Práctica #4 Pigmentos Fotosintéticos

Integrantes:
Juan Pablo Rincón (2022957)
Jean Carlos Trompeta (2027667)
María Paula León Polo (1931681)
Kevin Stiven Rincon Gaviri (2024354)

23 de Septiembre del 2021

Cali, Valle del Cauca
Biología (3140)
Laboratorio de Bioquímica
Resumen:

Los pigmentos fotosintéticos de las plantas que se encuentran situados en las hojas, estos
pigmentos reciben luz solar y la absorben, reflejando así un color distinto dependiendo el
pigmento que se encuentre en mayor cantidad y el estado de las hojas, los pigmentos pueden
ser clorofila a, clorofila b, carotenoides, ficocianina y ficoeritrina. Los colores reflejados
representan un rango de luz en el espectro visible lo cual es el tema principal de esta práctica,
cuyo objetivo es determinar en qué rango de onda (espectro de luz visible) se pueden situar
cada pigmento y su respectivo color reflejado, así como relacionar cada espectro de absorción
de luz visible con la función que cumplen cada uno de los pigmentos hallados.

Introducción:

La fotosíntesis es un proceso de anabolismo autótrofo. Constituye no sólo la forma de

nutrición del reino vegetal sino la base de la alimentación de todas las cadenas tróficas, Para
que se lleve a cabo la fotosíntesis se necesitan los siguientes elementos: Sol (energía solar),
gas carbónico (CO2) que entra por los estomas de las hojas, Clorofila, Agua y Sales
minerales (absorbidas por las raíces). La fotosíntesis se lleva a cabo en los cloroplastos donde
se encuentran los pigmentos capaces de captar y absorber la energía luminosa procedente del
sol. Estos pigmentos son: clorofila (verde), xantofila (amarillo) y carotenoides (anaranjados).
Los pigmentos clorofílicos son el pigmento biológico más abundante en la tierra y debe su
color verde a su capacidad de absorber las fracciones roja y azul de la luz solar, transmitiendo
los demás colores cuya mezcla apreciamos en diversos tonos de verde. Las hojas pueden
llegar a contener hasta 1 g de clorofila m2, aunque esta concentración es muy variable entre
especies y sobre todo depende, entre otros factores, del estado nutricional, la edad o la
historia lumínica previa de la planta. Los pigmentos clorofílicos son insolubles en el solvente
universal llamado agua. Pero sí son solubles en solventes orgánicos como por ejemplo
alcohol etílico y acetona. La separación de los pigmentos vegetales se utiliza la técnica de
cromatografía que consiste en un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención
selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo
identificar y determinar las cantidades de dichos componentes, obteniendo como resultado la
identificación de los pigmentos presentes en la muestra a utilizar.
El objetivo de esta práctica consiste en separar los pigmentos pertenecientes a las hojas de las
plantas mediante los procesos de cromatografía y espectrofotometría, la cromatografía nos
ayudará a separar los pigmentos en las hojas ya que el principio de esta es la retención
selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo
identificar y determinar las cantidades de dichos componentes para dar como resultado una
retención diferencial sobre la fase estacionaria y, por tanto, una separación efectiva en
función de los tiempos de retención de cada componente de la mezcla.
Materiales y métodos:

1. Cromatografía.

A cada grupo se le suministró 15 ml del extracto de pigmentos obtenido calentando hojas de

una planta verde en etanol del 96% hasta que quedaron blancas.

a) Con el capilar se colocó la muestra en el punto de origen en la tira de papel de filtro, con
gotas pequeñas y manteniendo el diámetro de la mancha alrededor de 5 mm. Lo aplicamos
varias veces hasta que quedó una mancha verde oscuro. No utilizar secador.

b) Se introdujo la tira de papel con la muestra en el tubo largo, en el que previamente se ha

puesto la mezcla de solventes para la cromatografía. Se tapó bien y se sostuvo en posición
vertical con la ayuda del soporte y la pinza-nuez.

c) Luego se dejó desarrollar el cromatograma en la oscuridad o con luz difusa por el tiempo
que fue necesario.

d) Al terminar, se sacó el cromatograma y se secó al aire en la oscuridad, durante algunos

minutos.

e) Se observó las posiciones relativas y los colores de cada componente. Se delineó su

perímetro con lápiz y se determinaron los Rfs. En esta sección se identificó cada una de las
manchas.

2. Separación de los pigmentos en medio líquido.

a) Se tomó 5 ml del extracto de pigmentos en 10 ml de éter de petróleo y se agitó bien.

b) Luego se tomó 5 ml de la parte superior de la suspensión resultante y se añadió 2.5 ml de

la solución de KOH al 10%. Se dejo reposar hasta que se separaron las capas de pigmentos
amarillos y verdes.

c) Se agregó agua destilada, de 1 en 1 ml agitando fuertemente cada vez, hasta agregar un

total de 7 ml. Se agitó bien y se dejó reposar por 15 minutos. De modo que aparecerán dos
capas: la superior, amarilla, contiene los carotenos y xantofilas y la inferior, verde, acuosa, las
clorofilas.
d) Se paso la capa con los pigmentos amarillos a otro tubo de ensayo. Fue medido el volumen
y se añade igual cantidad de éter de petróleo y de metanol. Se agitó bien y se dejó reposar por
varios minutos. Se deben separar dos capas: la superior, etérea, contiene los carotenos y la
inferior, alcohólica, contiene las xantofilas.
e) Finalmente se realizó el espectro de absorción de luz visible de los pigmentos separados,
utilizando intervalos de 20 nm, desde 400 hasta 700 nm, tanto para los carotenoides como
para las clorofilas.

3. Observación a través del espectroscopio.

Se observó parte del extracto original a través del espectroscopio. Para ello fue necesario
observar las longitudes de onda (colores) ausentes en el espectro. Finalmente se comparó
esta observación con los espectros obtenidos en el punto anterior.

Resultados:

1. Cromatografía de los pigmentos.

Figura 1. Resultado cromatografía.

En la Figura 1 se observó que cada pigmento se separó de acuerdo a la afinidad del solvente
que se utilizó durante la cromatografía.
 Tabla 1. Rfs de los pigmentos obtenidos mediante la cromatografía

2. Separación de los pigmentos en medio líquido.

Tabla 2. Absorbancia de las clorofilas y carotenoides utilizando intervalos de 20 nm, desde
400 hasta 700 nm

Gráfica 1. Absorbancia de las clorofilas y carotenoides utilizando intervalos de 20 nm,

desde 400 hasta 700 nm
Se realizó una comparación de los pigmentos (Gráfica 1), donde las clorofilas y carotenoides
tienen un comportamiento a través de la luz visible una forma irregular.

3. Observación a través de un espectroscopio.

Figura 2. Arriba: Espectro de luz visible. Abajo: espectro de luz no absorbida por el
extracto vegetal.

En la observación a través del espectroscopio se pudo observar en la Figura 2 que los

colores colores más claros como el verde, amarillo y naranja no fueron absorbidos por el
extracto vegetal que se utilizó.
 Figura 3. Efecto de la iluminación de los pigmentos (A) desde la parte trasera
(B) desde la parte frontal.

Con la prueba de fluorescencia se pudo observar en la Figura 3 que el pigmento verde al ser
sometido a iluminación blanca torna un color rojo vino.

Discusiones:

1. Cromatografía de los pigmentos.

Las moléculas de clorofila están compuestas por un átomo central de Mg, un anillo de
porfirina y un alcohol insaturado llamado fitol. Ambas estructuras sólo se difieren en el
sustituyente del carbono C-3. Mientras que la clorofila a, posee un grupo metilo (-CH3), la b
dispone de un grupo aldehído (-CHO). Esta diferencia además de producir cambios en la
coloración, verde azulado para la clorofila a y verde amarillento para la b, también produce
una mayor polaridad en esta última con respecto a la primera. Este contexto se puede
evidenciar en los resultados, observando así como la clorofila b, siendo más polar que la
clorofila a, absorbe con mayor intensidad, presentando en consecuencia un factor de retardo
(Rf) menor. [1]
Los carotenos a diferencia de la clorofila a y b, son hidrocarburos, y aunque la
deslocalización de los electrones pi de sus estructuras le otorguen una mayor preponderancia
de fuerzas tipo de van der Waals, no son lo suficiente fuertes para interactuar con la estructura
del papel, por lo que quedan disueltos en la fase móvil y arrastrado por ella, presentando en
consecuencia, un factor de retardo mayor.
 2. Separación de pigmentos en medio líquido.

Los pigmentos clorofílicos son insolubles en agua. Pero sí son solubles en solventes
orgánicos como por ejemplo alcohol etílico y acetona. A los solventes que extraen
simultáneamente todos los pigmentos de la hoja se los suele llamar extractantes. Existen otros
solventes que presentan afinidad por algunos pigmentos y se los llama separadores, como por
ejemplo el tetracloruro de carbono y el éter de petróleo. En la práctica aparecieron varias
bandas de diferentes colores que estuvieron más o menos alejados de la disolución del éter de
petróleo según la mayor o menor solubilidad de los pigmentos en dicha disolución. Estas
bandas tenían diferente grosor, dependiendo de la abundancia del pigmento en la disolución.
Las que tenían más afinidad por el disolvente bajaban más rápido que los otros pigmentos.
[2]

3. Observación a través de un espectroscopio.

El rango que se evidenció al momento de observar los pigmentos fotosintéticos por medio del
espectroscopio muestra ausencia de color en las longitudes de onda que no forman parte de la
luz emitida por los muestras, en este caso se habla de los pigmentos fotosintéticos. Esto tiene
sentido al compararse con el espectro de luz absorbida por tales pigmentos, pues al empatarse
se complementan, debido a que cuando la luz blanca impacta la materia, las longitudes de
onda que no son absorbidas se reflejan, de esta forma el espectro continuo observado en la
Figura 2 corresponde a las longitudes de onda reflectadas por los pigmentos, y las bandas
negras la presencia de un elemento particular que forma estos pigmentos, los cuales son
perceptibles al descomponer el espectro lumínico (Peris, 1973). [3]

Conclusiones:

- Teniendo en cuenta la absorbancia, podemos concluir que los carotenos se encargan

en las plantas de absorber la luz que corresponde a 440 nm - 500 nm es decir la luz
ultravioleta, violeta y azul.
- De igual manera se observó la absorbancia de 0,02 de los carotenos, cuando se somete
a 700 nm, podemos concluir que los carotenos en su mayoría presentan colores entre
naranja y rojos.
- Gracias a esta práctica, se logró observar como cambian las tonalidades de estos
pigmentos fotosintéticos que componen las plantas y se encuentran en los cloroplastos
de la célula vegetal y les dan color al reflejar o transmitir la luz visible, además de que
son los que constituyen el sustrato fisicoquímico de la fotosíntesis.
- Se concluye que la clorofila tiene su mayor absorbancia en un rango de 400 a 440 nm
y entre 620 y 660 nm absorbiendo la gama de colores entre ultra violeta -azul, y entre
amarillo-anaranjado, dando asi el reflejo de color verde que tiñe la mayoria de las
hojas en las plantas.
Referencias:

[1] MANCILLA, C. G. E.; CASTREJÓN, C. R.; ROSAS, T. M; BLANCO, E. Z. y PÉREZ,

S. L. J. EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE PIGMENTOS VEGETALES, 2009,
Universidad del Valle de México, Campus Chapultepec.

[2] Favio Daniel Torossi Baudino, 2007, Una experiencia sencilla con fundamentos
complejos: la separación de pigmentos fotosintéticos mediante cromatografía sobre papel.
Real sociedad española de química.

[3] Peris, A. 1973. Curso de introducción a las ciencias físicas: nivel intermedio. (1 st ed).
Editorial reverté S.A: Barcelona ; pp 178.