Determinación de RH, Fecha inicio: 10/03/2023

PCR y electroforesis. Fecha finalización:15/03/2023

Ensayo biotecnológicos BIO/INF/08

Determinación de RH,
PCR y electroforesis.

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Realizado por: Revisado por: Aprobado por:

Patricia Muñoz Cruces. Maria José Álvarez Pinazo

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Índice:
1.OBJETIVOS. 2
2.FUNDAMENTO. 2
3.PROCEDIMIENTO. 8
4.RESULTADOS. 13
5.CONCLUSIONES. 13
6.OBSERVACIONES. 14
7.BIBLIOGRAFÍA. 15

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1.OBJETIVOS.

● Determinar el Rh, mediante procesos de electroforesis y PCR.

2.FUNDAMENTO.

Análisis de polimorfismos de ADN mediante PCR.

La reacción en cadena de la polimerasa (conocida como PCR por sus siglas en inglés,
Polymerase Chain Reaction) permite amplificar más de un millón de veces un ADN obtenido
a partir de una región seleccionada del genoma, siempre y cuando se conozca una parte de su
secuencia de nucleótidos.Para la PCR se utilizan dos oligonucleótidos sintéticos de unos
15-20 nucleótidos que son complementarios a las zonas flanqueantes de la región que se
quiere amplificar. Estos oligonucleótidos (habitualmente conocidos por su nombre en inglés,
"primers") actúan como cebadores para la síntesis in vitro de ADN la cual está habitualmente
catalizada por una enzima llamada Taq polimerasa. Dicha enzima se aísla de una bacteria
termófila, denominada Thermus Aquaticus, que es capaz de crecer a temperaturas elevadas
(79 - 85 º C). A esta temperatura dicha enzima es capaz de mantener una media de extensión
de más de 60 nucleótidos por segundo en regiones ricas en uniones G-C. La temperatura
óptima a la que actúa la Taq polimerasa permite el uso de elevadas temperaturas para la unión
de los primers y para la extensión, de esta manera se aumenta el nivel de exigencia de la
reacción y se reduce la extensión de los primers unidos específicamente al ADN.
La reacción se lleva a cabo en una serie de ciclos cada uno de los cuales incluye tres fases o
pasos:
1. DESNATURALIZACIÓN: Para que comience la reacción es necesario que el ADN
molde se encuentre en forma de cadena sencilla. Esto se consigue aplicando
temperaturas de 90 a 95ºC que producen la rotura de los puentes de hidrógeno
intercatenarios y por lo tanto la separación de ambas cadenas. Para conseguir la
completa separación de las hebras de toda la muestra esta temperatura debe

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mantenerse unos minutos. Si el ADN sólo se desnaturaliza parcialmente éste tenderá a

renaturalizar rápidamente, evitando así una eficiente hibridación de los primers y una
posterior extensión.
2. HIBRIDACIÓN: Esta fase se denomina también fase de “annealing” o de
emparejamiento. Una vez que el ADN está desnaturalizado se disminuye la
temperatura hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60ºC para que se pueda
producir la unión de los primers a las secuencias flanqueantes del fragmento que se va
a amplificar. La temperatura de fusión o annealing (Tm, “melting temperature”)
depende de varios factores y es relativamente específica para cada primer. La longitud
de los primers y la secuencia son críticas en la designación de los parámetros de una
amplificación, una fórmula simple para calcular la Tm es la siguiente:
Tm = 4(G+C) + 2 (A+T).
No obstante, cada primer exige una serie de estudios experimentales para
determinar su temperatura de annealing específica ya que si la temperatura es
muy baja la unión se hará de forma inespecífica y si es muy alta no se producirá
una unión completa.
3. EXTENSIÓN: Durante este paso la Taq polimerasa incorpora nucleótidos en el
extremo 3' del primer utilizando como molde la cadena de ADN previamente
desnaturalizada. La temperatura a la que se lleva a cabo este paso suele ser de 72ºC ya
que es la temperatura a la que la Taq polimerasa alcanza su máxima actividad.
Normalmente una extensión de 20 segundos es suficiente para fragmentos menores de
500 pb, y 40 segundos para fragmentos por encima de 1.2Kb.
Un factor importante en el transcurso de las diferentes fases es el tiempo de rampa. Este se
define como el tiempo invertido en pasar de una temperatura a otra y depende del diseño y de
las características del aparato donde se realiza automáticamente este proceso, el
termociclador. En las nuevas generaciones de termocicladores este factor se ha ido
optimizando para hacerlo mínimo.
Los componentes básicos de la PCR son:

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- BUFFER DE AMPLIFICACIÓN
Los buffer de PCR que se utilizan normalmente contienen KCl, Tris y MgCl2. El
MgCl2 es el componente que más influye en la especificidad y rendimiento de la reacción ya
que los iones Mg2+ son necesarios para la actividad de la Taq polimerasa, es decir, actúan
como cofactores de la polimerasa.
- PRIMERS
Consisten en fragmentos de doble cadena cuya longitud es muy próxima a la de la
suma de los primers y se producen cuando un primer es extendido a continuación del otro. El
mecanismo exacto por el que se forman estos dímeros no está completamente determinado.
La observación de que primers con los extremos 3' complementarios favorecen su formación
sugiere que el paso inicial se debe a interacciones transitorias que aproximan los extremos
complementarios. Algunas polimerasas, incluida la Taq, han mostrado una débil actividad
polimerizadora no dirigida por un ADN patrón, la cual puede unir nucleótidos adicionales al
doble extremo apareado. Si esta actividad puede producirse sobre una hebra sencilla de
oligonucleótidos, resultaría una buena oportunidad para que la extensión formará un corto
solapamiento en el extremo 3' con el otro primer, suficiente para promover la formación del
dímero.
- TAQ-POLIMERASA
Las cantidades óptimas de Taq polimerasa necesarias para la síntesis de ADN están
alrededor de 2 unidades en 25 µl de volumen final de reacción. La actividad de este enzima
se ve influenciada por la concentración de dNTPs, de Mg2+ y de algunos iones monovalentes
de manera que concentraciones elevadas de los mismos inhiben dicha actividad.

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Por otro lado, pequeñas concentraciones de KCl estimulan la actividad sintética de la

Taq en un 50-60% con un máximo aparente cuando su concentración es de 50 mM. Existen
algunos datos relacionados con la influencia de ciertos reactivos que se emplean antes de la
amplificación y que alteran la actividad de la Taq. Por ejemplo concentraciones 1M de urea
estimulan la actividad, el SDS a bajas concentraciones que la inhibe al igual que
concentraciones mayores del 10% de etanol.
- DESOXINUCLEÓTIDOS TRIFOSFATOS
Las concentraciones de dNTPs que suelen usarse están en torno a 200 µM para cada
uno de ellos. En un volumen de reacción de 25 µl con esta concentración de dNTPs se
sintetizaron entre 6-6.5 µg de ADN. La concentración de dNTPs y de MgCl2 va relacionadas
ya que el Mg se une a los dNTPs con lo que concentraciones elevadas de dNTPs inhibirán la
reacción al no tener la Taq polimerasa suficiente Mg como para incorporar dNTPs. Para una
concentración de 200 µM de cada dNTP se suele añadir MgCl2 a una concentración de 1.5
mM.
- ADN MOLDE O “TEMPLATE"
Es el ADN del cual queremos copiar un determinado fragmento, es, por tanto, el ADN
que la Taq polimerasa utiliza como molde para la síntesis de nuevas cadenas
polinucleotídicas. La cantidad de ADN necesaria para la PCR depende de varios factores:
Del marcador que se va a amplificar: hay marcadores cuyos primers son más
específicos o bien cuyas condiciones de amplificación están mejor optimizadas que las de
otros. Por esta razón puede darse el caso de que cierta cantidad de ADN (sobre todo cuando
jugamos con cantidades mínimas) se amplifique para unos marcadores pero no para otros. Por
ello, cuando en un laboratorio se va a utilizar un nuevo marcador es necesario hacer un
estudio de validación en él que se incluye un estudio de sensibilidad.

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Después de realizar la parte de la PCR, procedemos a realizar la electroforesis en gel

de agarosa, que separa pequeñas moléculas de ADN basándose en propiedades como el
tamaño, la forma o la carga eléctrica.
Al situar las moléculas de ADN (cargadas negativamente) en el gel y aplicar una
diferencia de potencial eléctrico, las moléculas se mueven a diferentes velocidades, movidos
por la corriente eléctrica. El gel es una sustancia porosa. Los fragmentos más pequeños y
ligeros avanzarán mejor por los poros. Por contra, los más grandes y pesados quedaran más
rezagados.

Por lo tanto, cuando se ha completado la electroforesis, las moléculas más pequeñas

han llegado más cerca del ánodo.

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Una vez finalizada la electroforesis se pueden ‘revelar’ los resultados mediante la

adición de un colorante específico para hacerlas visibles. Se emplean compuestos como el
bromuro de etidio, para los ácidos nucleicos.

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3.PROCEDIMIENTO.

1. Colocar 600-800 ML de saliva en un microtubo de 1.5 mL. Centrifugar durante 90

segundos a 13.000-16.000 x g. Eliminar el sobrenadante con pipeta sin dañar el pellet
blanco visible de células.
2. Añadir 600 ML de Tampón de Lisis. Resuspender con la micropipeta mediante
movimientos arriba y abajo, para disolver el pellet de células y alisarlo.

3. Incubar durante 10 minutos. Agitar los tubos suavemente cada 2 minutos. Si es

posible incubar a 37 °C, ya que esto mejorará el rendimiento.

- Precipitación proteica:

1. Añadir 200 L de Tampón de Precipitación de proteínas al lisado celular.

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2. Mezclar vigorosamente con un agitador tipo vórtex, a máxima velocidad durante

20-30 min.

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3. Centrifugar a 13.000-16.000 × g durante 5 minutos. Se formará un precipitado. Si se

observan partículas flotando volver a centrifugar después de incubar 5 minutos en hielo.

- Precipitación del ADN:

1. Traspasar el sobrenadante que contiene el ADN a un microtubo de 1,5 ml que

contenga 600 mL de Isopropanol.

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2. Mezclar por inversión unas 25-50 veces.

3. Centrifugar a 13.000-16.000 × g durante 2 minutos. EI ADN será visible como un

pellet blanco.

4. Eliminar el sobrenadante y secar el tubo de forma breve en papel absorbente. Añadir

600 µL de Etanol 70 % para lavar el ADN.

5. Centrifugar a 13.000-16.000 × g durante 1 minuto. Cuidadosamente eliminar el

sobrenadante sin tocar el pellet de ADN. Volver a centrifugar brevemente y con una
micropipeta y punta fina recoger las últimas gotas del etanol residual.

6. Invertir el microtubo en un papel absorbente y dejar secar durante unos 5-10 minutos.

- Hibridación del ADN

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1. Añadir 100-750 ML de Tampón de Hidratación, dependiendo del tamaño del pellet

de ADN, y resuspender con micropipeta. Es posible que los pellets de gran tamaño necesitan
una incubación a 55 °C durante 1 hora para poder resuspenderios completamente antes de
llevar a cabo la PCR. Para pellets muy pequeños se puede utilizar 25-50 pL de Tampón de
Hidratación.

2. Conservar a 2-8 °C. Para almacenajes largos conservar a -20 °C o - 80 °C.

- CUANTIFICACIÓN DEL ADN:

Medir directamente el extracto de ADN obtenido con el kit comercial, o bien, diluido
1/10. También, podríamos cuantificar tras la PCR, para comprobar el gran aumento de
concentración en la amplificación, usando 1ul en 1 ml en agua destilada autoclavada. En ambos
casos medir la absorbancia a 260 m, 280 m y 230 nm, empleando agua como blanco,
calculando la concentración de ADN, así como el cociente correspondiente.

A260• K • factor de dilución = X ug/ml

Siendo K una constante, K = 50 ug/mL para convertir la absorbancia a cantidad de ADN y 40
ug/mL para la conversión a ARN. Una muestra de ADN de pureza aceptable presenta un
A260/A280 = 1,8 y el ARN de pureza aceptable presenta un A260/A280 = 2,0.

- DETERMINACIÓN DEL FACTOR RH POR PCR

- Extracción del ADN

El paso previo a cualquier estudio genético suele ser el aislamiento del ADN genómico, esto
se puede llevar a cabo de diferentes formas (métodos caseros, kits comerciales, etc.) y a partir

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de diferentes muestras (sangre, tejido, etc.). Para la realización de esta práctica usaremos el
ADN extraído de la saliva humana de las prácticas anteriores.

- Reacción de la PCR

1. Utilizar 5 ML (100-250 ng) del ADN de cada alumno para cada reacción de PCR.
IMPORTANTE: Preparar un control positivo y un control negativo.

a) Preparar un control negativo de amplificación, para ello colocar 5 l de agua libre de

nucleasas en lugar del ADN, esto sirve para saber si los reactivos o micropipetas y puntas
pueden estar contaminados con ADN. En el control negativo no se ha de amplificar nada.
b) Preparar un control positivo de amplificación, para ello colocar 5 l del control positivo
Rh + en lugar del ADN.

La cantidad de ADN de partida en la PCR, es un parámetro importante y crítico para obtener

un buen resultado, cantidades muy bajas de ADN dan lugar a una baja amplificación,
presentando bandas muy tenues, difíciles de observar o incluso imposible de ver, y cantidades
elevadas de ADN puede dar lugar a la saturación de la Taq inhibiendo su reacción. El KIT
está optimizado para poner 2,5 l de ADN extraído, no obstante habrá alumnos que extraigan
poco y será aconsejable poner el doble volumen (5:l), mientras que los que han observado
mucho ADN en la extracción pondrán 2,5 pl.
2. mezclar bien, el colorante rojo incluido en la polimerasa facilita el proceso.

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3. Para aquellos termocicladores que no tengan un "heated lid", añadir 25 L de aceite

mineral para prevenir la evaporación. En nuestro caso no es necesario.
4.Realizar el proceso de amplificación.
5. El producto de la PCR puede ser sembrado directamente en un gel de agarosa
después de la PCR, ya que lleva un colorante rojo, sin embargo, este colorante rojo solo
ayuda a la correcta visualización de la carga, siendo, por tanto, más aconsejable usar para la
electroforesis un tampón de carga (que contenga glicerol y un colorante para ver el frente de
avance).

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6. Tras la electroforesis realizar la detección o tinción del ADN. En nuestro caso

usaremos un fluoróforo y visualizamos las bandas con un transiluminador.

CARGA Y CORRIDA DE LA MUESTRA

1. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS, LOS CONTROLES Y DEL
MARCADOR DE PESO MOLECULAR (MPM):
a) Tomar 10 o 20 µl del tampón de carga 6X con el Redsafe, previamente preparado y
añadir 10 l de la muestra de ADN (productos de amplificación de la PCR). Es Aconsejable
una carga de muestra con una cantidad de tampón adecuada para que el tampón de carga
quede 1X, nunca debe quedar por debajo de 1X, para que tenga densidad suficiente y arrastre
la muestra al fondo del pocillo (en nuestro caso quedará 3X o 2X, aunque sea superior a 1X
nos ayudará a sembrar con más facilidad).

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b) Preparar el control positivo y el control negativo de igual modo que las muestras.
c) Usar un carril para el marcador de pesos moleculares conocido (MPM),
disponemos de dos MPM:
- Marcador EZ load 100 bp PCR Molecular Ruler (dicho marcador lleva
añadida su propia disolución tampón de carga), en este caso sembrar
directamente en el pocillo de 20 a 30 µl
- Marcador Danamarked Shumann (es el marcador del KIT y trae 20 l, trae un
colorante de menor resolución que el redsafe), en este caso es aconsejable
añadir disolución tampón de carga 6X, usaremos 20 L de marcador más 10 uL
de tampón de carga.
Se aconseja preparar las mezclas sobre Parafilm, colocando con la misma punta de
pipeta las cantidades necesarias de tampón de carga en zonas bien distanciadas, y
posteriormente, agregar con otras puntas nuevas las muestras, los controles y el marcador de
peso moleculares a cada una de las gotas comechondian
1.CARGA: sembrar las muestras con una pipeta automática introduciendo la punta de
ésta con la muestra dentro de cada pocillo, evitando romper el pocillo, esparcir la carga o
contaminar el pocillo vecino.

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En el caso de MPM EZ load 100 bp PCR molecular Ruler sembrar directamente en su

pocillo, no olvidar hacer un esquema de todos los pocillos y sus cargas.
2.CORRIDA: Realizar la corrida a un voltaje constante de 100 v, durante unos 45
min, controlando el frente de avance. Si no se dispone de tiempo suficiente para realizar la
corrida en gel, puede ampliarse el voltaje a 120 V y reducir los tiempos a 25 min,teniendo en
cuenta que a más tiempo y menor voltaje se obtiene una mejor resolución de bandas.

3.Detener la electroforesis cuando el colorante que migra más deprisa esté a 1 cm al

final del gel y proceder a visualizar los resultados.

VISUALIZACIÓN DEL GEL

La detección se realizará por inspección visual en un transiluminador UV, apareciendo
las bandas de color más brillantes que el gel.

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4.RESULTADOS.

Como observamos, no se obtiene un resultado concreto, sino que se han unido las dos
bandas de ADN y obtenemos una nube de muestras.

5.CONCLUSIONES.

Tras la realización de esta práctica observamos que no nos sale un resultado concreto
ya que las muestras se nos han juntado y se ha formado una especie de nube de los dos ADN
mezclados.Que después de investigar un poco por internet, esto se ha podido deber a:

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O también eso puede deberse a que se ha quedado más de 48 horas en tampón TAE,
por lo que ello ha podido degradar el gel, ya que la placa de gel también estaba deformada un
poco.

6.OBSERVACIONES.

Un paso muy importante a la hora de realizar esta práctica, es suspender completamente

el pellet sin que se observe ningún grumo blanco, ya que sino la cantidad de ADN obtenida
será pequeña.

Otro paso importante es saber que si las diluciones no son las adecuadas a la hora de
la cuantificación, tras ver las lecturas de las absorbancias, se deben realizar otras diluciones.
Para la activación de la Polimerasa "HOT STAR" es necesario programar un paso de
desnaturalización inicial de 10 minutos a 95 °C, después programar los 30 o 40 ciclos
específicos de cada producto a amplificar.

7.BIBLIOGRAFÍA.

● https://biomodel.uah.es/an/plasmido/0/probl.htm

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