CLASE 6

Evaluación del diferencial leucocitario

Uno de las pruebas que se realiza con mayor frecuencia en los laboratorios clínicos es el
recuento completo de células, denominado en la práctica diaria como hemograma o CBC (del
inglés: complete blood cell count). Este recuento puede incluir o no, el recuento diferencial
leuocitario o DIFF.
El diferencial leucocitario microscópico, si bien sigue siendo el método de referencia para
validar el DIFF automatizado, es una prueba laboriosa, de un bajo valor estadístico debido
a su alta variabilidad, pero que presenta una indiscutible utilidad clínica.
Actualmente los contadores hematológicos son capaces de realizar ambas pruebas con un
alto grado de confiabilidad, eficiencia y costo-efectividad.
Entre las ventajas de realizar un diferencial automatizado podemos mencionar:
 eliminación de la variabilidad inter-observador
 posibilidad de trabajar con tubo cerrado con la consiguiente ventaja en cuanto a
bioseguridad del operador
 eliminación del error por la desigual distribución de las células en el extendido
 eliminación de variaciones estadísticas
 posibilidad de gatillar la realización de tests reflejos sin la participación del operador
con la consiguiente mejora en el tiempo de respuesta y calidad de la atención al paciente
 mayor eficiencia (hasta más de 100 análisis/hora) y costo-efectividad que el método
manual, fundamental en laboratorios que manejan un elevado volumen de muestras
diarias.
Sin embargo existen situaciones inherentes al paciente que hacen necesaria la validación
microscópica del recuento diferencial leucocitario automatizado. En este aspecto es
fundamental que el operador conozca los principios de medición de su analizador, y cómo
informa la presencia de poblaciones celulares anómalas (sistema de alarmas).
Es recomendable, en la manera de lo posible, evaluar la sensibilidad clínica de las distintas
alarmas de sospecha. Una baja sensibilidad para detectar anormalidades morfológicas,
puede llevar al subdiagnóstico de algunas patologías, mientras que una baja especificidad
puede llevar a la sobrestimación del número de anormalidades con la consiguiente revisión
innecesaria del extendido.
La integración de los resultados numéricos de las 3 series hematopoyéticas (leucocitos,
hematíes y plaquetas), junto a las alarmas (desviación a la izquierda, blastos, células
atípicas, etc.) obtenidos en el autoanalizador, nos proporcionan información relevante para
indicar la necesidad del estudio morfológico de las células sanguíneas y contribuir a la
orientación diagnóstica de enfermedades hematológicas y no hematológicas.

Los analizadores hematológicos actuales son capaces de realizar el recuento y el

diferencial leucocitario utilizando una combinación de principios de medición como son la
impedancia, dispersión de luz, radiofrecuencia, citoquímica y el análisis de núcleos previa
lisis celular. Por ejemplo, un analizador puede determinar el diferencial leucocitario
mediante la inserción de un tinte fluorescente en el núcleo de la célula y posterior medición
de la fluorescencia. Se puede alterar la permeabilidad de la célula y ver la rapidez con que
absorbe un colorante. Otro puede medir la actividad de una enzima cuando la célula se
coloca frente a un sustrato particular.
Además del recuento absoluto y porcentual, los analizadores muestran gráficamente las
características de las distintas subpoblaciones, a través de gráficos de puntos
(scatterplots) e histogramas de distribución de volumen, relacionados con propiedades
celulares como por ejemplo granularidad interna, actividad de peroxidasa, etc.
Mientras que la impedancia eléctrica aún tiene una posición firme en la determinación del
número total y el tamaño de las células, las técnicas de citometría de flujo han demostrado
su valor en la diferenciación de leucocitos y la identificación de células anormales. El
método basado en la medición de volumen, conductividad y dispersión de luz (VCS) analiza
las células en su estado "casi nativo" y las clasifica fundamentalmente en base a su tamaño
y composición interna. La incorporación de técnicas inmunológicas junto a la citometría de
flujo, ha posibilitado además, contar, clasificar y alertar sobre la existencia de células
anormales e inmaduras en sangre periférica, médula ósea y otros líquidos biológicos.
En los últimos años, algunos contadores hematológicos han incorporado nuevos parámetros
al diferencial leucocitario de 5 poblaciones, tales como el recuento de glóbulos rojos
nucleados (NRBC), de granulocitos inmaduros (IG) y de linfocitos activados/atípicos,
generando un diferencial expandido que incorpora estos parámetros. Estas células, de las
cuales anteriormente sólo se indicaba su presencia, son ahora cuantificadas. Debemos
tener en cuenta sin embargo, que para algunos de estos parámetros, y en algunos
instrumentos, al no contarse con controles de calidad internos disponibles, solo son
considerados parámetros para investigación y no deberían ser utilizados en la toma de
decisiones clínicas.

Para la cuantificación de granulocitos inmaduros (promielocitos, mielocitos,

metamielocitos) se han utilizado diversos marcadores monoclonales como el CD16 (FcRIII)
que se expresa en los neutrófilos maduros, CD11b (CR3) expresado solo en neutrófilos
inmaduros y el CD64 (FcRI), expresado en neutrófilos estimulados. Sin embargo esta
metodología presenta algunas limitaciones. Por ejemplo, la expresión de estos marcadores
no siempre se corresponde con los cambios morfológicos que se esperarían encontrar
durante la observación microscópica del frotis. Además, existen diversas situaciones en las
que los granulocitos muestran una expresión anómala de estos marcadores (síndromes
mielodisplásicos). Esto dificulta su implementación en los autoanalizadores, y si bien una
solución parecería ser utilizar una combinación de los mismos, esto traería aparejado un
alto costo de la determinación, inaplicable a los laboratorios de rutina.

Algo similar ocurre con los blastos, en los que no existe un marcador único para su
identificación. Esto hace necesaria la combinación de varios de ellos según la enfermedad
de que se trate. Diversos trabajos demuestran la utilidad del CD45 para poder separar los
blastos de los linfocitos en la zona de baja granularidad celular, pero son necesarias
diversas combinaciones de anticuerpos monoclonales para su correcta cuantificación.

En algunas líneas de analizadores hematológicos es posible realizar la cuantificación de

poblaciones linfocitarias (CD3/CD4/CD8) utilizando los principios de la citometría de flujo
con la utilización de distintos anticuerpos monoclonales, sumados a los principios de
detección habituales para la identificación y recuento de células.

Interpretación de los gráficos de distribución de células (scattergramas)

Detección de poblaciones anormales

Como ya mencionamos en las clases anteriores, la información que podemos obtener de

estos gráficos depende de la metodología de cada autoanalizador. El operador debe estar
por lo tanto familiarizado con los gráficos que proporciona su equipo, para realizar una
correcta interpretación y validación de los datos. Recordemos brevemente la ubicación de
las diferentes poblaciones en los scattegramas de los analizadores de las principales
marcas.

Scatterplot - Tecnología Coulter

Como se describió en la clase 1, los contadores de la línea Coulter de última generación,
empleando la tecnología VCS, informan un diferencial leucocitario de 6 partes en el que se
incluye el recuento de eritroblastos.
La presencia de alarmas de sospecha tales como: “NEU inmaduros 1”, “NEU inmaduros 2”,
“blastos de neutro”, “blastos de linfo”, etc.; sumadas a un escattergrama anómalo deben
hacer sospechar al operador de la presencia de células inmaduras (blastos, promielocitos,
mielocitos, metamielocitos).

1-Sospecha de blastos de neutro

2-Sospecha de blastos de mono
3-Sospecha granulocitos inmaduros
4- Sospecha de blastos de linfo
5- Linfocitos variantes
6-Neutrófilos envejecidos o dañados
7- Plaquetas gigantes
8- GR nucleados (NRBC)

Scatterplot normal

Scatterplot- Tecnología Sysmex

El contador XE-2100 genera 6 diferentes scattergramas incluyendo el gráfico DIFF,
WBC/BASO, IMI, NRBC, RET (reticulocitos) y PLT-O (plaquetas ópticas).

Los diferentes tipos de leucocitos tienen

diferentes ubicaciones en el diagrama de
dispersión.
La fluorescencia se representa en el “eje y”, y la luz
dispersada en el “x”.
Los puntos azules cerca de la base son fantasmas o
restos celulares.

Scattergrams in Sysmex XE-2100

Scatterplot Tecnología ADVIA

Los equipos de la línea ADVIA para determinar el diferencial leucocitario utilizan un canal
de peroxidasa y un canal de Baso/lobularidad. La muestra se diluye con un reactivo
peroxidasa que forma un precipitado oscuro en las células que contienen peroxidasa:
neutrófilos, eosinófilos, monocitos.
Un sistema óptico mide intensidad de tinción (absorbancia) para cada célula y el tamaño por
dispersión de la luz. En este canal los basófilos son ubicados en la misma zona de los
linfocitos.
 Tamaño en “eje y” e intensidad de la tinción peroxidasa en el
eje x

- linfocitos (células pequeñas, sin teñir)

- células grandes sin teñir (LUCs): (linfocitos
atípicos, células plasmáticas, y algunos blastos)
- eosinófilos (fuerte actividad peroxidasa pero más
pequeños que los neutrófilos)
- neutrófilos (grandes con actividad peroxidasa
moderada)
- monocitos (tinción peroxidasa levemente menor)

Canal Baso/lobularidad. Se añade un

surfactante y ácido ftálico para la lisis de
los glóbulos rojos y despojar la membrana
citoplasmática de todos los leucocitos,
excepto los basófilos.
La señal de luz láser a diferentes ángulos
identifica a los basófilos, que debido a que
resisten a la lisis, aparecen como células más
grandes que el resto.

Tecnología de la línea Abbott

Los analizadores de la línea Abbott realizan el diferencial leucocitario utilizando la
tecnología MAPSS que se ha descripto en la clase 1.

En la figura se observan las distintas zonas del

scattergrama donde se ubican las subpoblaciones
de células anormales (granulocitos inmaduros,
bandas, linfocitos variantes, eritroblastos).
 Sistema de Alarmas

Los parámetros que gatillan la aparición de alarmas en el reporte, varían con la tecnología
del contador. Estas alarmas tienen diferentes grados de especificidad para la presencia de
hallazgos anormales. La presencia de una o más alarmas no indica que una anomalía
específica tiene que estar presente; sólo indica que hay una mayor probabilidad de una
anormalidad que sólo puede ser excluida o confirmada por la revisión del extendido.
Los contadores automatizados vienen seteados con la configuración de umbrales de
detección recomendada por el fabricante. Corresponde entonces a los laboratorios ajustar
estos umbrales para la detección por ejemplo de blastos, granulocitos inmaduros,
desplazamiento a la izquierda, linfocitos atípicos, y alarmas de linfocitos/linfoblastos
anormales a las necesidades clínicas de sus pacientes y los requerimientos del staff
médico. Estos ajustes implican conseguir un cuidadoso equilibrio entre el riesgo potencial
de perder cualquier detección de célula anormal (si se fijan umbrales muy altos) y la
posibilidad de aumentar el tiempo de respuesta, el trabajo manual, y el costo causado por
un aumento en la tasa de revisiones (favorecida por umbrales a valores bajos).

Granulocitos Inmaduros (GI)

Utilidad de su reporte. Sensibilidad de las alarmas

La alarma de granulocitos inmaduros es una de las que se presentan con mayor frecuencia
en la tarea diaria y que requiere la revisión del frotis de sangre periférica. Estas células
están aumentadas en condiciones tales como infecciones bacterianas, enfermedades
inflamatorias agudas, cáncer (particularmente con metástasis en médula ósea), necrosis
tisular, rechazo agudo de trasplante, cirugía y trauma ortopédico, enfermedades
mieloproliferativas, uso de esteroides, y en el embarazo (fundamentalmente durante el
tercer trimestre). En estos casos, el aumento de GIs está acompañado generalmente por
un aumento del número de neutrófilos totales, que son liberados tanto del pool marginal
(células adheridas al endotelio vascular), como de la médula ósea. Sin embargo, en algunas
circunstancias, especialmente en la vejez, neonatos y pacientes mielosuprimidos, puede
haber aumento de GIs sin que se registre aumento del número de neutrófilos totales y, más
aún, en condiciones tales como la sepsis, puede detectarse aumento de GI con neutropenia.
En estas situaciones, el aumento de GIs (>2%), aún en forma aislada, puede ser útil para
identificar una infección no sospechada.

A pesar de que existe una definición establecida de la morfología que debe presentar un
neutrófilo para ser considerado en banda o cayado, la capacidad de distintos observadores
para aplicar esta descripción es variable.
 Fig. Diferentes morfologías que pueden presentar los neutrófilos en banda.

Diferencia entre neutrófilos en banda y segmentados

Forma del a: ancho del puente nuclear

núcleo b: ancho máximo de los lóbulos
Neutrófilo en banda 2  a  4 µm
a  1/3 b
Segmentado a < 2 µm
a < 1/3 b

La excelente reproducibilidad del recuento automatizado de GI se debe a su alta

confiabilidad estadística dado el elevado número de células que son contadas en el
analizador, en comparación con el recuento diferencial manual que se realiza en 100 células.
Se ha reportado que a bajos recuentos de GI (por ejemplo 0.5x103/µL), el analizador
presenta un coeficiente de variación de sólo 7%, mientras el diferencial manual muestra un
CV de aproximadamente de 50%.

Los software de algunos equipos (por ejemplo de la serie Sysmex), incorporaron el análisis
del parámetro granulocitos inmaduros en el canal DIFF, para referir a la presencia de
metamielocitos (MM), mielocitos (M) y promielocitos (PM), teniendo en cuenta el recuento
total de granulocitos, los granulocitos inmaduros y la relación granulocitos inmaduros/
granulocitos totales.

En el diagrama de dispersión, estas células se diferencian

en función de su fluorescencia y estructura interna. Así, la
intensidad de la señal de fluorescencia es directamente
proporcional al contenido de ácido nucleico de la célula.
Las señales de fluorescencia más fuertes corresponden a
las células más inmaduras o células activadas, debido a su
alto contenido de ARN.

Canal de fluorescencia
(Fuente: http://www.sysmex-europe.com)
 En el scattergrama que reportan los analizadores de la
línea Sysmex, los granulocitos inmaduros muestran mayor
PM
fluorescencia que los neutrófilos y están representados
por puntos azules que aparecen por encima de la nube de
M
puntos de los neutrófilos maduros. Las células en la parte
superior son los promielocitos, demostrando su mayor
fluorescencia y las células más maduras, metamielocitos,
MM están en la zona más cercana a neutrófilos.

Canal de fluorescencia

Estos analizadores poseen también lo que se conoce como canal de IMI (información de
inmaduros mieloides) que resulta de la combinación de radiofrecuencia e impedancia, en
presencia de reactivos especiales. Los leucocitos inmaduros contienen menos lípidos que los
maduros. En presencia de reactivos especiales de lisis, las células maduras se rompen, se
eluyen sus gránulos, y sólo permanecen sus núcleos. Por el contrario, las células inmaduras
de la serie mieloide se comportan de una manera diferente: el reactivo de lisis entra y se
une a la membrana y gránulos, fijando así las células, diferenciándolas de las células
maduras. El efecto del reactivo de lisis difiere con cada tipo de célula inmadura, lo que
permite su diferenciación cuantitativa.
Canal IMI (Metodología Sysmex)

En el scattergrama del canal de IMI, los puntos rojos

representan células mieloides inmaduras.
Los WBC maduros están completamente lisados y encogidos
por el reactivo y se representan con los puntos de color
azul.
Las células mieloides inmaduras no están completamente
lisadas, lo que permite su diferenciación cuantitativa y
separación de las células maduras.

Cómo se gatilla el reporte de una alarma de sospecha?

El diferencial leucocitario que reportan los contadores hematológicos, provee información

sobre la morfología celular utilizando distintos algoritmos, a partir de los cuales se generan
las diferentes alarmas de poblaciones anormales. Sin embargo muchas veces son incapaces
de clasificar en forma confiable células anormales y/o inmaduras, por lo que es
fundamental conocer la sensibilidad y especificidad clínica de estas alarmas para evaluar su
utilidad.
Como ejemplo mostramos los diagramas de dispersión diferencial de los canales de
fluorescencia y radiofrecuencia en el contador SysmexXE-5000, donde se puede observar
la ubicación que presentan las células inmaduras, y cómo se aplican los algoritmos para la
generación de alarmas:

Canal IMI

a b c
*Eje y: intensidad de fluorescencia; eje x: side scatter. (Fuente: Am J Clin Pathol 2011;136:309)

a-Algoritmo para la alarma de blastos en el Sysmex XE-5000. Se utiliza la información del

scattergrama DIFF e IMI. El área sombreada de azul claro en el canal DIFF es el área donde se
encuentran los blastos, pero la alarma se activará sólo si también hay eventos en el área de blastos
(puntos rojos) en el canal IMI.
b-Algoritmo para la alarma linfocito anormal/linfoblasto. Se utiliza la información del diagrama
de dispersión DIFF y el canal IMI. El área sombreada azul claro en el canal DIFF es el área donde
se ubican los blastos, linfocitos anormales o linfoblastos. Con ningún evento anormal en el canal
IMI, éstos no pueden ser mieloblastos, por lo que sólo se activará la alarma de linfocitos
anormales/linfoblasto.
c-Algoritmo para la alarma de linfocitos atípicos. La parte superior, zona de sombra azul claro en
el canal DIFF, es donde se ubican los linfocitos atípicos (altamente fluorescentes). No hay ningún
evento en el área linfocito/linfoblasto o en el área de blastos en el canal IMI, por lo que sólo se
activará la alarma de linfocitos atípicos.

Debemos considerar que los factores y algoritmos utilizados para la generación de alarmas
dependen de la tecnología utilizada por lo tanto varía de un fabricante a otro.

Ejemplos de Patrones anormales de los Scattegramas

A continuación se muestran situaciones patológicas que se hacen “visualmente” evidentes si

se observa el scattergrama leucocitario, en este caso en un analizador Beckman Coulter
LH750.
En la imagen siguiente volvemos a describir un modelo normal de scattegrama VCS.

Beckman Coulter LH750

Se muestran scattergramas o gráficos de dispersión de puntos bidimensionales (Volumen vs

Dispersión de luz y Volumen vs Opacidad/Conductividad). Observe las poblaciones
señaladas de 1 a 4 correspondientes a linfocitos, monocitos, neutrófilos y eosinófilos
respectivamente. En el diagrama de la derecha sólo 3 grupos están presentes debido a que
las poblaciones de neutrófilos y eosinófilos se solapan completamente en la dimensión de
opacidad. Por lo tanto la población 1 corresponde a linfocitos, 2 a monocitos y 3 superpone
neutrófilos y eosinófilos.

Una variedad de trastornos y enfermedades generan patrones distintivos. Algunas de estas

situaciones y sus respectivos patrones serán descritas a continuación.
 Scattergrama de WBC en un paciente con mononucleosis infecciosa

Mononucleosis infecciosa
La MI se da
especialmente en niños
y adultos jóvenes, es
uno de los trastornos
más comunes que causan
un aumento anormal en
el nivel de linfocitos
variantes (LV).

Scattergrama de un paciente con LLC

Estas muestras son a

Leucemia linfocítica crónica

veces difíciles de
distinguir de las
muestras con niveles
anormales de LV porque
ambas comparten
algunas características
comunes.
Por ejemplo, ambos
tipos de patrones por lo
general se presentan con linfocitosis, y, al mismo tiempo, con poblaciones de linfocitos
grandes o alargados que presentan valores estadísticos poblacionales (VCS) anormales.
Scattergrama de paciente con LLA
Este tipo de muestra
también exhibe

Leucemia Linfocítica aguda

parámetros poblaciones de
linfocitos anormales
(población linfocitaria
alargada, a menudo con
linfocitosis), por lo tanto
es un modelo difícil de
diferenciar de las
muestras con LV. Este tipo de muestra por lo general contiene linfocitos muy inmaduros
(linfoblastos). El reporte en este caso de la alarma “linfocitos variantes” (que en
realidad sería un falso positivo), puede ser considerado un error aceptable, ya que es de
hecho un patrón anormal que debería ser detectado.
 Scattergrama de un paciente con LMA
Una muestra de una LMA por lo

Leucemia Mieloide Aguda

general tiene un patrón anormal.
Las anormalidades en estos
casos afectan principalmente a
las poblaciones de monocitos y
neutrófilos. La población de
linfocitos normalmente está
disminuida o es prácticamente
inexistente. Sin embargo, al existir LMA con morfologías muy variadas se pueden
generar patrones variables en el scattergrama (la discusión a fondo de todos ellos
estaría más allá del alcance de este curso).

Existe controversia sobre el nivel de significación adecuado en la que la proporción de

linfocitos variantes debe ser considerada médicamente anormal. Los primeros consensos,
como el del NCCLS, habían establecido previamente el nivel de linfocitos variantes
clínicamente significativo en 10%. Sin embargo, normas más recientes como las del CLSI
(Clinical and Laboratory Standards Institute), publicadas en 2007, han revisado este
umbral, y consideran que un nivel mayor o igual al 5% de linfocitos variantes debe ser
considerado médicamente relevante (Koepke et al 2007).

La siguiente es una muestra con linfocitos reactivos que, desde el punto de vista del nivel
de significancia clínica sería positiva, y debería ser “señalada” idealmente por el equipo.

El diferencial informado L% M% N% Eo% B%

por el LH750 fue: 34.06% 9.72% 55.33% 0.68% 0.21%

Los parámetros estadísticos poblacionales (volumen medio, desviación estándar del

volumen, opacidad o conductividad media, desviación estándar de la opacidad, dispersión de
la luz media y desviación estándar de dispersión de la luz) para las poblaciones de
leucocitos más relevantes fueron:

El diferencial manual Li M Ne Eo Baso Blasto Immature Band Lymph

reportado fue: % % % % % % Gran% % Variant
23 6 59 1 0 0 0 1 10

Esta muestra tiene una anomalía clínicamente relevante (linfocitos variante: 10%). Si se
considera que las estadísticas de población VCS para WBC de una muestra normal son:

y se calcula un porcentaje de diferencia para cada parámetro estadístico entre la muestra

con linfocitos variante y la muestra normal, la diferencia porcentual sería:

Prestando especial atención a las poblaciones de linfocitos y monocitos, es notable que el

SD para volumen, conductividad y dispersión, muestra los mayores valores. Esta
observación remarca la importancia de revisar los parámetros SD que derivan del volumen,
conductividad y dispersión, generados por los analizadores de la línea Coulter. Estos
parámetros representan características útiles y potentes para detectar anomalías en la
distribución de poblaciones.

El siguiente es un caso con un valor de linfocitos reactivos clínicamente relevante.

 Muestra con Nivel
anormal de Linfocitos
variantes

Diferencial L% N% M% Eo% B%
automatizado 62.49% 4.09% 32.62% 0.27% 0.51%

Diferencial L M N Eo B Blast Immature Band Variant

manual Gran Lymph
47% 1% 15% 2% 0% 0% 0% 13% 22%
Esta muestra es de primordial importancia no sólo porque el diferencial manual de
linfocitos variantes es 22%, muy por encima del umbral aceptado médicamente para ser
considerado anormal, sino porque el algoritmo del diferencial no detectó en esta muestra
linfocitos variantes. Por lo tanto, se considera un falso negativo.

El siguiente es un ejemplo de una leucemia linfoblástica aguda:

Esta muestra presentaba

blastos y nivel normal de
linfocitos reactivos

El analizador reporta los siguientes L% M% N% E% B%

porcentajes: 91.98% 0.23% 7.48% 0.23% 0.06%
De la observación del scattergrama resulta evidente que existe un predominio de linfocitos
(92%). Es importante tener en cuenta que en los analizadores que no utilizan anticuerpos
monoclonales o marcadores específicos, no resulta fácil distinguir si estos son linfocitos
inmaduros o maduros. Si bien la característica más obvia del patrón es la linfocitosis no
siempre es de naturaleza maligna, sobre todo en niños. En pacientes adultos, sin embargo,
la linfocitosis es generalmente una señal de advertencia de un trastorno grave, como la
leucemia o el linfoma.
El diferencial manual fue: L M N Eo B Blast ImmatureGran% Band Variant
% % % % % % % Lymph
81 0 8 1 0 9 0 1 0
La muestra presentaba un 9% de blastos linfoides de estirpe B. Los blastos de estirpe B
pueden causar una distorsión de la forma en la zona de linfocitos, ya que a menudo
presentan características de volumen, dispersión de luz, o de opacidad muy diferentes a los
linfocitos normales. Las muestras con una proporción alta de linfocitos inmaduros (blastos),
a veces pueden cumplir con las condiciones para clasificar como linfocitos variantes,
disparando una alarma, e induciendo un falso positivo de Linfocitos Variantes.
Desde una perspectiva de riesgo del paciente, es mucho más seguro reportar un falso
positivo que un falso negativo, especialmente para un trastorno grave, como la LLA.

Autoanalizadores que utilizan Tinciones Citoquímicas

Alarma Granulocitos Inmaduros y células LUC en equipos de la línea ADVIA
En los autoanalizadores que utilizan la tinción de peroxidasas (línea ADVIA), las células
atípicas corresponden a las de tamaño grande y
negativas para dicha tinción (large unstained cells o
LUC). En esta subpoblación como señalamos
anteriormente, se engloban los linfocitos reactivos,
las células plasmáticas y las células blásticas
peroxidasa negativas.
Se consideran valores elevados de LUC los
superiores a 5%, que cuando se asocian a
citopenia/s en sangre periférica constituyen signos
Blastos en sangre periférica de alarma.

Algoritmo para la alarma de blasto en los analizadores ADVIA:

Canal de peroxidasa Canal Baso/Lobularidad

Hay que tener en cuenta cuando utilizamos un contador que realiza el diferencial
leucocitario basado en la tinción de peroxidasa, que en aquellos pacientes que presentan un
déficit de peroxidasa granulocitaria (congénito o adquirido), se obtendrá un aumento
aislado del porcentaje de LUC que deberá ser confirmado mediante la observación
microscópica de las células. Esto pondrá de manifiesto que ese aumento de LUC no
corresponde a células atípicas o inmaduras sino a neutrófilos maduros con deficiencia de
mieloperoxidasa.
ADVIA 120
WBC: 6760 /mm3
1.6 % Neutro
21.5% linfo
69.5% LUC
3+ ATYPS Flag
1+ MOP Deficiency Flag

a) sangre normal b)Paciente con deficiencia de

peroxidasa granulocítica

Recuento de Glóbulos Rojos Nucleados (NRBC)

Otro aspecto a tener en cuenta, fundamentalmente en pacientes pediátricos, es el

recuento de eritroblastos.

Excepto durante el período neonatal inmediato, su

presencia es normal solo en médula ósea. Cuando se
realiza el recuento total de células nucleadas, el
recuento de NRBC presenta las limitaciones típicas de
imprecisión e inexactitud de una población de células
poco frecuentes.

Su correcta enumeración es clínicamente importante ya que en la mayoría de las situaciones

indican un desorden en la eritropoyesis o una eritropoyesis de estrés.
Por otra parte, la presencia de eritroblastos en sangre periférica puede servir como un
indicador precoz de alto riesgo de mortalidad en pacientes críticos. Existen reportes que
muestran que en promedio, la presencia de eritroblastos, es detectada 1 a 3 semanas
previas a la muerte. Estudios que han realizado el análisis del perfil de citoquinas en
pacientes con NRBC en sangre periférica (sin enfermedades hematológicas), sugieren que
los NRBC se pueden considerar un parámetro que refleja injuria hipóxica e inflamatoria.
El recuento de eritroblastos ha sido propuesto también como un indicador para decidir la
necesidad de transfusión en pacientes con talasemia mayor y para identificar neonatos con
historia de hipoxia fetal.
En la actualidad los autoanalizadores de última generación como por ejemplo Abbott
Sapphire, Beckman Coulter LH 750, Sysmex XE-2100 y Siemens ADVIA 2120, realizan el
recuento de NRBC en forma predeterminada en todas las muestras en las cuales se realiza
el diferencial leucocitario. En otros analizadores, la determinación de este parámetro debe
ser especialmente programada cuando se detecta la alarma “NRBC” en el reporte del
diferencial automatizado.
Figura: Histograma y scattergrama de WBC de un
contador que mide por tecnología VCS (Línea
Coulter) mostrando la ubicación de la población de
NRBC.

Los resultados publicados sobre el recuento

automático de eritroblastos muestran un
excelente desempeño en términos de precisión
(CV<10%) y exactitud, aun cuando esta última es
evaluada en base a la comparación con la
microscopía o citometría de flujo con anticuerpos
monoclonales, mostrando coeficientes de
correlación entre 0,90 y 0,99.
Los límites de detección, dependiendo del equipo utilizado varían entre 1 y 2 eritroblastos
cada 100 leucocitos.
Hay que tener en cuenta que en aquellos analizadores que no realizan el recuento de NRBC
en forma predeterminada en simultáneo con el diferencial leucocitario, cuando aparece la
alarma de NRBC se estaría sobrestimando el recuento de WBC, y se estaría también
sobrestimando el recuento relativo de linfocitos, ya que la mayoría de los contadores
incluyen a los eritroblastos en forma total o parcial dentro de la población de linfocitos.
Por lo tanto, en estos casos se debe hacer la corrección del recuento de WBC de acuerdo al
número de eritroblastos contados al realizar el recuento diferencial leucocitario en forma
manual, siguiendo las recomendaciones publicadas por el Consejo Internacional para la
Estandarización en Hematología y el CLSI (protocolo H20-A2).
El recuento de NRBC es luego expresado como el número presente por cada 100 leucocitos
y el recuento de leucocitos es subsecuentemente ajustado matemáticamente.
Sin embargo, la corrección del recuento de WBC puede ser inexacta debido a que,
dependiendo del tamaño del núcleo del eritroblasto, puede no ser contado como leucocito si
su tamaño cae por debajo del discriminador de leucocitos (35 fl). Así, los NRBC son
variable e impredeciblemente incluidos dentro del recuento de linfocitos, dependiendo de
su tamaño heterogéneo y sensibilidad a la lisis. Es por esto que los analizadores más
sofisticados utilizan varios métodos simultáneamente para su medición.
Los últimos analizadores presentados de la línea Sysmex (Series XN) identifican
eritroblastos directamente en el canal de los leucocitos, eliminando la necesidad de hacer
correcciones de conteos de los mismos, aspecto que mejoraría la exactitud del recuento de
NRBC y por lo tanto del recuento de WBC en presencia de NRBC.
Otra limitación del informe de NRBC es que no todos los fabricantes cuentan con
materiales de control para este parámetro, sumado a que existen muy pocos programas de
control de calidad externo que lo incluyan.

Usando los datos reportados por los contadores interpretemos estas situaciones

Caso clínico
Mujer de 35 años con tos en la última semana. Refería dolor en extremidades y fiebre de
39°C. El hemograma de ingreso realizado en un contador de la línea Coulter, mostró
recuento de WBC de 10.1x109/L con un diferencial Ne 80%, Li 13%, Mo 5%, Eo 2%.
Los valores de HB y PLT, así como los histogramas de
PLT y RBC eran normales.
Alarma de sospecha: WBC ImmatureGranulocytes 1.
El scattergrama muestra una población de neutrófilos
levemente desplazada hacia arriba compatible con la
alarma ImmGran 1.
Diferencial manual: Neutrófilos en cayado 10%, NS
62%, Li 15%, Eo 4%, Mo 9%.
Se realiza placa de tórax llegándose al diagnóstico de
neumonía.

En este caso se observa desvío reactivo a la izquierda con una leve leucocitosis. La alarma
de sospecha “ImmatureGran 1” indicó el aumento de
neutrófilos en banda, que fueron incluidos por el
analizador dentro del recuento de neutrófilos. El
desplazamiento de la nube de neutrófilos en el
scatterplot y la alarma “ImmatureGran 1” llevaron a la
revisión del frotis.

Caso clínico
Varón de 8 años que consulta por decaimiento, fiebre y adenomegalias de un mes de
evolución. A continuación se muestran los resultados obtenidos en el hemograma de ingreso
a guardia procesado en un contador de la línea Coulter. Se observa leucopenia severa, con
anemia leve y plaquetas normales. El analizador arrojó la alarma “LY blasts”. En la
observación del extendido se detectaron blastos pequeños y homogéneos que fueron
compatibles con una leucemia linfoblástica aguda.
 Diferencial manual :
Cayados: 2 %
Segmentados: 20 %
Linfocitos: 51 %
Blastos: 27%

El diagnóstico final de este paciente luego de los estudios de citoquímica e

inmunofenotipificación fue: LLA Pre B.

Caso clínico
Joven de 25 años con antecedentes de padecer un desorden autoinmune bajo tratamiento
crónico con esteroides, admitido en el hospital por un cuadro de anemia hemolítica inmune.
En el hemograma de ingreso realizado en un Sysmex XE-5000 se observó, entre otros
hallazgos, un aumento del recuento de WBC.
Posibles diagnósticos diferenciales:
-neutrofilia secundaria al tratamiento con esteroides
-proceso infeccioso.
En el día 5 de hospitalización, el paciente no presentaba fiebre, la radiografía de tórax fue
negativa, y no había signos o síntomas de infección. Sin embargo, continuaba con tos por lo
que se realizó cultivo de esputo. Paralelamente se registró un aumento en el recuento de
IG, por lo que se realizó la revisión del frotis de sangre periférica ante la sospecha de una
infección. Un patólogo realizó la revisión microscópica y confirmó el aumento de IGs.

En la tabla siguiente se muestran los datos del diferencial leucocitario obtenidos durante
los 7 días de internación:
Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7
WBC totales (103/µL) 13.5 13.6 19.5 26.8 33.6 33.0 23.5
DIFF automatizado en autoanalizador Sysmex
Neu Segs % 65 76 65 N/A 67 N/A N/A
 IG% (H: high) 1.1 1.0 2.3 N/A 5.9 H N/A N/A

El análisis diferencial se realizó paralelamente utilizando el sistema CellaVision DM96

Recuento proporcionado por 100-cell DIFF en CellaVision

Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Dìa 7

Neu Segs 63 76 85 80 88 75 77
Bandas 0 0 0 0 1 4 1
Linfocitos 26 14 12 12 6 14 11
Monocitos 10 10 3 8 3 5 7
Eosinófilos 1 0 0 0 0 0 0
Basófilos 0 0 0 0 0 0 0
Metamielo 0 0 0 0 1 H 2 H 1
Mielocitos 0 0 0 0 0 0 3
Otras Cel. 0 0 0 0 1 H 0 0

Fig. Captura
de pantalla
del
CellaVision
DM96 de la
revisión que
se realizó el
día 5 de
hospitalizaci
ón.

Los scattergramas de los días 1 y 5 fueron comparados con el diferencial en 100 células
realizado en un Cellavision® DM96.
 Scattergrama del día 1 Scattergrama del día 5 Scattergrama normal

Fig. En el scattergrama del día 5 se puede observar el aumento en la nube de puntos color
azul correspondiente a IGs, por encima de la nube de neutrófilos maduros.

Comentarios: El día 5, luego de la revisión del patólogo, el paciente comenzó el tratamiento

con antibióticos profilácticos. El día 7, el recuento de WBC fue disminuyendo y el paciente
fue dado de alta. El día 9, se obtuvo el resultado del cultivo de esputo que corfirmó el
crecimiento de Haemophilus influenzae.
El recuento de IG, que informan los analizadores Sysmex de las líneas XN, XE y XT, es un
parámetro reportable, con una mejor reproducibilidad que el diferencial manual en 100
células, aportando información útil para el paciente.
En este caso, el recuento automático de IG estuvo elevado antes de la observación de
metamielocitos en la revisión realizado en el CellaVision. En el día 5, el diferencial
automático contó 5.9% IG comparado con solo 1% en el diferencial manual (del DM96). El
aumento precoz del recuento de IG en el diferencial automático fue consistente con la
presencia de infección. En este caso, el recuento de IG ayudó al patólogo a identificar la
presencia de infección 4 días antes que el cultivo sea positivo, con el consiguiente beneficio
para el paciente que fue tratado rápidamente con antibióticos.
(Fuente: Sysmex e-news)

Caso clínico
A continuación se muestran scattergramas anómalos obtenidos en un contador de la línea
ADVIA. Se puede observar que los NRBC y los acúmulos de PLT alteran el recuento total y
diferencial de WBC generando diferentes alarmas de sospecha.
Autoanalizador Bayer Advia 120 A la derecha se muestra un scarttergrama
Izquierda: Scarttergrama normal
correspondiente a un neonato que está
cursando una anemia hemolítica.
Este es un scattergrama muy sugerente de la
presencia de GR nucleados.
En este caso se debe revisar el diferencial
leucocitario y el recuento total de leucocitos
ya que los eritroblastos (dependiendo del tipo
de autoanalizador) pueden ser incluidos en el
recuento de leucocitos totales.

Izquierda: scarttergrama normal Derecha: agregados de plaquetas

En los contadores que dan este tipo de
gráfico de distribución, la presencia de la
nube de puntos en la zona señalada hace
sospechar la presencia de “agregados de
plaquetas”.

En otro tipo de contador la sospecha de

agregados de plaquetas puede ser
diferente.
Analizador Bayer Advia 120

Caso clínico
Hombre de 54 años que consulta por fatiga y fiebre. No se observaban linfoadenopatías ni
esplenomegalia.

El hemograma muestra: RBC: 2.55x1012/l

Hb: 8.6 g/dl,
WBC 20.1x109/l
PLT: 81x109/l
Diferencial: Neu 5%, Lin 85%, Mo 10%.

Alarmas de sospecha: blastos, linfocitos atípicos.

Alarmas definitivas: leucocitosis, linfocitosis,
trombocitopenia.

El scattergrama muestra una población anómala ubicada en la región de linfocitos y

monocitos. Los neutrófilos representaban sólo una pequeña población mal definida.
 La fracción de linfocitos estaba aumentada tanto en valor
absoluto como relativo.
El médico realiza interconsulta para descartar posible
leucemia.
Diferencial microscópico (en 200 células): Blastos 59%,
Neu seg 5%, Lin 35%, Mo 1%.
Observaciones: blastos de mediano tamaño sin gránulos ni
bastones de Auer.

Citoquímica: Blastos peroxidasa (-), esterasas (-).

Inmunofenotipo: No se observó reacción de los blastos a marcadores de linaje linfoide cyCD22,
CD19, CD10, cyCD3, CD5, CD2; y reacción significativa para marcadores mielomonocíticos CD13 y
CD33.
Diagnóstico: LMA-FAB M0. En este caso, la ubicación de los blastos en el scatterplot no
indicó a qué linaje pertenecían estas células inmaduras. En la LMA FAB M0 típica, los
blastos son generalmente de tamaño mediano a grande, indiferenciados, con pocos gránulos,
por lo que el analizador, utilizando la tecnología VCS los ubica de acuerdo a sus
características estructurales. El diagnóstico final se basó en el inmunofenotipo.

Otras situaciones en las que es fundamental la observación del diagrama de

dispersión de WBC.

Los siguientes scattegramas del canal WBC/BASO que informan la mayoría de los
contadores Sysmex, muestran diferentes situaciones en las que distintas interferencias,
como la presencia de lípidos, glóbulos rojos resistentes a la lisis (por ejemplo ante la
presencia de HbC o HbS), la presencia de eritroblastos generan también patrones anómalos
que deben alertar al observador.

Normal Interferencia de RBC resistentes a la lisis Glóbulos rojos

lípidos (HbC, HbS) nucleados (neonatos,
(nutrición parenteral) circunstancias
patológicas)

Caso clínico
Mujer de 26 años que se presenta con fiebre persistente de 39°C de 10 días de evolución.
Refería dificultad a la deglución, sudoración nocturna y tos.
En el hemograma de ingreso se obtuvo:
WBC: 14.8x109/L; Hb: 14.7 g/dl; PLT: 97x109/L.
Diferencial: Ne: 7.2%; Li: 63.6%; Mo: 27.9%; Eo: 1%; Ba: 1%.
Alarmas de sospecha: Blastos, Linfocitos atípicos
Alarmas definitivas: Linfocitosis, monocitosis
En el scatterplot (contador de la línea Coulter) se
observó una distribución anómala de las células.
Además de una pequeña población en la zona inferior
del área donde normalmente se ubican los linfocitos,
se puede ver superposición de la población de
linfocitos y monocitos.
El diferencial manual reveló que esto era debido a
grandes linfocitos reactivos típicos de la
mononucleosis, con solo 28% de linfocitos normales.

Algunas de las células anormales fueron

clasificadas como monocitos. La alarma
de sospecha de “blastos” y de “linfocitos
atípicos” alerta sobre la alteración, así
como las alarmas de linfocitosis y
monocitosis. Este paciente también tenía
leucocitosis y trombocitopenia.

Diferencial manual:
Metamielocitos 2 %; Bandas 6 %; NeSeg 10%; Lin 68% con 60% de linfocitos reactivos (ver
imagen), Mo 12%; Eo 1%; Ba 1%.
Observaciones: se observan linfocitos atípicos o variantes.

Pruebas adicionales:
Serología para Virus Epstein-Barr: positiva
Otras serologías virales: negativas
Hepato-esplenomegalia con transaminansas elevadas y gammaglobulinas elevadas.
El contador asignó esta población morfológicamente anormal de linfocitos activados
parcialmente a los linfocitos y, en menor medida, a los monocitos. Esta población dispara la
alarma de “blastos.” La presencia simultánea de desvío a la izquierda de neutrófilos no fue
señalada.
La presencia de linfocitos activados es típica de la mononucleosis infecciosa y de otras
enfermedades virales tales como la infección por citomegalovirus o hepatitis virales.

Detección de infección por Plasmodium

Durante la infección por malaria, los parásitos consumen la hemoglobina y producen un
pigmento malárico constituido por moléculas del grupo
hemo polimerizado. Este pigmento, conocido como
hemozoína, es birrefringente y es aclarado de la
circulación por las células del sistema retículo-endotelial.
Los neutrófilos y monocitos circulantes pueden fagocitar
gránulos del pigmento. Cuando se realiza un CBC
automatizado, el pigmento puede causar una
depolarización atípica de la luz láser que puede ser
reconocida cuando se analiza minuciosamente el
scattergrama.

Existen estudios que evalúan la utilidad de algunos autoanalizadores para el diagnóstico

presuntivo de infección por malaria. La mayoría de los informes son estudios sobre
patrones anormales de depolarización de luz, de autoanalizadores de la línea Cell-Dyn
(Abbott Diagnostics). El Cell-Dyn 3500 fue el primer contador automatizado en detectar,
en base a su patrón de depolarización anormal, la hemozoína en monocitos.
También, existen reportes del analizador Sysmex XE 2100 en relación a la utilidad de la
detección de “pseudoeosinofilia” o de un diagrama de dispersión de WBC anormal, como
parámetros significativos en la detección de Plasmodium en áreas endémicas (sensibilidad:
46,2%, especificidad: 99,7%), donde concluyen que este analizador es capaz de detectar
anormalidades específicas en pacientes con sospecha de malaria.
El analizador Sysmex XE-2100 normalmente diferencia a los eosinófilos de los neutrófilos
en base a distintos patrones de dispersión lateral de luz. En este analizador, los neutrófilos
que contienen hemozoína birrefringente, pueden ser mal identificados como eosinófilos o
aparecer como una población adicional de eosinófilos o neutrófilos atípicos.

Fig. Esquizonte de P. vivax.

En el diagrama de dispersión se puede observar una doble

población de neutrófilos o eosinófilos, una zona de neutrófilos extendida con un espacio
disminuido entre eosinófilos y neutrófilos, o una combinación de los hallazgos anteriores.
 b c d e

b- Nube de neutrófilos extendida o presencia de doble población de neutrófilos

c y d- Disminución de espacio entre los neutrófilos y eosinófilos o doble zona de eosinófilos
e- Eventos anormales por encima del eje X en el canal WBC/Baso.

Caso clínico
Mujer de 36 años admitida por fiebre, dolor muscular y de articulaciones, vómitos y tos
seca de una semana de evolución. Había recibido antibióticos y antipiréticos sin mejoría de
los síntomas. Refería historia de viaje a Nepal un año y medio antes, ocasión en la que había
recibido medicación antimalárica como profilaxis.
El examen físico demostró hígado palpable, presión arterial 110/70 mmHg, pulmones y
corazón normales.
El hemograma al ingreso fue procesado en un contador Sysmex K4500):
Hb: 11.1 g/dl,
WBC: 3.5x103/µl,
Plaquetas: 59x103/µl.
Enzimas hepáticas moderadamente elevadas y PCR de 48 mg/l.
Al día siguiente el hemograma fue procesado en un contador Sysmex XE-2100.
Analizador
Sysmex XE-2100
El scattergrama DIFF evidenció una distribución
anómala doble en la población de granulocitos, con un
corrimiento anormal hacia la izquierda de la población
de eosinófilos. El primer cluster aparecía como una
nube de neutrófilos localizada entre la zona de ruido
eléctrico (fantasmas) y la de neutrófilos; el otro
cluster estaba por encima de la nube de pseudo-
eosinófilos (fig. 1).

Figura 1: Muestra del día 2. La nube de puntos señalada con “-----“

corresponde a neutrófilos conteniendo hemozoína de P. malariae y
se encuentra entre la nube de neutrófilos normales y la zona de
ruido eléctrico o restos celulares (ghost). Esto sugiere que son
elementos con un reducido side scatter, con bajo contenido de
gránulos y bajo contenido de ácidos nucleicos. El otro cluster que
representaría neutrófilos conteniendo hemozoína de P. vivax,
indicado con “ “está por encima del cluster de pseudo-eosinófilos.
Por esta razón se decidió revisar manualmente el extendido. El examen reveló una infección
mixta por P. vivax y P. malariae, basado en la morfología del parásito, pigmentación, tamaño
y forma de los hematíes infectados. Se podían distinguir diferentes estadios de desarrollo,
tales como trofozoítos, esquizontes maduros y jóvenes y gametocitos. A través de una
reacción de PCR se pudo confirmar la co-infección de P. vivax y P. malariae.
Estos eritrocitos estarían cargados con una cantidad suficiente de esquizontes o
gametocitos como para formar una población de pseudo-eosinófilos. Las otras 2 poblaciones
anormales probablemente estén compuestas por neutrófilos con hemozoína fagocitada
(pigmento producto de la digestión de la hemoglobina por el parásito).
En hemogramas posteriores el paciente presentó pseudo-
eosinofilia (18%) sin eosinófilos en el extendido de
sangre periférica, y los neutrófilos conteniendo
hemozoína fueron nuevamente detectados como 2
poblaciones atípicas por el autoanalizador Sysmex XE-
2100 en el scarttergrama de WBC.

Figura: Día 4. Distribución anormal de pseudo-eosinófilos (flecha

entera), localizada cerca del cluster de neutrófilos, correspondiente a
neutrófilos conteniendo hemozoína. La población de pseudo-
neutrófilos causada por P. malariae se mantiene sin cambios.

Analizador Sysmex XE-2100

El paciente recibió tratamiento con primaquina y fue dado de
alta al noveno día luego de su admisión.
En el hemograma previo al alta el scattergrama se había
normalizado (Figura).

Figura: Scattergrama normal luego del tratamiento

(Fuente: Sysmex Journal Int, 2007)

Caso clínico
Se reporta el caso de un paciente cuyo extendido fue revisado manualmente para
confirmar las alarmas de granulocitos inmaduros e interferencia celular. En la observación
microscópica se detectaron eritroblastos pero de una apariencia levemente diferente a la
de eritroblastos normales. Estos eritroblastos eran elipsoides, con áreas claras cercanas al
núcleo (Fig. 1 A), semejantes a los eritroblastos de las aves.
Ante este hallazgo, el tubo correspondiente a esta muestra, fue reprocesado en el
contador LH 780 (Beckman Coulter), y se realizaron nuevos frotis de la misma muestra,
donde se encontraron nuevamente estas células anormales.
Luego de hacer una búsqueda bibliográfica donde se reportaban casos similares, se llegó a
la conclusión de que la muestra del paciente había sido procesada inmediatamente después
del control de reticulocitos, y que este control (Retic-C), contiene una mezcla de glóbulos
rojos humanos y de ave que son normalmente elípticos y nucleados, y que estos eritrocitos
nucleados habían sido introducidos durante el procesamiento (contaminación) en la muestra
del paciente.

La figura A, muestra glóbulos rojos inusuales, de forma elipsoide, con áreas claras perinucleares,
correspondiente a la muestra de un paciente procesada luego del control de reticulocitos (Retic-C).
La figura B, muestra NRBC típicos en otro paciente.
(Fuente: Modificado de Am J Clin Pathol 2013; 140: 127)