INFORME N° 1: OBTENCIÓN Y RECONOCIMIENTO DE PIGMENTOS

Los pigmentos vegetales se encuentran en el interior de la células vegetales en un organelo llamado

cloroplastos, estos son plástidos que contienen pigmentos clorofílicos, los cuales son moléculas químicas que
reflejan o transmiten la luz visible. , El color de un pigmento depende de la absorción selectiva de ciertas
longitudes de onda de la luz y de la reflexión de otras, ademas se tiene que tener en cuenta que en la practica
se utilizó la hoja de espinaca y en su estructura de la clorifila esta permite que haya una Asociados con las
clorofilas, existen también dos clases de pigmentos las xantofilas y carotenos.
Hay diversas clases de pigmentos:
• Principales:
• Clorofilas (a, b, c, d y bacterioclorofilas) de coloración verde.
• Accesorios:
• Carotenoides (carotenos y xantofilas) de coloración amarilla y roja.
• Ficobilinas de coloración azul y roja presentes en las algas verdeazuladas, que comprenden el filo de los
Cianofitos.
La Clorofila, es el pigmento que da el color verde a los vegetales y que se encarga de absorber la luz necesaria
para realizar la fotosíntesis. La clorofila absorbe sobre todo la luz roja, violeta y azul, y refleja la verde.
Las clorofilas presentan una estructura molecular compuestas por una porfirina que lleva incorporado un átomo
de magnesio en el centro del núcleo del anillo tetrapirrólico. El ion Mg2 está coordinado con los cuatro átomos
de nitrógeno centrales, lo que hace de la clorofila un complejo extraordinariamente estable.
Del anillo parte una larga cadena de 20 átomos de carbono denominada fitol, que constituye el punto de anclaje
de la molécula de clorofila a la membrana interna del cloroplasto, el orgánulo celular donde tiene lugar la
fotosíntesis. El fitol, que es un alcohol de 20 átomos de carbono. Cabeza y cola se unen a través de un enlace
éster en el que intervienen el grupo alcohólico del fitol y el grupo carboxilo de un ácido propiónico que está unido
al anillo IV del núcleo tetrapirrólico. La clorofila puede hidrolizarse en el enlace éster que mantiene unido el grupo
fitol, en donde por medio de la hidrolisis ese grupo ester se vuleve un carboxilato, que son sales afines al agua. (NO
SE QUE TIPO DE SALES SEAN , PERO ES A GRANDES RASGOS LO QUE PASA Y EN LA IMAGEN ESTA YA COMO LO
QUE PASA). Esta hidrólisis está catalizada por el enzima clorofilasa, presente en los vegetales verdes. La estructura
que queda al eliminarse el fitol recibe el nombre de clorofilida. Su color es semejante al de la clorofila, e incluso
son algo más estables que las propias clorofilas frente a la pérdida del magnesio.
Existen varios tipos de clorofilas, las más importantes de las cuales son la "a", y la "b". La clorofila a (verde azulada)
tiene un grupo -CH3 en el anillo II mientras que la clorofila b (verde amarillenta) tiene un grupo -CHO en esa
misma posición. Los diversos tipos de clorofilas existentes, se diferencian en pequeños detalles de su estructura
molecular y que absorben longitudes de onda luminosas algo distinto.
PUEDE SER OPCIONAL ESTE PARRAFO!!
Cuando la molécula de clorofila absorbe un fotón, sus electrones se excitan elevándose a un nivel de energía
superior. Esto es el punto de partida en el cloroplasto de una secuencia compleja de reacciones químicas que
dan lugar al almacenamiento de energía en forma de enlaces químicos. Además, Las clorofilas actúan como
catalizadores, es decir, como sustancias que aceleran o facilitan las reacciones químicas, pero que no se agotan
en las mismas. Entre los carotenoides hay también muchos catalizadores e intervienen como pigmentos
accesorios en la fotosíntesis, transfieren a la clorofila la energía de la luz que absorben para su conversión en
energía química.

Los pigmentos clorofílicos son insolubles en el solvente universal llamado agua. Pero sí son solubles (afinidad
química) en solventes orgánicos. A los solventes que extraen simultáneamente todos los pigmentos de la hoja se
los suele llamar extractantes. Existen otros solventes que presentan afinidad por algunos pigmentos y se los llama
separadores. En la se utilizó como extractante el (ETANOL) y como separador el éter de petróleo. Estos dos
solventes orgánicos responden en forma diferente a los pigmentos clorofílicos, como así también a sus diferencias
físicas que hacen que sean dos líquidos no miscibles y con diferente peso específico.

La IUPAC define a la cromatografía, como un método físico de separación mediante el cual los componentes de
una mezcla se separan por distribución de dos fases: una estacionaria y otra móvil. El proceso de separación de
la práctica se hizo teniendo en cuenta la estructura química de hojas de espinaca, y que a su vez, se debe tener
en cuenta que los pigmentos clorofílicos son insolubles en agua, pero sí son solubles (afinidad química) en
solventes orgánicos. Para la fase estacionaria se utilizó gel de sílice y para la fase móvil se empleó 2 ml de hexano
con 1 ml de acetato de etilo. Cada sustancia es el resultado de un equilibrio entre dos conjuntos de fuerzas
contrapuestas: las de propulsión, promovidas por el flujo de la fase móvil y las fuerzas de retención, originadas
por la fase estacionaria. De este modo, cada sustancia migra de manera diferencial, conforme a sus propias
características físicas y al tipo de fuerzas intermoleculares entre ambas.

La fase móvil consistió en la mezcla de 2 ml de hexano y 1 ml de acetato de etilo los cuales tienen en común la
característica de ser apolares. En la a fase estacionaria se utilizó gel de sílice, siendo este el que actúa como el
sólido poroso ya que esta propiedad les confería un elevado cociente área superficial/volumen, con lo cual su
interacción con la fase móvil sería mayor. Esto porque la sílice, cuando se encuentra seco, contiene alrededor
de un 5% de agua, así se forman finísimas capas de moléculas de agua en su superficie, las cuales se unen a los
grupos hidroxilo libres de la clorofila, constituyendo la fase que adsorbe los solutos.

La razón por la que se utilizó la mezcla de disolventes apolares (hexano y acetato de etilo) con una pequeña
porción polar como eluyente se debe a que los pigmentos de la clorofila de la espinaca están conformados por
compuestos con una baja polaridad, los cuales se retienen poco en la fase estacionaria. Por tanto, el eluyente
no sólo actúa como fuerza propulsora sino que, además, su propia estructura química contribuye a que los
pigmentos puedan separarse mediante sucesivos equilibrios de adsorción-desorción. Si el mismo sólo estuviese
constituido por un disolvente no polar, las clorofilas no se podrían separar ya que ambas cuentan con una
estructura química similar.

De esta manera, las moléculas del soluto se absorben en la fase estacionaria, y a medida que se produce la
elución, van siendo desplazadas por las moléculas de disolvente de la fase móvil. La retención del soluto se
debe a la competencia que se establece entre la fase móvil y éste, la cual radica en la polaridad de ambos.
Entonces, los componentes del soluto más polares se retienen más rápido que aquellos con una menor
polaridad.
ESTO TAMBIEN PUEDE IR EN UN ESQUEMA, PERO SI VAA DENTROO DE LOS ANALISIS O SINO COPIALO ASÍ
A los 5 gramos de espinacas previamente lavadas se les realizó una extracción con etanol, que siendo un solvente
extractante, permite retirar todos los pigmentos en una solución etanólica y dejar por medio de una filtración los sólidos
restantes para posterior a ello trabajar con el etanol y el extracto.
A la solución etanólica junto con los pigmentos extraídos se le adicionan éter de petróleo, esto debido a que algunos
carotenos y clorofilas son solubles en este y hace que por quedan disueltos, además también se agita y se separa la fase
inferior que contenía etanol y agua por diferencia de polaridades. Se realiza un lavado con agua para su purificación, a la
capa superior se adiciona alcohol metílico las xantofilas dihidroxilados quedan en la fase metanólica, que se encuentra en
la capa inferior y se procede a decantar.
La presencia de grupos OH en las xantofilas dihidroxiladas le confiere cierta polaridad que la hace afín al metanol, por lo
que estas se separan con el metanol de la solución de éter de petróleo, estas fases se separan pos sus diferencias de
densidad. A la capa metanólica previamente extraída se le adicionó éter etílico por lo que al llevar a cabo la separación se
separa en la capa del éter las xantofilas monohidroxilados.
Esta separación depende de una mínima diferencia existente en las polaridades de los pigmentos.
Posteriormente se tomó la capa superior de éter de petróleo con el fin de separar la clorofila y sus pigmentos por medio
de una saponificación, que es aquella reacción que tiene lugar entre un ácido graso o un portador de ester y una base,
obteniéndose como producto una sal del respectivo ácido de la clorofila, en la estructura de la clorofila A se encuentra
en una parte llamada Fitol que funciona como ácido graso y reacciona con la base en este caso KOH en metanol, esta
reacción genera un precipitado blanco en el que se encuentra la clorofila A y arriba de este está una solución amarilla
que corresponde a los carotenos. Cambiando el solvente, médiate la adición de pequeñas porciones de agua, se somete
nuevamente un proceso de saponificación dando como resultado sales de la clorofila B por solución metanólica de KOH
formando una capa verde clara correspondiente a la clorofila B.
Es decir, los resultados que se otuvieron fueron:
La muestra a analizar se deposita cerca de un extremo de una lámina de plástico o aluminio que previamente
ha sido recubierta de una fina capa de adsorbente (fase estacionaria). A medida que la mezcla de disolventes
asciende por capilaridad a través del adsorbente, se produce un reparto diferencial de los productos presentes
en la muestra entre el disolvente y el adsorbente, y es el mismo comportamiento que presenta en la
cromatografia tanto de capa fina como en columna, ya que se trabajó con la misma sustancia, por tal razón los
pigmentos y su extracción va ser la misma.

De esta manera, las moléculas del soluto se absorben en la fase estacionaria, y a medida que se produce la
elución, van siendo desplazadas por las moléculas de disolvente de la fase móvil. La retención del soluto se
debe a la competencia que se establece entre la fase móvil y éste, la cual radica en la polaridad de ambos.
Entonces, los componentes del soluto más polares se retienen más rápido que aquellos con una menor
polaridad, es decir, primero obtenemos lo más apolar, lo que es menos a fin con la sílice y será más afín al
disolvente, que son los carotenos y luego las xantofilas que son más polares.

Esta polaridad radica en la estructura química de la espinaca, ya que los carotenos que posee son hidrocarburos
isoprenoides que no contienen oxígeno y están formados por largas moléculas con un sistema de enlaces
conjugados alternantes, dobles y sencillos, rematados en cada extremo por un anillo de ciclohexano insaturado-
tienen color amarillo-anaranjado, lo que le da carácter apolar y las xantofilas tienen una estructura muy similar
a la de los carotenos y su diferencia estriba en la incorporación de oxígeno en los extremos de la molécula, le da
cierto carácter polar. Son de color amarillo.
Sumando a lo anterior, es importante realizar el cálculo de la contante RF (Ratio of Front) que ayuda a dar una
idea de la posición de los compuestos y además de eso mide la retención o la afinidad de estos, siendo así en
este caso, entre mayor sea el RF menor va a ser la polaridad del compuesto.

Para la fase metanólica 1 se observa la separación de dos compuestos uno color amarillo naranja característico
de los carotenos y otro amarillo característico de las xantofilas en que este caso se trata de las
monohidroxiladas, los carotenos recorrieron una mayor distancia por que son los menos polares (apolares), por
lo que tiene una mayor afinidad con la fase móvil y esto se ve reflejado en la placa de cromtografia de placa fina
ya que el punto C representa la muestra de carotenoides y se ve como su distancia recorrida es la más grande y
se comprueba con el valor de retención que es de 0,96, y esto quiere decir que entre más cercano a uno más
apolar es y tiene mayor afinidad con la fase móvil.

Para la fase metanólica 2 se observó la presencia de solo un compuesto de color amarillo, ya que acá se
encuentran las Xantofilas dihidroxiladas. Las xantofilas al presentar incorporación de oxígeno en los extremos
de la molécula, esto le un carácter polar. Por lo que esta va a tener mayor polaridad, es decir tiene menor
afinidad con la fase móvil y por ello se queda en la fase estacionaria primero que todos los otros pigmentos, su
recorrido es corto aunque se hayan obtenido dos puntos A y B estos están muy cerca entre sí, por lo que se
puede decir que presentan propiedades similares con carácter polar, y esto se ve reflejado con el valor de
retención para A de o.30 y B 0.39 dando a entender que entre más cercano a cero más polar es y tiene menor
afinidad con la fase móvil.
En cuanto a cromatografía de columna el comportamiento es exactamente el mismo, sin embargo para poder
lograr una mejor separación entre las diferentes manchas se necesita una columna más larga, que también la
fase móvil fuese menos polar y eso haría que la distribución de los puntos no estuviesen tan unidos sino
estuviesen mejor distribuidos. Para el análisis de la muestra se tomaron 6 muestras de los 25 tubos, en donde
se pueden observar que: en el tubo 4 se obtuvo cinco manchas con afinidad más apolar comprobándolo con
los valores de retención que son mayores a uno, dando predominancia al carácter apolar pero a medida que
aumentan los tubos sucesivamente lo que se va a obtener o espera que salga es cada vez es más polar, lo que
es más afín a la sílice y menos a fin al disolvente, por ejemplo en el tubo 8 ya se empieza a notar este cambio
al obtener solo dos manchas que están más abajo con respecto al tubo 4, 5 y 7. Y finamente en los tubos 10 y
13 no se observan manchas, esto se puede explicar porque en la luz visible no se alcanza a observar los
componentes, ya que posiblemente si hayan manchas pero a la luz visible no la podemos ver, para esto se
podría utilizar la espectrometría Uv visible y allí de las señales características de los compuestos.

ESTO PUEDE IR EN LA SECCION EXPERIMENTAL COMO EN UN CUADRO O COPIADO ASI TA CUAL… AUNQUE TAMBUEN
PODRIAS DEJAR COMO IDEAS EN LOS ANALISIS
Para la separación de los pigmentos presentes en las hojas de espinaca se utilizó como método de separación la
cromatografía en capa fina y cromatografía en columna, estas son técnicas analíticas rápidas y sencillas, que
permiten:
‐ Determinar el grado de pureza de un compuesto. Se puede determinar así, por ejemplo, la efectividad de
una etapa de purificación.
‐ Comparar muestras. Si dos muestras corren igual en placa podrían ser idénticas. Si, por el contrario, corren
distinto entonces no son la misma sustancia.
‐ Realizar el seguimiento de una reacción. Es posible estudiar cómo desaparecen los reactivos y
cómo aparecen los productos finales o, lo que es lo mismo, saber cuándo la reacción ha acabado.
Todas las técnicas cromatografías dependen de la distribución de los componentes de la mezcla entre dos fases
inmiscibles: una fase móvil, llamada también activa, que transporta las sustancias que se separan y que
progresa en relación con la otra, denominada fase estacionaria. La fase móvil es líquida y la fase estacionaria
consiste en un sólido. La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que
la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares.
Polaridad de los compuestos orgánicos en orden creciente:

hidrocarburos < olefinas < flúor < cloro < nitro < aldehído < ester < alcohol < cetonas < aminas < ácidos < amidas.

La cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros métodos cromatográficos (en
columna, en papel, en fase gaseosa) ya que el utillaje que precisa es más simple. El tiempo que se necesita para
conseguir las separaciones es mucho menor y la separación es generalmente mejor. Pueden usarse reveladores
corrosivos, que sobre papel destruirían el cromatograma. El método es simple y los resultados son fácilmente
reproducibles, lo que hace que sea un método adecuado para fines analíticos. Al realizar la elección del
adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño de las partículas del adsorbente, cuanto más finamente dividido
esté mayor será su adhesión al soporte, aunque también se le puede añadir un adherente.
En la elección del eluyente influyen varios factores:
 Precio.  Pureza.  No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad).  No utilizar
compuestos muy volátiles.  Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).
La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que estudiar la polaridad del componente y probar
con eluyentes cada vez menos polares.
Factores que influyen en una separación por cromatografía.
a) Temperatura: a menor temperatura las sustancias se adsorben más en la fase estacionaria.
b) La cromatografía debe llevarse a cabo en un área sin corrientes de aire. c) Limpieza de las placas. Muchas
placas están contaminadas con grasa o agentes plastificantes o adhesivos. Para el trabajo a pequeña escala,
éstas deben limpiarse corriendo primero una mezcla de cloroformo y metanol y después dejar secar
completamente antes de aplicar la muestra.
d) Pureza de los disolventes.