATOS OBTENIDOS EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD DE
ORIENTE, NÚCLEO DE BOLÍVAR.

C.3. Calculo de mmoles totales de almidón (CT)

Partiendo de la cantidad de almidón agregado, peso molecular del sustrato en
estudio, transformación de moles a mmoles y el volumen de almidón expresado en
litros, se obtiene:
0,8 gr x 1 mol x 1000 mmoles x volumen 0,001 L = 2,33x10-3 mmol/L
L 342,2 g/mol 1 mol (1 ml)

C.4. Calculo de mmoles de almidón no metabolizados (CN)

Se elabora una regla de tres a partir de la absorbancia del único tubo control,
absorbancia de tubos experimentales y mmoles totales de almidón.

0,890 Abs 2,33x10-3 mmol/L TUBO 1

0,781 Abs X = 2,04x10-3 mmol/L

0,890 Abs 2,33x10-3 mmol/L TUBO 2

0,575 Abs X = 1,50x10-3 mmol/L
0,890 Abs 2,33x10-3 mmol/L TUBO 3
0,390 Abs -3
X = 1,02x10 mmol/L

0,890 Abs 2,33x10-3 mmol/L TUBO 4

0,210 Abs X = 5,49x10-4mmol/L

C.5. Calculo de mmoles de almidón metabolizados (CS)

Mediante diferencia entre CT y CN.
T1.2,33x10-3– 2,04x10-3 =2,9x10-4mmol/l
T2.2,33x10-3– 1,50x10-3 =8,3x10-4 mmol/l
T3.2,33x10-3– 1,02x10-3 =1,31x10-3 mmol/l
T4.2,33x10-3– 5,49x10-4=1,781x10-3 mmol/l

C.6. Cálculo de lavelocidad inicial (Vo)

Mmoles de almidón metabolizados ÷ Tiempo de reacción.

T.1.2,9x10-4mmol/l = 1,45x10-4 mmol/min

2 minutos

T.2.8,3x10-4mmol/l = 4,15x10-4mmol/min
2 minutos

T.3.1,31x10-3mmol/l = 6,55x10-4mmol/min
2 minutos

T.4.1,781x10-3mmol/l = 8,905x10-4mmol/min
2 minutos
C.7 Tabla de resultados

Sustrato CT CN CS Vo
E (ml)
(ml) (mmoles/l) (mmoles/l) (mmol/l) (Cs/Tr)
2,04x10-3 2,9x10-4 0.2 1,45x10-4
1,50x10-3 8,3x10-4 0.4 4,15x10-4
1 ml 2,33x10-3
1,02x10-3 1,31x10-3 0.6 6,55x10-4
5,49x10-4 1,78x10-3 0.8 8,90x10-4
FUENTE: DATOS OBTENIDOS EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD DE
ORIENTE, NÚCLEO DE BOLÍVAR.

C.8. GRÁFICA 3.Efecto de la concentración de enzima sobre la velocidad de la

reacción en la hidrólisis del almidón.

FUENTE: DATOS OBTENIDOS EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD DE

ORIENTE, NÚCLEO DE BOLÍVAR.
D) Efecto de la variación del pHen la actividad enzimática
D.1. Preparación de los tubos experimentales y la absorbancia correspondiente

Tiempo
Sustrato Buffer(1 Incubación Enzima de Lugol Agua Abs a
(ml) ml) por 5 min (ml) reacción (ml) (ml) 600 nm
(min)
1 1ml pH3 37°C 0.5 2 min 1 ml 6.5 0.870
1 1ml pH5 37°C 0.5 2 min 1 ml 6.5 0.540
1 1ml pH7,2 37°C 0.5 2 min 1 ml 6.5 0.056
1 1ml pH8 37°C 0.5 2 min 1 ml 6.5 0.130
1 1ml pH11 37°C 0.5 2 min 1 ml 6.5 0.895
FUENTE: DATOS OBTENIDOS EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD DE
ORIENTE, NÚCLEO DE BOLÍVAR.

D.2. Preparación de los tubos controles y la absorbancia correspondiente

Tiempo
Abs a
Sustrato Buffer Incubación Lugol de Agua
Controles 600
(ml) (1 ml) por 5 min (ml) reacción (ml)
nm
(min)
CpH3 1 pH3 37°C 1 ml 2 min 7 0.900
CpH5 1 pH5 37°C 1 ml 2 min 7 0.903
CpH7.2 1 pH7,2 37°C 1 ml 2 min 7 0.898
CpH8 1 pH8 37°C 1 ml 2 min 7 0.906
CpH11 1 pH11 37°C 1 ml 2 min 7 0.900

FUENTE: DATOS OBTENIDOS EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD DE

ORIENTE, NÚCLEO DE BOLÍVAR.

D.3 Calculo de mmoles totales de almidón (CT)

Partiendo de la cantidad de almidón agregado, peso molecular del sustrato en
estudio, transformación de moles a mmoles y el volumen de almidón expresado en
litros, se obtiene:
0,8 gr x 1 mol x 1000 mmoles x volumen 0,001 L = 2,33x10-3 mmol/L
L 342,2 g/mol 1 mol (1 ml)

D.4. Calculo de mmoles de almidón no metabolizados (CN)

Se elabora una regla de tres a partir de la absorbancia delos tubos controles,
absorbancia de tubos experimentales y mmoles totales de almidón.
0,900 Abs 2,33x10-3 mmol/L TUBO 1
0,870 Abs X = 2,25x10-3 mmol/L

0,903 Abs 2,33x10-3 mmol/L TUBO 2

0,540 Abs -3
X = 1,39x10 mmol/L

0,898 Abs 2,33x10-3 mmol/L TUBO 3

0,056 Abs X = 1,45x10-4mmol/L

0,906 Abs 2,33x10-3 mmol/L TUBO 4

0,130 Abs X = 3,34x10-4 mmol/L

0,900 Abs 2,33x10-3 mmol/L TUBO 5

0,895 Abs -3
X = 2,30x10 mmol/L

D.5. Calculo de mmoles de almidón metabolizados (CS)

Mediante diferencia entre CT y CN.
T1.2,33x10-3– 2,25x10-3=8x10-5mmol/l
T2.2,33x10-3– 1,39x10-3=9,4x10-4 mmol/l
T3.2,33x10-3– 1,45x10-4=2,185x10-3 mmol/l
T4.2,33x10-3– 3,34x10-4=1,996x10-3 mmol/l
T5.2,33x10-3– 2,30x10-3=3x10-5 mmol/l

D.6. Cálculo de la velocidad inicial (Vo)

Mmoles de almidón metabolizados ÷ Tiempo de reacción.

T.1.8x10-5mmol/l = 4x10-5mmol/min
2 minutos

T.2.9,4x10-4mmol/l = 4,7x10-4mmol/min
2 minutos
T.3.2,185x10-3mmol/l = 1,0925x10-3 mmol/min
2 minutos

T.4.1,996x10-3mmol/l = 9,98x10-4mmol/min
2 minutos

T.5.3x10-5mmol/l = 1,5x10-5mmol/min
2 minutos
D.7 Tabla de resultados

Sustrato CT CN CS
pH Vo (Cs/Tr)
(ml) (mmoles/l) (mmoles/l) (mmol/l)
2,25x10-3 2,9x10-4 3 4x10-5
1,39x10-3 8,3x10-4 5 4,7x10-4
-3
1 ml 2,33x10 1,45x10-4 1,31x10-3 7,2 1,0925x10-3
3,34x10-4 1,78x10-3 8 9,98x10-4
2,30x10-3 3x10-5 11 1,5x10-5
FUENTE: DATOS OBTENIDOS EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD DE
ORIENTE, NÚCLEO DE BOLÍVAR.
D.8. GRÁFICA 4.Efecto del pH sobre la actividad enzimática de la amilasa salival

FUENTE: DATOS OBTENIDOS EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD DE

ORIENTE, NÚCLEO DE BOLÍVAR.
E) Efecto de la variación de la temperaturaen la actividad enzimática
E.1 Preparación de los tubos experimentales

Tiempo
Buffer
Sustrato Incubación Enzima de Lugol Agua Abs a
pH 7,2
(ml) por 5 min (ml) reacción (ml) (ml) 600 nm
(ml)
(min)
1 1 0°C 0.5 2 min 1 ml 6.5 0.913
1 1 37°C 0.5 2 min 1 ml 6.5 0.008
1 1 40°C 0.5 2 min 1 ml 6.5 0.154
1 1 50°C 0.5 2 min 1 ml 6.5 0.947
FUENTE: DATOS OBTENIDOS EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD DE
ORIENTE, NÚCLEO DE BOLÍVAR.

E.2. Preparación los tubos controles

Buffer Tiempo
Sustrato pH Incubación Lugol de Agua Abs a
Controles
(ml) 7,2 por 5 min (ml) reacción (ml) 600 nm
(ml) (min)
CTEMPO0 1 1 0°C 1 ml 2 min 7 0.920
CTEMPO37 1 1 37°C 1 ml 2 min 7 0.917
CTEMPO40 1 1 40°C 1 ml 2 min 7 0.923
CTEMPO50 1 1 50°C 1 ml 2 min 7 0.950
FUENTE: DATOS OBTENIDOS EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD DE
ORIENTE, NÚCLEO DE BOLÍVAR.

E.3. Calculo de mmoles totales (CT)

Partiendo de la cantidad de almidón agregado, peso molecular del sustrato en
estudio, transformación de moles a mmoles y el volumen de almidón expresado en
litros, se obtiene:
0,8 gr x 1 mol x 1000 mmoles x volumen 0,001 L = 2,33x10-3 mmol/L
L 342,2 g/mol 1 mol (1 ml)

E.4. Calculo de mmoles de almidón no metabolizados (CN)

Se elabora una regla de tres a partir de la absorbancia delos tubos controles,
absorbancia de tubos experimentales y mmoles totales de almidón.

0,920 Abs 2,33x10-3 mmol/L TUBO 1

0,913 Abs X = 2,31x10-3 mmol/
0,917 Abs 2,33x10-3 mmol/L TUBO 2
0,008 Abs X = 2,03x10-3 mmol/L

0,923 Abs 2,33x10-3 mmol/L TUBO 3

0,154 Abs -4
X = 3,88x10 mmol/L

0,950 Abs 2,33x10-3 mmol/L TUBO 4

0,947 Abs X = 2,32x10-3mmol/L

E.5. Calculo de mmoles de almidón metabolizados (CS)

Mediante diferencia entre CT y CN.
T1.2,33x10-3– 2,31x10-3=2x10-5mmol/l
T2.2,33x10-3– 2,03x10-5=2,30x10-3 mmol/l
T3.2,33x10-3– 3,88x10-4=1,942x10-3 mmol/l
T4. 2,33x10-3– 2,32x10-3=1x10-5 mmol/l

E.6. Cálculo de lavelocidad inicial (Vo)

Mmoles de almidón metabolizados ÷ Tiempo de reacción.

T1.2x10-5mmol/l = 1x10-5mmol/min
2 minutos

T2.2,30x10-3mmol/l = 1,15x10-3mmol/min
2 minutos

T3.1,942x10-3mmol/l = 9,71x10-4mmol/min
2 minutos

T4.1x10-5mmol/l = 5x10-6mmol/min
2 minutos
E.7 Tabla de resultados

Sustrato CT CN CS Temperatura Vo
(ml) (mmoles/l) (mmoles/l) (mmol/l) °C (Cs/Tr)
2,31x10-3 2x10-5 0 1x10-5
2,03x10-5 2,30x10 -3
37 1,15x10-3
1 ml 2,33x10-3
3,88x10-4 1,94x10 -3
40 9,71x10-4
2,32x10-3 1x10-5 50 5x10-6
FUENTE: DATOS OBTENIDOS EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD DE
ORIENTE, NÚCLEO DE BOLÍVAR.
E.8. GRÁFICA 5.Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática de la amilasa
salival.

FUENTE: DATOS OBTENIDOS EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA DE LA UNIVERSIDAD DE

ORIENTE, NÚCLEO DE BOLÍVAR.
 DISCUSION DE RESULTADOS
La cinética enzimática hace referencia a los aspectos cuantitativos de las
reacciones catalizadas por enzimas, así como a los factores que las modulan.
La cinética de las reacciones químicas implica la colisión entre las partículas.
Ello se requiere para la aproximación de los reactantes (o sustratos), la formación de
los enlaces que se necesiten, y la liberación de la adecuada energía cinética capaz de
alcanzar el estado energético de transición. Todo ello implica que cualquier factor que
incremente la frecuencia de las colisiones o la energía de las mismas entre los
sustratos va a incrementar la velocidad de la reacción correspondiente.
Un aumento de la temperatura, por ejemplo, supone un incremento de la
energía cinética de las moléculas que van a reaccionar. Ello implica un incremento de
su motilidad, lo cual conlleva una mayor frecuencia de colisión. En consecuencia, la
combinación de mayor frecuencia de colisión y mayor energía hace que la velocidad
de la reacción aumente.
Otro factor que facilita la colisión entre las moléculas reactantes es su
concentración.La velocidad inicial de una reacción catalizada por una enzima
depende de la concentración de sustrato. A medida que aumenta la concentración de
sustrato, la velocidad inicial aumenta hasta que la enzima está completamente
saturada por el sustrato.
Las velocidades iniciales obtenidas en la experiencia B a varias
concentraciones de sustrato, fueron representadasen la gráfica 2 de la misma (paso
B.8),observando el comportamiento cinético conocido como curva de saturación
hiperbólica, esta constituye la norma seguida por la mayoría de los enzimas.

En general, se obtiene una hipérbola rectangular en cualquier proceso que

suponga interacción o fijación de reactivos u otras sustancias a un númeroespecífico,
pero limitado, de centros. La velocidad de la reacción alcanza un límite máximo en el
punto en que todos los centros asequibles están saturados.

De igual manera la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente es

proporcional a la cantidad de enzima en la mezcla de ensayo. Cuando aumente la
cantidad de enzima, las moléculas actuaran independientemente en solución para
transformar más sustrato en un intervalo de tiempo.
Debeexistir entonces una relación lineal entre la concentración de enzima
presente en la muestra y la velocidad de la reacción catalizada por la misma, a una
concentración de sustrato dada.Esta relación lineal entre concentración de enzima y
velocidad inicial es apreciable en la gráfica 3 de la experiencia C (paso C.8).

Así mismo, las modificaciones en la concentración de iones hidrogeno

conllevan a cambios moleculares que tienen lugar en la acción catalítica de las
enzimas.
 Casi todas las enzimas muestran un perfil de la velocidad frente al pH de
forma acampanada, si bien el máximo (pH óptimo) varía mucho según la enzima.

Los resultados de forma acampanada son los esperados en la gráfica 4 de la

experiencia D (paso D.8), según esta, el pH óptimo (punto máximo) de la enzima
amilasa salival corresponde a 7,2, mientras que a valores extremos de pH se produce
desnaturalización de la enzima.

La curva acampanada y su posición sobre el eje de las X dependen del estado

particular de ionización del sustrato que estará unido de manera óptima al enzima.
Esto a su vez está relacionado con la ionización de aminoácidos específicos que
constituyen el centro de fijación del sustrato. Además, aquellos aminoácidos
implicados en la catálisis de la reacción deben estar, para ser funcionales, en el pH
correcto.

De manera similar, las gráficas de velocidad frente a temperatura de muchas

enzimas revelan una curva en forma de campana, con un óptimo entre 40 y 45 °C. La
velocidad de la reacción enzimática se incrementa al aumentar la temperatura dentro
de un determinado rango, alcanzando un valor máximo a la denominada temperatura
óptima.

En el caso de la experiencia E, (gráfica 5, paso E.8) el punto máximo de la

forma acampanada (y por lo tanto la temperatura optima de la enzima en estudio)
corresponde a 37°C.

Valores alejadosa esta temperatura reflejan un doble efecto; positivo a bajos

valores, debido al incremento general que experimenta la velocidad de cualquier
reacción química al hacerlo la temperatura, y negativo a valores altos, debido a la
desnaturalización térmica del enzima.

Las enzimas son moléculas proteicas y, si absorben demasiada energía, su

estructura terciaria se rompe, la enzima se desnaturaliza y pierde su actividad
catalítica. Así, al aumentar la temperatura, el aumento esperado de velocidad debido
al aumento de las colisiones E + S es contrarrestado por el aumento en la velocidad
de desnaturalización.

Dado que las enzimas guían y regulan el metabolismo de una célula, tienden a
estar cuidadosamente monitoreadas. Las enzimas pueden ser reguladas por otras
moléculas que aumentan (cofactores) o bien disminuyen (inhibidores) su actividad.

Muchas enzimas sólo catalizan la transformación del sustrato en presencia de

un cofactor no proteico, que participa directamente en la unión del sustrato o en la
catálisis. Estos cofactores son grupos prostéticos, cofactores y coenzimas, los cuales
amplían las capacidades catalíticas de las enzimas por encima del limitado número de
grupos funcionales presentes en las cadenas laterales de los aminoácidos.

Tal es el caso del cloruro de sodio (NaCl), cuyo mecanismo activador

responsabiliza a la α-amilasa por contenerCl en sus restos aminoacídicos del sitio
activo, y por ello, al interactuar con NaCl, los aniones cloruro se unen al sitio activo
aumentando la actividad enzimática. Por lo que la actividad catalítica de la enzima en
estudioes directamente proporcional al aumento de la cantidad de NaCl.

Como se mencionó anteriormente, existen moléculas conocidas, los llamados

inhibidores que se encargan de disminuir la actividad catalítica de una enzima.

Existen distintos tipos de inhibidores, pero de una forma general la inhibición

enzimática puede ser reversible o irreversible.

En el primer caso, el inhibidor se une a la enzima de forma no

covalentemediante interacciones del mismo tipo, tales como los puentes de
hidrógeno, interacciones hidrofóbicas y enlaces iónicos.

Además de la inhibición por el producto inmediato, una enzima determinada

puede ser también inhibida o incluso activada por los productos de otras enzimas.
Existen tres clases principales de inhibidores reversibles: competitivos, no
competitivos y acompetitivos.

Los inhibidores competitivos son aquellos inhibidores cuya acción puede ser
contrarrestada por cantidades crecientes de sustrato. Los inhibidores competitivos son
estructuralmente similares al sustrato y se unen al centro de fijación del mismo,
compitiendo con éste por la enzima.

Dado que el sustrato y el inhibidor compiten por el mismo centro de la

enzima, la Km del sustrato muestra un incremento aparente en presencia del
inhibidor. Esto queda plasmado en una gráfica de doble recíproco como un
desplazamiento en la intersección en el eje de las X y en la pendiente de la línea.

Gran parte de la farmacoterapia moderna está basada en los conceptos de la

inhibición enzimática. Tal es el caso de la acarbosa, fármaco que actúa como un
inhibidor competitivo, impidiendola unión del almidón al centro activo de la amilasa
salival.

La acarbosa es un oligosacárido utilizado como fármaco para tratar la diabetes

mellitus tipo 2 gracias a su acción inhibitoria sobre las enzimas glucósido hidrolasas a
partir de carbohidratos complejos.

Este fármacoreduce el nivel de glucosa en la sangre mediante el bloqueo de la

descomposición por la enzima alfa-glucosidasa de almidones (tales como el pan, las
patatas y las pastas), dextrina y disacáridos en el intestino. Reduce el ritmo de
descomposición de ciertos azúcares, como el azúcar de mesa. Su acción lentifica la
absorción de carbohidratos reduciendo, ultimadamente, el aumento del nivel de
glucosa en la sangre después de las comidas en pacientes con y sin diabetes.
Un inhibidor no competitivo se fija en un centro diferente del centro de
fijación del sustrato. Su inhibición no es contrarrestada mediante concentraciones
crecientes de sustrato. Se forman complejos binarios (EI) y ternarios (EIS), siendo
ambos catalicamente inactivos y, por tanto, complejos finales.

El inhibidor no competitivo actúa como si eliminase enzima activa de la

solución, lo que da lugar a una disminución de Vmax. Este efecto se puede apreciar
gráficamente en la representación de los dobles recíprocos, en donde Km no cambia
pero si lo hace Vmax. La inhibición puede ser a menudo contrarrestada mediante
diálisis exhaustiva de la enzima inhibida, siempre que el inhibidor no haya
reaccionado covalentemente con la enzima.

El inhibidor acompetitivo solo se fija al complejo Enzima-Sustrato dela

enzima. El resultado es un cambio de Km y de Vmax que queda reflejado en la
gráfica de dobles recíprocos como una líneaparalela a la dela enzima no inhibida.

En el caso de la inhibición irreversible, el inhibidor se une covalentemente a la

enzima, que queda incapacitada para llevar a cabo su acción catalítica. Ejemplo
deeste tipo de inhibidorseria el ácido sulfúrico (H2SO4).

Este compuesto extremadamente acido, se une de manera covalente a la

enzima y actúa como un inhibidor de tipo irreversible para la amilasa salival, se
formara el ensamble Enzima-Inhibidor (EI) y no sucede la catálisis para la formación
de producto.

En los casos de modificación covalente del centro de fijación o del centro

activo, la inhibición no será reversible por diálisis a menos que el enlace sea
químicamente lábil, como en el caso de un éster o un tioéster.
G. A continuación, se anexa el artículo científico solicitado en la práctica.
Título: Lipasa y amilasa total y sus isoenzimas como marcadores de daño
pancreático en pacientes tratados con fármacos antiepilépticos.
Fuente: https://www.sefh.es/fh/83_6.pdf
El estudio mencionado tiene como objetivo el estudio de la lipasa y amilasa
total y sus isoenzimas en suero como indicadores bioquímicos de daño pancreático en
pacientes tratados con ácido valproico y con otros fármacos antiepilépticos inductores
enzimáticos.
La asociación entre el riesgo de pancreatitis aguda y la administración de
fármacos antiepilépticos es un hecho altamente documentado. En pacientes
medicados con ácido valproico los valores de amilasa sérica están ligeramente
elevados, sin embargo la determinación clínica de este hecho es incierta.
Se estudiaron 91 pacientes epilépticos, los cuales fueron divididos en dos
grandes grupos según el tratamiento administrado (un grupo para ácido valproico y
otro para fenitoína, fenobarbital y carbamazepina).Además del grupo control que
estaba representado por 31 pacientes sanos.
La amilasa total y la isoenzima pancreática, además de la lipasa total, fueron
calculadas a través de complejos analizadores. La diferencia entre las actividades de
amilasa total y pancreática arrojo valores de la isoenzima salivar.
Como resultado, el grupo de pacientes tratados con fenitoína, fenobarbital y
carbamazepina, presentó diferencias clínicamente significativas con respecto al grupo
control para lipasa y amilasa pancreática. Para pacientes tratados con ácido valproico
no se alcanzó una diferencia clínicamente significativa para ninguna de las variables
estudiadas.
Sin embargo, no se encontró una correlación significativa de la dosificación o
el nivel de los distintos fármacos administrados con las actividades séricas de lipasa,
amilasa total y amilasa pancreática.A excepción de dos (2) casos en el grupo de
pacientes tratados con fenitoína, fenobarbital y carbamazepina, donde se alcanzaron
niveles de amilasa pancreática con entidad suficiente para sugerir un daño
pancreático.
No se encontró una correlación significativa, de signo positivo o negativo, de
la amilasa total con la proporción relativa de amilasa pancreática. Esto indicaría que,a
nivel poblacional en estos pacientes, una mayor actividad de amilasa sérica no
supondría un aumento preferente de uno u otro de los tipos isoenzimáticos
pancreático o salivar.
La pancreatitis aguda producida por al ácido valproico se trataría
posiblemente de una complicación de tipo idiosincrásico, con una debatida relación
con la edad del paciente, tiempo de tratamiento y dosificación. Como mecanismo
responsable se ha propuesto el efecto tóxico directo de los fármacos mediado por
radicales libres.
Solo en un paciente se encontró la mayor actividad de amilasa total de todos
los casos estudiados, correspondiendo preferentemente a un aumento de la isoenzima
de tipo salivar con amilasa pancreática y lipasa en rango de normalidad. Lo que hace
evidente la escasa importancia de la determinación de amilasa total para el
diagnóstico de un daño pancreático en pacientes bajo las mismas condiciones.
A la vista de los resultados, la determinación periódica de la amilasa de tipo
pancreático en pacientes epilépticos podría tener interés en la práctica clínica.
H. Ejercicio de inhibidores enzimáticos
Las prostaglandinas son moléculas asociadas a la aparición de fiebre,
inflamación y dolor. Se producen a partir de ácido araquidónico a través de una
reacción enzimática. La enzima que cataliza la reacción utiliza oxigeno para convertir
el ácido araquidónico (sustrato) en PGG2 (producto), precursor inmediato de muchas
prostaglandinas.

Experimentalmente se investigó el efecto de varios fármacos como

inhibidores en la formación de prostaglandinas. A partir de los siguientes datos se
elaboró una gráfica de Lineweaver-Burk.

Reacción Reacción Reacción Reacción

Reacción
con 15 con 10 con 20 con 10
Concentración sin
mg/mL de mg/mL de mg/mL de mg/mL de
de sustrato inhibidor
fármaco P fármaco Q fármaco R fármaco S
(Ácido
Velocidad Velocidad Velocidad Velocidad Velocidad
araquidónico)
de de de de de
(mM)
formación formación formación formación formación
de PGG2 de PGG2 de PGG2 de PGG2 de PGG2
0,050 0,330 0,200 0,253 0,140 0,166
0,100 0,500 0,330 0,350 0,250 0,253
0,670 0,670 0,500 0,444 0,400 0,344
0,830 0,830 0,710 0,519 0,630 0,434

En el siguiente cuadro, los valores inversos de ([Sustrato]-1), junto con (V0-1)

de PGG2, que se graficarán a continuación.

V0-1 sin V0-1 del V0-1 del V0-1 del V0-1 del
[Sustrato]-1
inhibidor fármaco P fármaco Q fármaco R fármaco S
20 3,03 5 3,95 7,14 6,02
10 2 3,03 2,86 4 3,92
5 1,49 2 2,25 2,5 2,91
2 1,20 1,41 1,93 1,59 2,30

Para realizar la gráfica de dobles recíprocos, mejor conocida como gráfica de

Lineweaver-Burk en el eje de las abscisas (Y), se deben graficar los valores de los
inversos de la velocidad de formación V0-1, junto con los valores inversos de la
concentración de sustrato ([Sustrato]-1) en el eje de las ordenadas (X).
 El punto de corte con el eje de las abscisas (Y) muestra el valor inverso de la
velocidad máxima (Vmáx-1). El punto de corte con el eje de las ordenadas (X), nos
indica el valor inverso negativo del Km (-Km-1), el cual nos permite saber con
precisión la afinidad de la enzima por el sustrato. Mientras más cerca este el punto de
corte con el 0, mayor será el Km, por lo tanto menor será la afinidad de la enzima por
el sustrato.

Gracias a los datos obtenidos en la gráfica de Lineweaver-Burk para el estudio

de los fármacos inhibidores de la reacción enzimática que forman a las
prostaglandinas, se demostró que la enzima en condiciones normales tiene un Km de
0.095 mM y una Vmáx de 1mM/Min.

El fármaco P, ejerce una inhibición competitiva, este tipo de inhibidor se une

a la enzima en su centro activo, impidiendo que se forme el complejo enzima-
sustrato. Este fármaco produce en la enzima un aumento de Km a 0,20 mM, causando
una disminución de la afinidad de la enzima por el sustrato. La Vmáx de la enzima se
mantiene en 1mM/Min.

El fármaco Q, inhibe a la enzima de manera acompetitiva, este tipo de

inhibidor se une al complejo enzima-sustrato, de esta manera el sustrato no queda
libre para disociarse de la enzima y produce una disminución del Km a 0,07 mM. La
Vmáx también disminuyó a 0,61mM/min.

El fármaco R demostró ser un inhibidor competitivo también, la enzima

mantuvo una Vmáx igual a 1mM/min. El Km aumentó a 0,313 mM.

Con respecto al fármaco S, evidenció ser un inhibidor no competitivo mixto,

ya que, este tipo de inhibidor se acopla a la enzima en un sitio cercano al centro
activo, impidiendo la unión del sustrato a la enzima. Este inhibidor alteró los valores
de Km a 0,112 mM y de Vmáx a 0,54 mM/min.

Se concluyó que el fármaco más eficaz para inhibir la formación de PGG2 es

el fármaco R, debido a que tiene el valor de Km más alto, es decir, es el que reduce
en mayor proporción la afinidad de la enzima por el ácido araquidónico (sustrato). En
segundo lugar le sigue el fármaco P. El fármaco S queda en tercer lugar por su
eficacia. Finalmente el fármaco Q como el menos eficiente.
 CONCLUSIONES
La frecuencia con la cual las moléculas chocan es directamente proporcional a
sus concentraciones. Para dos moléculas diferentes, E y S, que sufren aumento de
concentración la probabilidad de choque aumentará significativamente.
Cuando aumente la cantidad de enzima, las moléculas actuaran
independientemente en solución para transformar más sustrato en un intervalo de
tiempo.
Aumentar la temperatura incrementa la energía cinética de las moléculas y su
rapidez de movimiento y, en consecuencia, la frecuencia con la cual chocan. Esta
combinación de choques más frecuentes y energéticos aumenta el índice de reacción.
Casi todas las enzimas intracelulares muestran actividad óptima a valores de
pH entre 5 y 9, como en el caso de la amilasa, cuyo valor óptimo de pH es 7,2.
La inhibición de la amilasa salival es dependiente del medio y las condiciones
en las que esta se encuentra. Es desnaturalizada por el ácido sulfúrico y detenida por
la acarbosa. En contraste, los aumentos de Nacl son directamente proporcionales a la
actividad de la amilasa salival.
 BIBLIOGRAÍA

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