UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS

FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES

PIGMENTOS: EXTRACCIÓN- SEPARACIÓN Y CUANTIFICACIÓN

Autores: ​Luz Angelly Fandiño Cruz,​1 ​Laura Katherin Bernal Riaño,​2​ Eduardo Esteban
Ventura Caceres​3

RESUMEN
los pigmentos en bioquímica son sustancias que están incorporadas a las texturas de los
alimentos, en este caso específicamente incorporadas a las estructuras superficiales de las
hojas de las plantas, la clorofila son una familia de pigmentos que les proporcionan un color
específico a las plantas (verde) ya que es el color que reflejan cuando la luz incide en él y
que este no absorbe, en este informe se investigó la forma en cual podemos extraer la
clorofila para su eventual estudio, identificar el tipo de clorofila presente en las hojas de
muestra y calcular la cantidad de clorofila presente en las hojas de espinaca, se encontró una
diferencia relevante en cuanto a la cantidad de clorofilas totales de cada una de las muestras
empleadas en el laboratorio y de igual forma se encontró que la técnica más eficiente para la
extracción y separación de los pigmentos y es la cromatografía en capa fina, se identificaron
gracias a ella el tipo de clorofilas presentes en la espinaca y por último el laboratorio arrojó
una estrecha relación entre Clorofilas, carotenoides, las proteínas y los lípidos de las
membranas de los cloroplastos.

INTRODUCCIÓN

En las células eucariotas fotosintéticas tanto las reacciones dependientes de la luz como las de
fijación de carbono tienen lugar en los cloroplastos, orgánulos intracelulares limitados por
una membrana que son variables en forma y tienen generalmente unos pocos micrómetros de
diámetro. Están rodeados de dos membranas, una externa que es permeable a pequeñas
moléculas e iones y una interna que encierra el compartimiento interno. Este compartimiento
contiene mucha vesículas y rodeados de membrana llamados tilacoides, que están ordenados
en forma de pilas denominadas grana. Los pigmentos fotosintéticos y los complejos
enzimáticos que llevan a cabo las reacciones luminosas y la síntesis de ATP están incrustados
en las membranas de los tilacoides [1].

Con excepción de las bacterias fotosintéticas y de unas cuantas algas, casi todas las células
fotosintéticas contienen dos formas moleculares idénticas de clorofila, una llamada ​clorofila

1​
Código estudiantil: 20181180104. Grupo 543. Estudiante de Ingeniería Ambiental. Universidad Distrital Francisco José de
Caldas. Laboratorio de Bioquímica, Bogotá D.C., Colombia. Email:lafandiñ​oc@correo.udistrital.edu.co
2​
Código estudiantil: 20182780010. Grupo 543. Estudiante de Ingeniería Ambiental. Universidad Distrital Francisco José de
Caldas. Laboratorio de Bioquímica, Bogotá D.C., Colombia. Email: ​lkbernalr@correo.udistrital.edu.co
3​
Código estudiantil: 20182180016. Grupo 543. Estudiante de Ingeniería Ambiental. Universidad Distrital Francisco José de
Caldas. Laboratorio de Bioquímica, Bogotá D.C., Colombia. Email: eeventurac@correo.udistrital.edu.co
a ​y otra ​clorofila b.​ La estructura básica de todas las clorofilas presenta una unidad
tetrapirrólica plana que contiene metal [2].

La gama de radiaciones solares que llega hasta la corteza terrestre se denomina luz visible o
blanca; su límite inferior de longitud de onda es de 400 nm y el límite superior de longitud de
onda es de 700 nm [1]. Los organismos fotosintéticos tienen la tarea de dominar esa energía
radiante y convertirla en energía química útil para el sostén no solo de su propia existencia,
sino también de la de todos los organismos aeróbicos no fotosintéticos (heterótrofos) [3].

Los pigmentos clorofílicos son el pigmento biológico más abundante en la tierra y debe su
color verde a su capacidad de absorber las fracciones roja y azul de la luz solar. Las hojas
pueden llegar a contener hasta 1 g de clorofila m─2 , aunque esta concentración es muy
variable entre especies y sobre todo depende, entre otros factores, del estado nutricional, la
edad o la historia lumínica previa de la planta [4]. Los pigmentos más importantes que
absorben luz en las membranas de los tilacoides son las clorofilas, pigmentos verdes con
estructura policíclicas planas que se parecen a la protoporfirina de la hemoglobina, excepto
en que la posición central está ocupada por Mg2+ en lugar de Fe2+. Los cuatro átomos de
nitrógeno orientados hacia el interior de la clorofila están coordinados con el Mg+ [2].

Imagen 1​. Las clorofilas a y b y la bacterioclorofila son los principales colectores de energía
luminosa [2].

CAROTENOIDES

Es la denominación con la que se reúnen a los carotenos y las xantofilas, son derivados
tetraterpénicos que presentan dobles enlaces conjugados y un anillo ciclohexano sustituido
insaturado en cada extremo de la cadena lineal. Son sustancias solubles en solventes
orgánicos, de color anaranjado con un máximo de absorción a 530 nm. Estos compuesto
presentan en las plantas una función doble, como pigmentos accesorios en la captación de
energía lumínica y como moléculas capaces de disipar la energía de excitación excedente en
forma de calor evitando daños importantes. Mientras que como transductores de energía
hacia los centros de reacción no son muy eficientes (30 % - 40 % de eficiencia) como
disipadores de la energía absorbida en exceso por la clorofila son altamente eficientes [5].
Los carotenoides son tetraterpenos constituidos por múltiples unidades isoprenoides con un
anillo de ciclohexano sustituido e insaturado en cada uno de los extremos. Son moléculas
lipofílicas, con nula solubilidad en agua. La propiedad de absorber luz se deriva de la
presencia de 7 o más enlaces dobles conjugados con posibilidad de absorber luz visible, con
colores que van del amarillo al rojo. La cadena poliénica de los carotenoides es altamente
reactiva y rica en electrones. En presencia de oxidantes fácilmente se forman radicales libres
de vida corta. Los radicales libres como ·O2 e hidroxilo ·OH son especies altamente
reactivas capaces de iniciar la peroxidación de lípidos, inactivar proteínas, o causar daño
molecular de ADN o ARN [6]

CAROTENOS

Son una familia de compuestos químicos que se caracteriza por su coloración que oscila entre
rojo, naranja y amarillo. Dichas moléculas están constituidas de una cadena corta
hidrocarbonada (moléculas que contienen átomos de carbono e hidrógeno). El compuesto
más conocido dentro de esta familia es el betacaroteno (β-caroteno), el cual puede ser
encontrado en numerosas frutas y vegetales como la zanahoria, pimiento rojo y camote. Estos
últimos contienen mayor cantidad de βcaroteno respecto a otros como el brócoli, pimiento
verde y mango [4]. El caroteno más importante en las plantas es el β-caroteno y la luteína es
la principal xantofila, pero hay además otras xantofilas que aun no estando en tan alta
concentración como los anteriores juegan un papel decisivo en la disipación de la energía
excedente: violaxantina, anteraxantina y zeaxantina [5]. La función más importante de los
carotenos en las plantas vasculares es la disipación de la energía en exceso y en la
detoxificación de las formas reactivas del oxígeno que se forman durante la fotosíntesis.

Imagen 2.​ Estructura molecular del Caroteno [2].

XANTOFILOS

Son compuestos químicos parecidos a los carotenos, y a diferencia de estos últimos además
de contener carbono e hidrógeno contienen uno o mas átomos de oxígeno dentro de la
molécula, pero al igual que los carotenos, presentan colores llamativos (rojo, naranja y
amarillo). Vegetales como el pimiento amarillo y rojo (Figura 1) representa n una fuente
importante de xantofilas [4].

Imagen 3.​ Estructura molecular de Xantofilos

Todas las clorofilas tienen una cadena lateral larga de fitol, esterificado a un grupo carboxilo
sustituyente del anillo IV. Además las clorofilas tienen un quinto anillo de cinco átomos que
no está presente en el hemo. El sistema de cinco anillos heterocíclicos que rodea el Mg2 +
tiene una estructura poliénica extendida con enlaces sencillos y dobles alternantes. Este tipo
de polienos muestra una absorción fuerte característica en la región visible del espectro; las
clorofilas tienen coeficientes de absorción molar anormalmente elevados, por lo que están
especialmente capacitadas para absorber la luz visible durante la fotosíntesis [2].

Imagen 4​. Absorción de la luz visible por fotopigmentos [2].

En las reacciones luminosas de las plantas, la absorción de un fotón excita moléculas de
clorofila y otros pigmentos que canalizan la energía hacia centros de reacción situados en las
membranas tilacoides. en los centro de reacción la fotoexcitación produce una separación de
carga que produce un buen dador electrónico (agente reductor) y otro que es un buen aceptor
electrónico [3]

.
Imagen 5. ​Organización de los fotosistemas en la membrana del tilacoide. [2]

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

La cromatografía es una técnica de separación basada en el principio de retención selectiva,

que permite separar los distintos componentes de una mezcla facilitando su identificación y
cuantificación. El nombre de la técnica se debe al botánico ruso Mikhail Semenovich Tswett,
quien usó columnas de vidrio rellenas de carbonato de calcio para separar pigmentos
vegetales [6] Las técnicas cromatográficas son muy variadas, sin embargo, en todas el
fenómeno de separación ocurre al hacer pasar una fase móvil fluida (gas, líquido o fluido
supercrítico), que arrastra a la mezcla, a través de una fase estacionaria constituida por un
sólido finamente dividido o un líquido fijado en un sólido. En este proceso los componentes
de la mezcla interaccionan de diversa manera con la fase estacionaria y debido a esto
atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades, por lo cual se van separando [7].

Imagen 6. (a) Mikhael Tswett (1872 – 1919); (b) separación de pigmentos vegetales por
cromatografía en papel.

La fase estacionaria está constituida simplemente por una tira de papel de filtro. La muestra
se deposita en un extremo colocando pequeñas gotas de la disolución y evaporando el
disolvente. Luego el disolvente empleado como fase móvil se hace ascender por capilaridad.
La separación se realiza en función de la afinidad de los solutos con las dos fases, las más
solubles en agua se quedarán cerca del punto donde se aplicó la muestra, y las menos solubles
en agua y más solubles en el disolvente llegarán más lejos. Las sustancias separadas se
identifican mediante diversos procedimientos físicos o químicos. [6]

Al entrar en contacto con los disolventes empieza su fase de movilidad lo que produce unas
manchas características sobre el papel, generalmente, estas no son coloreadas y se revelan
con una lámpara fluorescente, los contornos se marcan con lápiz. Como medida en
cromatografía sobre papel se emplea el Rf (Retention factor), el cual se define como el
cociente de dividir el recorrido de la sustancia por el disolvente, esto es, la distancia media
desde el origen hasta el centro de la mancha (X) dividida por la distancia que media desde el
origen hasta el frente del disolvente (S).

𝑅𝑓 = 𝑋/S

En la cromatografía en papel se utiliza como fase estacionaria una hoja de papel de celulosa
de elevada pureza recubierta de una capa de agua asociada a las fibras de celulosa. La fase
móvil, en la que irá disuelta la muestra, se forma por disolventes cuya naturaleza se elige en
función de los componentes que se pretenden separar [7].
El objetivo del laboratorio se basa en la extracción y separación de los diferentes tipos de
pigmentos por cromatografía en papel en función de su polaridad relativa para su posterior
identificación. Una vez separados, se analizará su migración a lo largo de la fase estacionaria.

METODOLOGÍA

Ilustración 1. ​Desarrollo de la metodología para la extracción y separación de pigmentos

RESULTADOS

Por medio de la utilización de un espectrofotómetro se obtienen los siguientes resultados de

longitudes de onda para las muestras empleadas.

Tabla 1. ​Resultados longitudes de onda con el espectrofotómetro

λ 645 λ 663

1 0.127 0.296
 2 0.410 1.017

3 0.393 0.921

4 0.137 0.325

5 0.180 0.422

Por medio de la siguiente ecuación Clorofila total (μg/mL o mg/L) = (20.2 · DO​645​) + (8.02 ·
DO​663​), se realizó el cálculo de la clorofila total que hay por cada gramo de hoja.

Tabla 2. ​Resultados de clorofilas totales

Tubo Clorofilas totales (μg/mL)

1 (20.2 * 0.127) + (8.02 * 0.296) = 4.9

2 (20.2 * 0.410) + (8.02 * 1.017) = 16.4

3 (20.2 * 0.393) + (8.02 * 0.921) = 15.3

4 (20.2 * 0.137) + (8.02 * 0.325) = 5.4

5 (20.2 * 0.180) + (8.02 * 0.422) = 7.0

Cromatografía de capa fina

Se presentan las distancias tanto del solvente como de cada uno de los pigmentos utilizados
en la prueba mediante cromatografía de capa fina.

Tabla 3.​ Distancias de los pigmentos de cromatografía de capa fina

Pigmentos

Solvente
5,1 cm
acetona: éter de petróleo

P1 0,3 cm

P2 0,8 cm

P3 3,0 cm

P4 4,8 cm

Seguido a esto, se procede a calcular el factor de retardo o retraso (Rf), el cual se tendrá como
base para identificar los pigmentos que se revelaron durante la prueba.
Tabla 4.​ Determinación del valor de Rf para pigmentos de cromatografía de capa fina
Relación de frentes (Rf)
Distancia recorrida por el pigmento
Rf = Distancia recorrida por la f ase movil

Pigmentos Cálculo Pigmento revelado

0.3 cm
P1 Rf = 5.1 cm
= 0.06 Clorofila b
0.8 cm
P2 Rf = 5.1 cm
= 0.16
Clorofila a

3.0 cm
P3 Rf = 5.1 cm
= 0.59
Carotenos (Xantofila)

4.8 cm
P4 Rf = 5.1 cm
= 0.94
Carotenos (Xantofila)

Fuente: ​Autores

Cromatografía de papel

Tabla 4. ​Distancia de los pigmentos en la cromatografía de papel

Pigmentos

Solvente 15 cm

P1 0,9 cm

P2 2,0 cm

P3 9,8 cm

P4 12,5 cm

A partir de lo anterior, se calcula la relación de frentes (Rf), para identificar los pigmentos
revelados en la prueba.

Tabla 5.​ Determinación del valor de Rf para pigmentos de cromatografía de papel

Relación de frentes (Rf)
Distancia recorrida por el pigmento
Rf = Distancia recorrida por la f ase movil

Pigmentos Cálculo Pigmento revelado

 0.9 cm
P1 Rf = 15 cm
= 0.06
Clorofila b

2.0 cm
P2 Rf = 15 cm
= 0.13
Clorofila a

9.8 cm
P3 Rf = 15 cm
= 0.65
Caroteno (xantofila)

12.5 cm
P4 Rf = 15 cm
= 0.83
Caroteno (xantofila)

Fuente:​ Autores

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Extracción y separación de clorofilas totales

Para las clorofilas totales (ver tabla 2), se evidencia que se obtuvieron como resultado
clorofilas totales que fueron desde los 4.6 μg/mL hasta los 15.3 μg/mL, diferencias
considerables que son presuntamente debidas al rendimiento de la hoja, es decir la cantidad
de clorofila dependerá de varios factores sobre todo climáticos pues dentro de la Facultad de
Ingeniería Agronómica de la Universidad Técnica de Manabí en Ecuador en el 2018 se
hizo un estudio que sobre las clorofilas totales de la planta de cacao clonada y encontraron
diferencias considerables sobre la cantidad de clorofilas totales.

Atribuyeron la gran diferencia (aprox. 10μg/mL) que habría entre cada hoja de cacao
recolectada a la mayor o menor adaptabilidad que las plantas tienen frente a las variaciones
de ambiente, en el caso específico del cacao tuvo una gran incidencia la cantidad de déficit
hídrico que tiene cada una de las muestras recolectadas en el estudio. [11]

Pero para el caso de las hojas de la ​Spinacia oleracea o espinaca, también podemos tener en
cuenta la cantidad de radiación solar que recibe la hoja antes de su recolección, sabemos que
para la producción de la clorofila es necesario que exista un buen aporte de luz y en su
mayoría ambientes “cálidos”, es por esta misma razón por la cual en las zonas que tienen
estaciones (invierno,otoño,primavera, verano), cuando hace mayormente más frío
encontramos hojas de colores naranjas y esto es a razón de la falta de calor y de luz solar en
algunos casos, al perder en su mayoría estos elementos de su ambiente la hoja deja de
producir clorofila se torna en un color rojizo y eventualmente cae; está es una particularidad
que ocurre en otoño para las zonas con estaciones.

Por lo tanto podemos decir que dentro de nuestras diferencias encontramos que gracias a
diferentes factores climático-ambientales, las muestras con mayor cantidad de clorofila
encontraron en sus ambientes una mayor ventaja en cuanto a las condiciones
climático-ambientales pero, para los que se encontraba una menor proporción de clorofila
puede que no haya recibido suficiente luz solar en su etapa de crecimiento y desarrollo, lo
cual ocasionó que no se hayan producido tantas clorofitas como es el caso de las muestras
que obtuvieron una alta cantidad de clorofilas totales. [12]

Separación de pigmentos en cromatografía en papel y en capa fina

En general, el color que presenta un determinado tejido u órgano vegetal, depende del
predominio de un pigmento o de la combinación de varios de ellos, los pigmentos son
moléculas capaces de absorber y reflejar la luz, estos le dan el color característico a las
plantas. Además, captan la energía lumínica y la transforman en energía química mediante la
fotosíntesis. [8]

Los pigmentos revelados durante la prueba fueron: clorofila a, clorofila b y caroteno

(xantofila). Para la identificación de dichos pigmentos, se calculó la relación de frentes (Rf),
puesto que, mediante el análisis de este factor, se permite evaluar el ordenamiento de los
colorantes con polaridad creciente, de esta forma, cuanto más cercano es su Rf a 1, mayor
vinculación con la fase móvil posee. De modo inverso, cuanto menor sea el Rf, menor
relación con la fase móvil y mayor con la fija. [8]

Las técnicas cromatográficas basadas en la polaridad son técnicas que permiten la separación
de las moléculas de una mezcla biológica en función de la distinta polaridad de estas. En el
proceso se establece la distribución de las moléculas entre dos fases (una móvil, que se
mueve por acción de alguna fuerza; y la otra estacionaria, que ejerce la fuerza de retardo),
que se encuentran en contacto y que tienen diferente polaridad, de esta manera, se establecen
interacciones más fuertes con una de las dos fases. La cromatografía líquido-líquido, del
presente informe, basa su principio de separación en la solubilidad diferencial, en donde las
moléculas migran más lentamente cuanto más solubles son en la fase estacionaria y menos en
la fase móvil. [9]

En la cromatografía en papel, donde el agua unida a la celulosa actúa como fase estacionaria
(polar) y la fase móvil (menos polar), puede ser una mezcla de diferentes solventes orgánicos.
La cromatografía en capa fina, presenta mayor velocidad de separación y una mejor
resolución de esta última. [9]

Los carotenos ( banda amarilla) se van separando de la clorofila (banda verde) debido a la
diferencia de afinidad de cada uno frente a la fase móvil. El éter de petróleo es un solvente no
polar, que en solución con un solvente polar (acetona) da un eluyente muy poco polar. El más
polar de los solutos es la clorofila B, que a causa de su bajo Rf, tiene un baja ascenso por la
placa cromatográfica, de esta forma, posee mayor afinidad por la fase fija. La clorofila
asciende el doble que el compuesto anterior, pero aun así tiene más afinidad por la fase fija.
Los carotenos, que presentaron un elevado Rf, revelan una gran atracción por la fase móvil.
[10]

La clorofila tiene como función captar luz de longitudes de onda 400 a 700 nm, absorbe todas
las longitudes de onda de luz visible excepto la verde, la cual es reflejada. En este caso, es el
radical fitol el responsable de la característica cerosa de la clorofila y explica su solubilidad
en solventes orgánicos y su insolubilidad en agua. [10]

CONCLUSIONES

La extracción y la separación de clorofilas totales presentó una gran diferencia en cuanto a la

cantidad de clorofilas presentes en las hojas de muestra, hubo una diferencia notable en el
ambiente de crecimiento y en la cantidad de luz solar que se recibe durante el desarrollo de
las hojas de espinaca.

La cromatografía en capa fina presenta mayor velocidad de separación y una mayor

resolución de esta. Por lo cual, significa que tiene una mayor eficiencia en los procesos de
extracción y separación de pigmentos.

Se logra identificar, que de manera general, los cloroplastos contienen tanto clorofila como
clorofila b pero la mayoría contiene el doble de clorofila a que de b. Aunque las dos son
verdes, sus espectros de absorción son suficientemente diferentes.

Clorofilas y carotenoides se encuentran en estrecha asociación entre sí y con proteínas y

lípidos de las membranas de los cloroplastos. Los pigmentos fotosintéticos pueden extraerse
de los tejidos gracias a su solubilidad en disolventes orgánicos como éter.

BIBLIOGRAFÍA

[1] Nelson, D. L., & amp; Cox, M. M. (2015). Lehninger: principios de bioquímica.

[2] Bohinski, R. (1991). Bioquímica. 5o ed. ED.

[3] Feduchi, E., Blasco, I., Romero, C., Yáñez, E. (2010). Bioquímica. Conceptos
esenciales. Editorial Panamericana. Madrid. 1a.

[4] Manrique, E. (2003) Los pigmentos fotosintéticos, algo más que la captación de luz para
la fotosíntesis. recuperado de ​https://www.redalyc.org/pdf/540/54012108.pdf

[5] Báez, J., (2007) Generadores de Colores Naturales: Carotenos y Xantofilas.

http://www.dcne.ugto.mx/Contenido/revista/numeros/7/A6.pdf
[6] Corzo, A., (2019) TÉCNICAS DE ANÁLISIS EN QUÍMICA ORGÁNICA
CROMATOGRAFÍA. UNSE. Facultad de Ciencias Forestales Recuperado de
https://fcf.unse.edu.ar/archivos/series-didacticas/SD-44-Cromatografia-CORZO.pdf

[7] Universidad Nacional Autónoma de México (2007) Técnicas Cromatográficas.

Recuperado de ​http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf

[8] ​Manrique, E. (2003). Los pigmentos fotosintéticos, algo más que la captación de luz para
la fotosíntesis. Ecosistemas, vol. XII, num. 1. Alicante, España. Disponible en:
https://www.redalyc.org/pdf/540/54012108.pdf

[9] Roca, P., Rodríguez, A. & Oliver, J. (2003). Bioquímica, técnicas y métodos.
Universidad de las Islas Baleares, Facultad de Ciencias. Editorial Hélice. Madrid, España.
Disponible en: ​http://www.ehu.eus/biofisica/juanma/mbb/pdf/bqtym.pdf

[10] Alvarado, C. (2006). Efecto de la radiación UV-B en la síntesis de pigmentos protectores

y fotosíntesis en plántulas de Aextoxicon punctatum.​ Universidad Austral de Chile, Facultad
de Ciencias. Valdivia, Chile. Disponible en:
http://bibliotecadigital.ciren.cl/bitstream/handle/123456789/10591/UACh_02.pdf?sequence=
1&isAllowed=y

[11] Héctor Ardisana, Eduardo & García, Antonio & Fosado, Osvaldo & Álava, Janner &
Sancán, Gema & León Aguilar, Rolando. (2018). Contenido de clorofilas totales en doce
clones de cacao (Theobroma cacao L.). La Técnica: Revista de las Agrociencias. ISSN
2477-8982. 10.33936/la_tecnica.v0i20.1324.

[12] EcologiaVerde. (2020). Qué es la CLOROFILA. Función, Tipos y más [Archivo de

video]. Recuperado de ​https://www.youtube.com/watch?v=_FWeNKQLLD8