EXTRACCIN DE CLOROFILA Y SU SEPARACIN CROMATOGRFICA INTRODUCCION

La fotosntesis es una de las funciones biolgicas fundamentales. Por medio de la clorofila contenida en los cloroplastos, los vegetales verdes son capaces de absorber la energa que la luz solar emite como fotones y transformarla en energa qumica. Para que los sistemas vivientes utilicen la energa luminosa, primero deben absorberla. El pimento es toda sustancia que absorbe luz. Algunos pigmentos absorben todas las longitudes de onda luminosa y, por lo tanto, son negros. Algunos slo absorben ciertas longitudes de onda y transmiten o reflejan las longitudes que no absorben. La clorofila, pigmento que imparte el color verde a las hojas, absorbe luz en las longitudes de onda del violeta y el azul y tambin en el rojo, es verde porque refleja la luz verde. Los distintos pigmentos absorben energa luminosa de diferentes longitudes de onda. Los distintos grupos de planta y algas utilizan diversos pigmentos en la fotosntesis. Existen varios tipos de clorofila que varan un poco en cuanto a su estructura molecular. En las plantas, la clorofila a es el pigmento que interviene directamente en la transformacin de energa luminosa en energa qumica. La mayora de las clulas fotosintticas tambin contiene un segundo tipo de clorofila en las plantas es la clorofila b y un representante de otro grupo de pigmentos son los llamados carotenoides que pueden ser rojos, anaranjados o amarillos. Uno de los carotenoides de las plantas es el caroteno beta. Los colores distintivos de los bacterios fotosintticos se deben a los pigmentos que contienen. La clorofila de los tiobacterios verdes, clorobium, es qumicamente similar a la clorofila a. La clorofila de los bacterios purpreos difiere qumicamente en varios detalles de la clorofila a y es de color gris azulado plido. La clorofila de los dos grupos de bacterios es bacterioclorofila. El patrn de absorcin de un pigmento se conoce como espectro de absorcin de esa sustancia, este dispositivo enva un haz de luz de cada longitud de onda sobre el objeto que se analiza y registra el porcentaje de cada longitud de onda que absorbe la muestra de pigmento, en comparacin con un patrn de referencia.

OBJETIVO GENERAL Determinar que los cromforos componentes de los vegetales presentan un espectro de absorcin de luz muy especfico.

OBJETIVOS PARTICULARES Extraer los pigmentos de hojas de espinaca. Separar cada uno e los pigmentos mediante un cromatografa de adsorcin.

Determinar el espectro de absorcin de cada uno de los pigmentos separados por la cromatografa.

MATERIAL Y EQUIPO 1 Columna de vidrio de 15 m de altura por 1 cm de dimetro 1 Motero con pistilo 1 Embudo de vidrio 1 Embudo de separacin pequeo 1 Vaso de precipitado de 100 ml. 1 Vaso de precipitado de 50 ml 1 pipeta graduada de 5 ml 1 Pipeta Pasteur con bulbo 1 Soporte universal con anillo 1 Pinza para bureta 1 Parrilla elctrica 1 Cristalizador Fibra de virio Hielo Espectrofotmetro y celdas Tubo de hule 100 g de hojas de espinaca fresas

Gasas de algodn 50g de azcar de repostera o azcar de mesa finamente molida 10g de azcar granulada Reactivos Etanol ter dietlico ter de petrleo Hexano Sulfato de sodio Metanol Soluciones Disolucin de ter-metanol-hexano (45:15:5 v/v) Disolucin de hexano-ter (2:3 v/v)

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL A. Extraccin de clorofila Se lavaron algunas hojas de espinaca y se les quit los peciolos y las venas grandes. Se pesaron 5 gr., de espinaca. Los 5 gr., de espinaca se maceraron con 10 ml de etanol en hielo. Se le agreg 10 ml de ter de petrleo. Se filtr el macerado usando una gasa. Al embutido se le agreg 10 ml de ter-metanol-hexano y 15 ml de agua.

Se agit suavemente y se dej reposar hasta que se formaron 2 fases. Se separ la fase acuosa y la orgnica se coloc en un vaso de precipitado de 50 ml. Se le agreg sulfato de sodio para eliminar restos de agua. Y sobre una parrilla elctrica con poco calor se concentr el extracto hasta tener 1 ml de volumen.

B. Separacin Cromatogrfica A la columna de vidrio limpia y seca se le coloc un tapn de fibra de vidrio en la parte inferior sin quedar muy compacto. Se pesaron 20 gr., de azcar glass y 10 gr., de azcar granulada. Se llen la columna con el azcar de manera que no quedaran huecos ni fracturas. Se le agreg a la columna el extracto de clorofila (1ml) e inmediatamente la solucin hexano-ter, sin dejar de secar. Y as se fue agregando hasta que se obtuvieron diferentes colores. En tubos de ensayo se colocaron las fracciones coloridas.

C. Espectros de absorcin Se determin el espectro de absorcin de cada fraccin obtenido, leyndolos desde 350 nm hasta 800 nm, cambiando cada 50 nm.

ANALISIS DE RESULTADOS 1. Qu tan difcil fue la extraccin de los pigmentos? R=Solo result un poco lenta la extraccin de las fracciones coloreadas 2. La separacin de los pigmentos se realiz como se esperaba? R= Solo dos de ellas, el pigmento verde y el pigmento verde claro el amarillo no sali del color esperado, fue de un color demasiado claro blanco-amarillo. 3. Cuntas bandas coloridas se obtienen del extracto de espinaca? R= Tres: verde, amarilla y verde claro 4. La bibliografa cuntas bandas menciona? Si no se obtuvieron las mismas a qu pudo deberse?

R= Menciona de tres a cuatro las cuales corresponden a la clorofila a, clorofila b, carotenos y xantofilas. 5. Cul es el pico mximo de absorcin de cada pigmento? Corresponden a los reportados en la literatura? R=Pigmento verde 2.704 - 400nm Pigmento amarillo 0.059 450nm Pigmento verde claro 0.325 450nm El pico de absorcin es entre 400 y 500 nm de tal manera que si correspondieron a los de la literatura DISCUSIN A comparacin con la teora en la prctica no es tan fcil poder observar los diferentes tipos de pigmentos que se encuentran en las plantas con tan solo ver rpidamente una planta. Durante este largo proceso la planta pasa por mltiples procesos que acilitan la obtencin de pigmentos varios. Un factor que ayuda en la obtencin de pigmentos es la densidad de cada uno y con ayuda de la gravedad y un filtro tendremos unos pigmentos fluyendo ms rpido que otros permitiendo su recoleccin y as su estudio, pero no se debe de olvidar que el tiempo es un factor importante, ya que la filtracin por medio de la columna no es algo rpido.

CONCLUSN Con esta prctica se aprendi a realizar la separacin de los pigmentos de espinaca mediante la cromatografa de absorcin y se observ que en los mximos de absorcin se debi a la presencia de cromforos en las molculas.

CUESTIONARIO 1. Qu es la fotosntesis? R: Es el proceso por el que los organismos fotosintticos (plantas, algas y algunas bacterias) convierten la energa radiante de la luz en energa metablica y poder reductor. Las reacciones caractersticas de la fotosntesis son realizadas por una clase de molculas llamadas clorofilas. 2. Qu es la clorofila y como interviene en la fotosntesis?

R: Es el pigmento fotosinttico de los vegetales que imparte el color verde a las hojas, absorbe luz en las longitudes de onda del violeta y el azul y tambin en el rojo, es verde porque refleja la luz verde. 3. Cuntas clases de clorofila se conocen? R: Hay cinco tipos de clorofilas: a, b, c, d y e. La clorofila a, se encuentra en todas las algas, y todos los organismos fotosintticos diferentes de las bateras. La clorofila b, en los Euglenopycophyta, en los Chlorophycophyta, as como en otras divisiones de las algas. La clorofila c, est ms ampliamente difundida; se la observa en miembros de las Bacilliariophycophyta, Chrysophycophyta, Pyrrophycophyta, Crytophycophyta y Phaephycophyta. La clorofila d, parece existir en los Rhodophycophyta. La clorofila e, es rara y se la ha encontrado en slo dos gneros de Xanthophycophyta, llamados Triboneara, y en las zoosporas de Vaucheria. 4. Existen otros pigmentos que absorben la luz solar? R: A parte de la clorofila estn los carotenoides, bacterioclorofila y biloprotenas tambin llamadas ficobilinas. Hay dos clases de carotenoides: los carotenos y las xantofilas, los primeros son hidrocarbonos lineales no saturados y las xantfilas son derivados oxigenados de stos. Bacterioclorofila: Las bacterias fotosintticas poseen este tipo de clorofila, absorben la luz en las proximidades de la regin infrarroja 66 a 870 nm. No estn contenidas en cloroplastos sino extendidas en sistemas membranosos. Las biloprotenas son pigmentos solubles en agua, mientras que las clorofilas y carotenoides son solubles en lpidos y se les encuentra en solo tres divisiones de las algas: Cyanophycophyta, Rhodophycophyta y Cryptophycophyta. Hay dos clases: ficocianina y ficoeritrina. La proporcin entre una y otra clase de pigmentos vara considerablemente al cambiar las condiciones del medio. 5. Cul es el fundamento de la cromatografa en columna? R: Es una tcnica de separacin de solutos basada en el establecimiento de un equilibrio, por absorcin entre un slido como fase estacionario y un lquido como fase mvil. La columna cromatogrfica que contiene el absorbente puede ser de vidrio o de nylon. Es pasar mediante gravedad la fase lquida sobre el slido retenido en una columna recta, y recogida del eluido en fracciones.

6. Cuntos tipos de cromatografa se conocen? R: 1) Cromatografa en papel: Se aplica en la separacin de aminocidos. Las muestras se aplican en un punto marcado aproximadamente a 5 cm del extremo de una tira de papel filtro y esta se suspende en un recipiente sellado que contiene el solvente cromatogrfico. 2) Cromatografa en capa fina: Hay dos clases: de particin y de absorcin. La de particin es muy parecida a la separacin cromatogrfica en papel y la de absorcin se aplica a los materiales no polares como lpidos y por lo tanto no es til para aminocidos . 3)Cromatografa automatizada de intercambio inico: Se usa para el anlisis de los residuos de aminocidos despus de la hidrlisis de un polipptido. 4)Cromatografa por afinidad: La caracterstica sobresaliente de esta tcnica de purificacin es su capacidad para remover selectivamente de una mezcla protenica compleja a una protena particular o cuando mas a un pequeo numero de protenas particulares. 5)Cromatografa de gas lquido: Implica la separacin fsica de una fase gaseosa en movimiento adsorbida sobre una fase estacionaria, consistente de un slido inerte, como el gel de slice o los grnulos inertes de arcilla refractaria cubiertos con un lquido no voltil. 5) Cromatografia inversa en fase lquida con alta presin: Una utilsima tcnica para la purificacin de los pptidos no polares de peso molecular elevado es la cromatografa con liquidos a alta presin sobre materiales no polares con la elucin con solventes no polares. 7. Cul es el espectro de la luz visible? R: Es la pequea parte del espectro completo a la que es visible al ojo humano. 8. Qu es un espectro de absorcin? R: El patrn de absorcin de un pigmento se conoce como espectro de absorcin de esa sustancia. El espectro de absorcin de un pigmento se mide con el espectrofotmetro. Este dispositivo enva un haz de luz de cada longitud de onda sobre el objeto que se analiza y registra el porcentaje de cada longitud de onda que absorbe la muestra de pigmento, en comparacin con un patrn de referencia.

BIBLIOGRAFIA

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