1.

INTRODUCCIÓN:

Para determinar la cantidad de enzima presente en una muestra, para este caso se trata de
una muestra de extracto crudo de hígado, se midió la velocidad de reacción. La velocidad
inicial de una reacción catalizada por una enzima depende de la cantidad de sustrato y de
enzima presente (Devlin. T. 2004).

Para mostrar que existe relación directa de la concentración de enzima con la velocidad de
reacción, se muestra la siguiente gráfica que relaciona en sus ejes el tiempo y la formación
de producto. Todas las muestras tienen las mismas concentraciones de sustrato, variando las
cantidades de enzima (Devlin. T. 2004).

En la figura se aprecia que cuando la cantidad de enzima se duplica la velocidad inicial

aumenta dos veces. Por esta razón se trabaja con la velocidad de reacción para hallar el
contenido de enzima (Devlin. T. 2004).

Una manera de expresar la velocidad de reacción es la actividad enzimática. Según la

Comisión de enzimas (E.C.) de la Unión Internacional de Bioquímica , se define a la unidad
internacional de enzima (U) como, la cantidad de enzima que cataliza 1 micromol de sustrato
por minuto en condiciones definidas (Dolores de Arriaga et. al. 1978).

También se podría usar la actividad específica; se define como, el número de micromoles de

producto formado por minuto por miligramo de proteína o mililitro de enzima. De manera
general puede decir que la actividad específica de una enzima es 𝑣𝑟𝑥 /𝑚𝑔𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 (Dolores de
Arriaga et. al. 1978).

Para la determinación de proteínas por el método de Biuret (en medio alcalino regulado), los
enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con los iones cúpricos del reactivo, dando un
complejo de color azul- violáceo cuya intensidad se mide fotometricamente a 540 nm en un
espectrofotómetro (GT Laboratorio S.R.L. 2014). Se utilizó albúmina suero de bovino (ASB)
como estándar (Johnson M. 2012 y Carrillo Soto J. 2013) para la formación de la curva
principal de absorbancia y miligramos de muestra.

2. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO:
2.1. MATERIALES:
● Espectrofotómetro
● Vortex
● Baño María
● Tubos de ensayo
● Gradilla
● Micropipetas

2.2. REACTIVOS:
● Agua destilada
● Solución madre de albúmina
● Extracto crudo de hígado
● Reactivo de Biuret

2.3. PROCEDIMIENTO:
● Rotular 8 tubos con la denominación: B, E1, E2, E3, E4, E5, M1, RM
● Agregar agua, en ml, en las siguientes cantidades en el mismo orden de rotulación:
0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0, 0.4, 0.4.
● Agregar la solución estándar de albúmina, en ml, en el orden de rotulación como sigue:
0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0, 0.
● Adicionar 0.1 ml de extracto crudo de hígado a los tubos M y RM.
● Agregar 2.5 ml del reactivo de Biuret a todos los tubos.
● Llevar a baño María a 37 °C por un periodo de 10 minutos
● Leer en el espectrofotómetro a 540 nm, calibrando a 0 con el tubo B (blanco).

CUADRO DE RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO

REACTIVOS TUBO B E1-E5 M-RM

AGUA 0.5 ml E1: 0.4 m l M: 0.4 ml

E2: 0.3 ml RM: 0.4 ml
E3: 0.2 ml
E4: 0.1 ml
E5: 0 ml

SOLUCIÓN MADRE E1: 0.1 m l

ALBÚMINA E2: 0.2 ml
-------- E3: 0.3 ml --------------
E4: 0.4 ml
E5: 0.5 ml

EXTRACTO CRUDO -------- ---------- M: 0.1 ml

HÍGADO RM: 0.1 ml

REACTIVO BIURET 2.5 ml 2.5 ml (todos los tubos) 2.5 ml (todos los tubos)

Incubar a 37 °C por 10 minutos

3. RESULTADOS:
La siguiente tabla muestra los resultados obtenidos a nivel de laboratorio, los cuales muestran
las absorbancias obtenidas a 540 nm y calibrando a cero de absorbancia con el tubo blanco.

M1 M2 M3 M4 M5 M6

E1 0.036 0.044 0.050 0.041 0.045 0.048

E2 0.076 0.085 0.092 0.089 0.093 0.092

E3 0.130 0.132 0.138 0.134 0.133 0.137

E4 0.168 0.178 0.184 0.178 0.182 0.194

E5 0.215 0.226 0.229 0.225 0.244 0.228

Alícuota del 0.1 0.05 0.2 0.300 0.25 0.15

extracto(ml)

M 0.133 0.074 0.286 0.430 0.434 0.214

RM 0.137 0.072 0.284 0.447 0.474 0.209

4. CÁLCULOS:
a) Hallar el promedio de las absorbancias de los tubos con albúmina

Los valores en los cuadros plomos no son considerados ya que pueden conducir a
error al hallar la regresión.

b) Hallar las concentraciones de albúmina en cada tubo:

Nuestra solución estándar de proteína fue de 5 mg/mL y se agregó distintas cantidades
a cada tubo, a continuación los cálculos para determinar la concentración.
c) Elaborar curva de calibración

d) Determinar concentración de proteínas en extracto crudo

 d.1) Sacar promedio de absorbancias por mesa

d.2) Reemplazar “A prom” en la ecuación lineal “y = 0.0027x - 0.0003”

d.3) ordenando los resultados

El cuadro color amarillo indica que el resultado de la mesa 5 no concuerda con el resto
de mesas.

d.4) Determinar la concentración de proteínas en el tubo muestra y

posteriormente en el extracto crudo:

● Mesa N°2
27.148 mg --------- 100 ml
0.815 mg --------- 3 ml (tubo de ensayo)

0.815 mg --------- 0.05 ml (sobrenadante)

16.289 mg --------- 1 ml

⤍ 16.3 mg de proteína /ml de sobrenadante

● Mesa N°1
50.111 mg --------- 100 ml
1.503 mg --------- 3 ml (tubo de ensayo)

1.503 mg --------- 0.1 ml (sobrenadante)

15.03 mg --------- 1 ml

⤍ 15.03 mg de proteína /ml de sobrenadante

● Mesa N°6
78.630mg --------- 100 ml
2.359 mg --------- 3 ml (tubo de ensayo)
 2.359 mg --------- 0.15 ml (sobrenadante)
15.726 mg --------- 1 ml

⤍ 15.73 mg de proteína /ml de sobrenadante

● Mesa N°3
105.667 mg --------- 100 ml
3.170 mg --------- 3 ml (tubo de ensayo)

3.170 mg --------- 0.2 ml (sobrenadante)

15.85 mg --------- 1 ml

⤍ 15.85 mg de proteína /ml de sobrenadante

● Mesa N°4
162.704 mg --------- 100 ml
4.881 mg --------- 3 ml (tubo de ensayo)

4.881 mg --------- 0.3 ml (sobrenadante)

16.270 mg --------- 1 ml

⤍ 16.3 mg de proteína /ml de sobrenadante

d.5) Promediar resultados de proteinas:

Los resultados de la mesa 1 y 5 no son considerados debido a que pueden conducir a error
del resultado.

5. DISCUSIONES:

En la práctica hay métodos utilizados con diferentes fundamentos fisicoquímicos para la

determinación de proteínas totales,entre ellos tenemos la técnica colorimétrica de Biuret, se
basa en la propiedad que presentan los compuestos con enlaces peptídicos en reaccionar en
medio alcalino con sales de cobre formando un complejo. La intensidad de color es
proporcional al número de enlaces peptídicos que existen en la muestra y por lo tanto a la
concentración de proteínas, este método no es muy sensible, sin embargo, actualmente es el
método más usado por su simplicidad junto a su adecuada precisión. (Jacobo Díaz Portillo, 1997)

La concentración se calcula entonces como un porcentaje de la proteína total que se

determinó mediante el uso de métodos colorimétricos de biuret, en la cual se mide a partir de
muestras estándares de albúmina,ya que el plasma contiene un gran número de proteínas
químicamente diferentes, a cuyo conjunto se le denomina proteínas totales, y su
determinación analítica es en base a la albúmina por ser la proteína de mayor concentración
plasmática. (Laura E. Matarese, 2004)

Mediante la relación directa entre la absorbancia y concentración de proteínas (albúmina)

justificada en una ecuación lineal y = 0.0027x - 0.0003, se pudo determinar las
concentraciones de las muestras en sus diferentes volúmenes de alícuotas.

Los rangos normales de proteínas totales en plasma en humanos son 6.0 a 8.3 g/dl estos
valores pueden variar ligeramente entre pruebas realizadas en diferentes laboratorios,y los
rangos de bovinos vacunos de 2 a 15 años oscilan un aproximado de 8.12 a 8.93 g/dl, levando
a las unidades correspondientes nuestro promedio de resultados tenemos: 1.605
g/dl.(Pereira, 1988)

La falta de relación de nuestros resultados al rango, se puede deber a los errores mínimos
que se dan en la prueba pero que tiene elevada significancia al realizar los cálculos
respectivos.

6. CONCLUSIONES:

● A una menor dilución de la muestra existe una mayor concentración de proteínas

determinadas por el reactivo de Biuret.

● Se verifica en la ecuación lineal y = 0.0027x - 0.0003, la relación directamente

proporcional entre las concentraciones de las proteínas con las absorbancias
registradas por el espectrofotómetro.

● El promedio de las muestras llevadas a las unidades correspondientes no están en el

rango de los valores normales para bovinos.
7. RECOMENDACIONES:

❏ Realizar los procedimientos detenidamente con el fin de disminuir los errores técnicos.

❏ Se pueden usar otras técnicas para la determinación de la concentración proteica

como la refractometría a partir de la medida del índice de refracción
8. BIBLIOGRAFÍA:

● Devlin homas M. Bioquímica. Libro de texto con aplicaciones clínicas. 4° edición.

Editorial REVERTÉ S.A. Barcelona. 2004.

● Dolores de Arriaga M., Soler J., Busto F. y Cadenas E. Cinética enzimática: Manejo
de datos. Universidad de Oviedo. Departmento de Bioquímica. Facultad de Biología y
Veterinaria. León. 1978.

● GT Laboratorio S.R.L. Proteínas totales y albúmina. Industria y Tecnología Argentina.

Santa Fe- Argentina. 2014.
http://www.gtlab.com.ar/UserFiles/mediaManager/1/55f6d35094d6069881b8ee85a50
c4584f9013046_b01f269217344dd426efa84f3eacd313b23183de.pdf
○
● Johnson Mary. Revisión sobre ensayos para cuantificar proteínas. New Jersey-
Estados Unidos. 2012.
○
● Carrillo Soto J. G., Candia Plata M., Lugo Sepúlveda R. E., Espinoza Ojeda E., Noriega
Rodríguez J. A. Evaluación de Procedimientos de Tinción para el Análisis de Proteínas
por Electroforesis (SDS-PAGE). INVERNUS. Volumen 8 No. 1. 2013.
○
● Jacobo Díaz Portillo, M. T. (1997). Aspectos básicos de bioquímica clínica. En M. T.
Jacobo Díaz Portillo, Aspectos básicos de bioquímica clínica (págs. 46-48). Madrid:
Diaz de Santos.

● Laura E. Matarese, M. M. (2004). Nutrición clínica práctica. En M. M. Laura E.

Matarese, Nutrición clínica práctica (págs. 48-49). Barcelona: Elsevier Esapña, 2da
Edición.

● Pereira, J. G.-P. (1988). Proteínas totales ferograma y enzima séricas en bovinos

blanca cacereña de diferentes edades y en gestación. Anales Veterinarios , 41-45.