Práctica N°5: Cinética Enzimática I

Experimento I: Determinación de la velocidad inicial.

Objetivos:
a) Definir las condiciones del sistema enzimático y medir la actividad
enzimática de la amilasa a través del tiempo.
Teoría:
La presencia de una enzima se demuestra siguiendo la desaparición del substrato o
aparición del producto de la reacción. Para ello la enzima es incubada con el substrato bajo
condiciones cuidadosamente controladas y se sacan alícuotas a intervalos de tiempo para ser
analizadas. Debe considerarse además controles para corregir los errores que se presentan
debido a reacciones químicas espontáneas no específicas ni catalizadas por la enzima.

La amilasa es la enzima responsable de la hidrólisis del almidón, tanto su actividad

como la presencia de sus transcriptos está asociada a este polisacárido. Kuhn, en 1925 demostró
la presencia de dos amilasas: la alfa amilasa Ec 3.2.1.1 y la beta amilasa 3.2.1.2. La alfa amilasa
hidroliza los enlaces alfa 1-4 pero no puede hidrolizar los enlaces alfa 1-6 de las cadenas
ramificadas de la amilopectina, por lo que se requiere de la enzima desramificadora para la
hidrólisis completa del almidón.

El estudio "in vitro" implica, sin embargo, aislar y purificar aunque sea parcialmente la
enzima y posteriormente analizar individualmente las variables que influyen en su actividad.
Para todo este proceso es indispensable fijar inicialmente en forma tentativa las condiciones
experimentales en que se realizará el ensayo enzimático, tomando en consideración todos los
conocimientos generales que se tienen sobre la naturaleza de las enzimas y aquellos hechos
particulares que nos permiten suponer algunas cualidades o requerimientos especiales de la
enzima en estudio. De este modo se debe elegir un pH, una temperatura y un tiempo de
incubación compatible con la naturaleza proteica de la enzima, condiciones que deben ser en
lo posible lo más semejantes a las del medio en el cual la enzima actúa "in vivo". Además se
debe procurar que las concentraciones de la solución amortiguadora del pH que se use en el
medio de incubación, garanticen la estabilidad del pH elegido durante el lapso de observación
y que la concentración del substrato sea lo suficientemente alta para mantener la saturación de
la enzima, mientras dure el experimento.

Un método para la determinación cuantitativa de la actividad de la amilasa es el

amiloclásico iodométrico. En este método el sustrato, almidón tamponado, se incuba con la
muestra produciéndose la hidrólisis enzimática. Este se detiene al agregar el reactivo de yodo.
La disminución de color respecto a un sustrato sin muestra permitirá medir la actividad
enzimática.

Materiales y reactivos:

1. Solución Sustrato almidón 500 mg/L, en buffer 0.01 M Acetato de sodio y CaCl2 0.003 M
(pH 5.6)
2. Reactivo de yodo 0.01 eq/L de Yodo en HCl 0.02M
3. Enzima amilasa extraída de granos de trigo germinados por 72 horas
4. Tubos de prueba y pipetas, centrífuga clínica, baño de maría a 37°C.
5. Espectrofotómetro o fotocolorímetro

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Preparación del extracto crudo enzimático:

 Esterilizar las semillas con 1.5% de hipoclorito de sodio (NaOCl)/ 10 min.

 Enjuagar bien con agua hervida fría para eliminar el hipoclorito de sodio
(NaOCl)
 La germinación se llevará a cabo en oscuridad a 25 ºC por 3 a 7 días sobre papel filtro o
gasa o algodón humedecido.
 La muestra germinada será homogenizada en frio por trituración con 0.01 M de buffer
acetato de Na pH 5.6 conteniendo 0.03M de CaCl2 (aproximadamente 1ml x cada gramo de
muestra)
 El extracto será centrifugado a 3000 rpm por 20 min y el sobrenadante será usado como un
preparado enzimático crudo.

Ensayo para la determinación de la Velocidad inicial:

La presencia de una enzima se demuestra siguiendo la desaparición del sustrato o la

aparición del producto de la reacción. Para ello la enzima es incubada con el sustrato bajo
condiciones cuidadosamente controladas. Debe considerarse además controles para corregir
los errores que se presentan debido a reacciones químicas espontáneas no específicas ni
catalizadas por la enzima.
 Preparar las reacciones de acuerdo al siguiente esquema

Reactivos B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5 B6 6
Agua destilada (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Sustrato Almidón 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
(mL)
Incubar a 37 °C por 5 min
Enzima (mL) ----- 0.1 ----- 0.1 ---- 0.1 ---- 0.1 ---- 0.1 ---- 0.1
Incubar a 37°C por 0 0 2 2 4 4 6 6 8 8 10 10
min min min min min min min min min min min min
Solución de Yodo 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
(mL)
Enzima (mL) 0.1 ---- 0.1 ---- 0.1 ---- 0.1 ---- 0.1 ---- 0.1 ----

Mezclar bien y leer en el espectrofotómetro a 640nm.

Curva estándar de almidón:

 Para determinar la cantidad de almidón no hidrolizado debe de prepararse una curva estándar
de almidón, de acuerdo al siguiente esquema.

Reactivos B 1 2 3 4 5 6

Concentración del almidón (mg/mL)

Solución Sustrato almidón 500 mg/L, 0.00 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
en buffer 0.01 M Acetato de sodio y
CaCl2 0.003 M (pH 5.6) (mL)
Agua (mL) 1.0 0.95 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5

Reactivo de Yodo (mL) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

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Cálculos:

La Unidad Amilolítica (UA) es la cantidad de enzima contenida en 100 ml de muestra, que

puede hidrolizar 10 mg de almidón en 30 minutos.
En esta técnica se incuban 100 µl de muestra con 0.20 mg de almidón durante 8 minutos, lo que
equivale a incubar 100 ml de muestra con 10 000 mg de almidón durante 30 minutos. Si
conocemos que una Unidad Amilolítica (1UA/dL) es la cantidad de enzima contenida en 100
ml de muestra que puede hidrolizar 10 mg de almidón en 30 min entonces si todo el almidón
en esta reacción fuera hidrolizado, la actividad amilásica de la muestra sería de 1000 UA/dl. Así,
para obtener las unidades de actividad amilásica, la fracción de almidón digerido se multiplica por
1000.

Absorbanci a(Tubo1)− Absorbanci a(Tubo 2)

AmilasaUA / dl = 1000
Absorbanci a(Tubo1)

➢ Calcule las concentraciones respectivas de cada tubo del estándar y anote sus resultados de
Absorbancia.

Concentración a) En un papel milimetrado grafique la

Tubo Absorbancia
(mg/ml) curva estándar.
1 b) Determine el factor de calibración
2 de la curva.
3
4
5
6
➢ La velocidad de reacción se define como la cantidad de sustrato consumido o de producto
formado por unidad de tiempo. En nuestro caso se medirá la desaparición de sustrato frente
al tiempo
a) Determinar la concentración de sustrato Conc.
(almidón) de cada tubo empleando la curva Tubo tiempo Absor
mg/ml
estándar de almidón (por extrapolación o 1 0 min
usando el factor de calibración). 2 2 min
b) En un papel milimetrado representar la curva
de progreso de la reacción graficando la 3 4 min
concentración de sustrato vs tiempo de 4 6 min
reacción. 5 8 min
c) Determinar experimentalmente la velocidad
inicial de la enzima amilasa

d[P] o [S] = Vi = tg α = b
dT a
d) Discutir sus resultados

e) ¿En qué consiste la Velocidad inicial de una enzima? ¿Para qué se determina?

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