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Un método para la determinación de alto rendimiento de recuentos de células bacterianas viables en placas de 96 pocillos

Artículo en BMC Microbiology · Noviembre de 2012

DOI: 10.1186 / 1471-2180-12-259 · Fuente: PubMed

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4 autores , incluso:

Ronen Hazan Damien Maura

Universidad Hebrea de Jerusalén Hospital General de Massachusetts

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Laurence G Rahme

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ARTÍCULO DE METODOLOGÍA Acceso abierto

Un método para la determinación de alto rendimiento de recuentos de

células bacterianas viables en placas de 96 pocillos
Ronen Hazan 1,2,3,4 †, Yok-Ai Que 1,2,3 †, Damien Maura 1,2,3 y Laurence G Rahme 1,2,3 *

Abstracto

Antecedentes: Existen varios métodos para cuantificar las células bacterianas, cada uno con sus ventajas y desventajas. El método más común es la
siembra en placa bacteriana, que tiene la ventaja de permitir la evaluación de células vivas mediante recuentos de unidades formadoras de colonias (UFC),
pero no es adecuado para el cribado de alto rendimiento (HTS). Por otro lado, la espectrofotometría es adaptable a las aplicaciones de HTS pero no
diferencia entre bacterias vivas y muertas y tiene baja sensibilidad.

Resultados: Aquí, presentamos un método de recuento de células bacterianas denominado Start Growth Time (SGT) que permite la cuantificación rápida y en serie del
número absoluto o relativo de células vivas en un cultivo bacteriano de una manera de alto rendimiento. Combinamos la metodología de cálculos cuantitativos de la
reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) con un método cualitativo previamente descrito de determinación del crecimiento bacteriano para desarrollar un método
cuantitativo mejorado. Mostramos que SGT solo detecta bacterias vivas y es lo suficientemente sensible para diferenciar entre 40 y 400 células / mL. La SGT se basa en
el tiempo de re-crecimiento requerido por un cultivo celular en crecimiento para alcanzar un umbral, y la noción de que este tiempo es proporcional al número de células
en el inóculo inicial. Mostramos varias aplicaciones de SGT, incluida la evaluación de los efectos de los antibióticos sobre la viabilidad celular y la determinación de una
fracción de subpoblación tolerante a los antibióticos dentro de una población celular. Los resultados de SGT no difieren significativamente de los resultados obtenidos por
los recuentos de CFU.

Conclusión: SGT es un método relativamente rápido, altamente sensible, reproducible y no laborioso que se puede utilizar en entornos de HTS para evaluar

longitudinalmente células vivas en cultivos de células bacterianas.

Palabras clave: Recuento de bacterias, CFU, persistentes, alto rendimiento, pantalla

Antecedentes
La determinación del número de células bacterianas es uno de los
procedimientos más fundamentales en microbiología. Se utilizan comúnmente
varios métodos, cada uno con sus pros y sus contras característicos (Tabla 1). El
método estándar de oro ampliamente utilizado es el recuento de unidades
formadoras de colonias (UFC) en placas [1]. El método CFU tiene dos ventajas
notables, a saber, la capacidad de conteo de cualquier cantidad de bacterias
usando diluciones, si son demasiadas, o concentraciones, si son muy pocas. En
segundo lugar, con este método solo se cuentan las bacterias viables, ya que el
método CFU excluye las bacterias muertas y los desechos. La desventaja más
importante del
* Correspondencia: rahme@molbio.mgh.harvard.edu
† Contribuyentes iguales
1 Departamento de Cirugía, Escuela de Medicina de Harvard y Hospital General de Massachusetts, Boston, MA
02114, EE. UU.
2 Departamento de Microbiología e Inmunobiología, Escuela de Medicina de Harvard, Boston, MA 02114, EE.
El método CFU consiste en que los grupos de células bacterianas pueden contarse
incorrectamente como colonias individuales; de hecho, la posibilidad de contar grumos
como unidades individuales es la razón por la que los resultados se informan como
UFC / ml en lugar de bacterias / ml. Además, los resultados de CFU generalmente se
obtienen después de 1 - 3 d, lo que hace que el método no sea adecuado para estudios
longitudinales seriados. Y dado que el método CFU también consume mucho tiempo y
es bastante tedioso, tiene limitaciones para los estudios de detección de alto
rendimiento (HTS).
El otro método común utilizado para estimar la carga bacteriana es la lectura
de la densidad óptica (DO) a 600 nm. El método de DO se puede realizar
automáticamente de una manera de alto rendimiento utilizando un lector de
placas de microtitulación y es muy adecuado para experimentos que requieren
un análisis continuo de la curva de crecimiento. Sin embargo, este método no
distingue las bacterias vivas de las bacterias muertas o incluso las partículas.
Además, su sensibilidad suele limitarse a concentraciones entre 10 8 y 10 10 bacterias

/ mL.
UU.
La lista completa de información del autor está disponible al final del artículo.

© 2012 Hazan et al .; licenciatario BioMed Central Ltd. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia de atribución Creative Commons
(http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio. siempre que la obra original esté
debidamente citada.
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Tabla 1 Métodos de cuantificación de bacterias

Método Gama de Hora de Distingue Persistentes Aplicaciones Equipo Contar afectados

detección obtener resultados vivo contra muerto incluido en necesario por menor
cuantificación grumos bacterianos

Recuento de UFC Ilimitado Dias si si Determinación de Ninguna si

bacteriano absoluto
número

Absorbancia 10 8 - 10 10 Inmediato No No Seguir el crecimiento Espectrofotómetro No

bacterias / mL curvas o lector de placas

Microscopía Ilimitado Minutos Si, con tinción No Determinación de Microscopio No

bacteriano absoluto
número

Citometría de flujo > ~ 5000 Minutos Si, con tinción Si, si no Determinación de FACS si
por debajo de la detección bacteriano absoluto
número

MBRT [ 2 ] > ~ 10 7 Horas si No (metabólicamente MIC y MAC Espectrofotómetro No

células inactivas perdidas) determinación

SGT Ilimitado Horas si si HTS, persistir Lector de placas No

Cuantificación

Se han descrito varios otros métodos, aunque menos comunes, para estimar
la estimación de la concentración bacteriana, incluida la citometría de flujo [3] y
el recuento microscópico. Estos métodos son sensibles y precisos, y los
investigadores pueden distinguir entre bacterias vivas y muertas cuando se
emplean los tintes adecuados. Sin embargo, ambos no son adecuados para los
estudios de HTS porque consumen mucho tiempo y son bastante tediosos. El
número de bacterias también se puede estimar basándose en diversas
características metabólicas, como la prueba de reducción de colorante azul de
metileno (MBRT) en la que se registra la reducción del azul de metileno a un
compuesto incoloro por las enzimas reductasa en la membrana celular [2]. Sin
embargo, a diferencia de los otros métodos descritos anteriormente, Las
evaluaciones que dependen del metabolismo no detectan células
metabólicamente inactivas transitorias, como las células persistentes
responsables de la tolerancia a los antibióticos observada en una amplia gama
de especies microbianas. La tolerancia a los antibióticos, que es distinta de la
resistencia a los antibióticos, se define como la capacidad de una fracción de
una población bacteriana susceptible a los antibióticos. " persiste " para sobrevivir
a la exposición a concentraciones normalmente letales de antibióticos
bactericidas [4-7]. Las células Persister son un área de investigación importante
y en crecimiento debido a su gran relevancia clínica y ambiental [4 - 7].
Aplicaciones prácticas de alto rendimiento del método SGT, incluida la
evaluación de la eficacia de varios compuestos en la formación de células
persistentes tolerantes a los antibióticos.
Métodos
Crecimiento y condiciones bacterianas
Todos los compuestos utilizados en este trabajo se obtuvieron de Sigma
Aldrich. Pseudomonas aeruginosa cepa PA14 [9] y mutantes isogénicos, Acinetobacter
baumanii y
Escherichia coli DH5 α se obtuvieron de nuestra colección de stock de
laboratorio. Las bacterias se cultivaron durante la noche en medio Luria
Bertani (LB) a 37 ° C, se diluyeron 1: 100 y
re-cultivado en LB o M63 (KH 2 correos 4 [ 100 mM], (NH 4) 2 ENTONCES 4
[15 mM], FeSO 4 · 7H 2 O [1,7 μ M], MgSO 4 · 7H 2 Medio O [1 mM], glucosa
[0,2%]). P. aeruginosa Las células PA14 fueron
crecido hasta la fase logarítmica media en ausencia o presencia de: (i)
AA o 3-AA a una concentración (0,75 mM) que no afecta la tasa de
crecimiento; y (ii) gentamicina (1,5 mg / L) o ciprofloxacina (0,04 mg / L) a
una concentración sub MIC que tampoco afecta la tasa de crecimiento.

Para los recuentos de CFU, las células se diluyeron en serie en medio LB

Aquí, combinamos la metodología de cálculos cuantitativos de qPCR con un
método cualitativo de determinación del crecimiento bacteriano descrito por De
Groot et al. [ 8] para desarrollar un método cuantitativo mejorado, denominado
método de inicio del tiempo de crecimiento (SGT). Este método permite a los
investigadores detectar el número relativo de bacterias vivas dentro de las
muestras y es muy adecuado para estudios de HTS. Este método se basa en
la observación de que el número de células en un inóculo inicial es linealmente
proporcional a la fase de retraso del crecimiento antes de que los cultivos
alcancen un umbral de densidad óptica [8]. Describimos aquí varios
y se sembraron en placas de agar LB que se incubaron durante 24 ha 37 ° C.
Para el método SGT, una alícuota de células se diluyó 1: 500 en LB fresco
para servir como
" normalizador " y se añadió el antibiótico meropenem al resto de cultivos ( " tratado
") hasta una concentración final de 100 × MIC (es decir, 10 mg / L). Las
células se incubaron con el antibiótico a 37 ° C durante 24 h más y luego
se diluyeron 1: 500 en LB para eliminar el efecto antibiótico del cultivo. La
cinética de crecimiento tanto de los normalizadores como de las células
tratadas se registró usando un lector de placas de 96 pocillos
automatizado (Sunrise Tecan, Suiza) a 37 ° C con 10 s de agitación
circular cada 15 min, seguido de

10 s de sedimentación en cuyo momento OD 600 nm fue detectado.

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Figura 1 ( Consulte la leyenda en la página siguiente).

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(Ver figura en la página anterior).

Figura 1 Los valores de SGT son proporcionales al inóculo inicial. La linealidad del método SGT se evaluó en varias cepas y condiciones. ( UN)
Curvas de crecimiento del tipo salvaje P. aeruginosa cepa PA14 (PA) cultivada en LB (verde), LB + etanol al 3% (amarillo) y en el medio definido M63 (rosa); Derivado mutante isogénico PA14 cyt
b1 ( azul claro); y cepas de tipo salvaje A. baumanii ( negro y E. coli DH5 α ( azul oscuro). ( SEGUNDO) El tiempo
cuando las curvas de crecimiento cruzaron el umbral (OD 600 nm = 0,15 - 0,2) se define como SGT. P. aeruginosa Las células PA14 se cultivaron hasta OD 600 nm = 2.0, cuando la concentración de células fue 4.07 x 10 9 ±

7,02 x 10 8 células / mL según recuentos de UFC. Las células se diluyeron en serie 1:10 en un recipiente de 96 pocillos.

lector de placas a ODs por debajo del umbral de detección del espectrofotómetro, después de lo cual se registró su cinética de crecimiento y también se determinó a las 18 h mediante recuentos de UFC. Cada curva de crecimiento

es el promedio de al menos 3 repeticiones. ( C) Los gráficos de los valores de SGT frente a las concentraciones bacterianas detectadas por el recuento de UFC revelan una correlación lineal en todos los casos (R 2> 0,99). Los

colores de los círculos corresponden a las concentraciones de inóculo. La curva de regresión lineal se muestra en rojo. ( D - E) Curvas de crecimiento y gráficos de los valores de SGT frente a las concentraciones bacterianas

detectadas por el recuento de CFU para las condiciones y cepas adicionales.

El SGT para cada muestra se determinó como el tiempo
cuando el OD 600 nm de la muestra alcanzó un umbral de
0,15 - 0,2. El tamaño relativo del tolerantes a antibióticos
persistir subpoblación para cada mutante ' s cultura fue
calculado como el registro 2 pliegue de cambio (- ΔΔ SGT) entre las muestras
normalizadas a la de PA14.
ΔΔ SGT cálculo
Aplicamos la metodología para calcular el ΔΔ Connecticut para experimentos
cuantitativos de reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) [10,11]
determinando ΔΔ SGT valores de las muestras en comparación con un calibrador.
Primero un Δ SGT El valor se calculó para cada muestra de acuerdo con la
siguiente ecuación
ción: Δ SGT = (SGT Tratado - SGT Normalizador) donde el SGT de las células
normalizadoras no tratadas se restó del
SGT de células tratadas. Segundo, un ΔΔ SGT El valor se calculó
restando el Δ SGT de la cepa o condición de referencia ( " calibrador ") del
de la muestra: ΔΔ SGT =
( Δ SGT Muestra - Δ SGT Calibrador). El cambio de pliegue entre la muestra y el
calibrador se calculó como: F = 2 - ΔΔ SGT.
Los resultados se presentan como registro 2 cambios de pliegue: - ΔΔ SGT.
Resultados y discusión
Evaluación del número de células de bacterias vivas en un entorno de alto
rendimiento
El método SGT se basa en el tiempo que tarda un cultivo de células
bacterianas en crecimiento para alcanzar niveles espectrofotométricamente
detectables que son proporcionales al inóculo bacteriano inicial [8]. Este
enfoque permite cuantificar las bacterias vivas dentro de un cultivo (Figura 1).
El SGT de cada muestra se define como el tiempo requerido por el cultivo
para
alcanzar un OD 600 nm umbral que se establece ligeramente por encima del
fondo detectable al comienzo del logarítmico
fase de crecimiento, 0,15-0,2 en el presente estudio.
Como se muestra en la Figura 1, los valores de SGT de los cultivos de
células bacterianas son proporcionales al inóculo inicial de todas las
condiciones y cepas utilizadas. Se determinaron los valores de SGT de
varios cultivos de células bacterianas inoculados con diversas
concentraciones de partida y cultivados en diversas condiciones (Figura 1A)
(Figuras 1B y 1D). Se generó una curva de calibración trazando los valores
de SGT frente a los correspondientes valores de inóculo inicial, que se
evaluaron mediante recuentos de UFC en placas.
(Figuras 1C y 1E). Como se muestra, observamos una correlación lineal entre
los valores de SGT y el número de UFC dentro de los inóculos iniciales (R 2> 0,99).
Usando estas curvas de calibración, fue posible evaluar la concentración de
células vivas dentro de una muestra dada sin sembrar en placa,
independientemente de su condición de crecimiento.
Las figuras 1B y 1D muestran que los valores de SGT se obtuvieron en 2 h
para 4 × 10 7 ± 7 × 10 6 CFU / mL y dentro de las 11.5 h cuando la concentración
inicial de células fue tan baja como 51 ± 42 CFU / mL. Estos tiempos de
procesamiento son mucho más cortos que los ≥ Se necesita un período de 24 h
para obtener los recuentos de UFC. Además, cabe señalar que el método SGT
fue lo suficientemente sensible como para detectar diferencias
espectrofotométricamente en el número de células vivas entre 40 y 400 bacterias.
Tomados en conjunto, estos resultados muestran que el método SGT puede
proporcionar una estimación sensible, precisa, robusta y rápida del número de
células bacterianas de una manera adecuada para su uso en un entorno de alto
rendimiento.
Ejemplo 1: Evaluación de la actividad bactericida antibiótica
El método SGT puede usarse para evaluar las actividades bactericidas relativas
de antibióticos u otros compuestos que impactan el crecimiento bacteriano. Para
ello, aplicamos la metodología para calcular el ΔΔ Connecticut para qPCR [10,11]
determinando ΔΔ SGT valores de las muestras en comparación con un
calibrador como se describe en la sección Métodos.
La eficacia letal del antibiótico meropenem sobre P. aeruginosa se
comparó con la de dos de sus mutantes isogénicos, mvfR y pqsBC ( Figura
2A). los mvfR
mutante alberga una mutación en el regulador de detección de quórum relacionado
con la virulencia global MvfR, mientras que pqsBC, Los genes regulados por MvfR
codifican las enzimas PqsB y PqsC que son necesarias para la síntesis de
4-hidroxi-2-alquilquinolinas (HAQ) [12-16]. En este ejemplo, las células tratadas con
meropenem se definieron como tratadas y las células no expuestas a meropenem
se utilizaron como normalizadores. Los cultivos de la cepa PA14 de tipo salvaje
sirvieron como cultivos calibradores de referencia y los dos mutantes se procesaron
como muestras. Después del tratamiento con meropenem, la cinética de
crecimiento de los normalizadores y las células tratadas se registró como se
describe en el
Métodos. Con un OD 600 nm umbral de 0,15, Δ SGT
los valores se calcularon como: Δ SGT = (SGT Tratado (meropenem) -
SGT Normalizador (sin tratar)) para cada muestra. El tamaño relativo
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Figura 2 Ejemplo de uso del método SGT: evaluación de la actividad bactericida relativa de meropenem en varios P. aeruginosa mutantes isogénicos. (UN) PA14 de tipo salvaje (azul) y sus
derivados mutantes isogénicos mvfR ( negro y pqsBC ( rojo) se cultivaron a una fase logarítmica media antes de ser sometidos a un tratamiento de 24 h con meropenem (10 mg / L) a 37 ° C (no se
agregó meropenem a los normalizadores). Después de una dilución 1: 500, el
Se registró la cinética de crecimiento de los normalizadores y las muestras tratadas. Empleando un OD 600 nm = 0,15, Δ SGT Los valores se calcularon como la diferencia entre los SGT tratados y
normalizadores. ΔΔ SGT Los valores se calcularon como la diferencia entre Δ SGT s de los mutantes al de tipo salvaje
PA14, que sirvió como calibrador. ( SEGUNDO) Para el método SGT, log 2 veces el cambio se calculó como - ΔΔ SGT ( barras vacías). Para contar CFU,
los normalizadores y las células tratadas se diluyeron en serie y se sembraron en placas. Para fines de comparación, los resultados del recuento de CFU también se presentan como log 2 pliegue de cambio (barras

rellenas). Las diferencias entre los valores obtenidos por los dos métodos no difirieron significativamente (p> 0,1).

de la subpoblación persistente tolerante a antibióticos en cada
mutante ' s cultivo se calculó como el log 2 pliegue de cambio −ΔΔ SGT) dónde:en ausencia o presencia de AA, 3AA, gentamicina o ciprofloxacina a una
ΔΔ SGT = ( Δ SGT Muestra
- Δ SGT Calibrador (PA14)).
los mvfR las células mutantes tenían un número menor (log 2 pliegue cambio de - 3,0 ±
0,29) y pqsBC las células mutantes tenían un
número mayor (registro 2 veces el cambio de 2,1 ± 0,07) de las células supervivientes
que las células PA14 de tipo salvaje (Figura 2B). Allí
Hubo una fuerte concordancia entre estos datos de SGT y los datos de CFU
obtenidos en paralelo (p> 0,1), proporcionando validación del método de SGT
(Figura 2B).
( mvfRor pqsBC))
P. aeruginosa Las células PA14 se cultivaron hasta la fase midlogarítmica
concentración que no afecta la tasa de crecimiento (Figura 3A). Después de
la adición de meropenem, las células se incubaron durante 24 horas y se
determinó el tamaño relativo de la subpoblación de células supervivientes
utilizando los métodos de recuento de SGT y CFU en paralelo, como se
describió anteriormente. Ambos métodos mostraron, sin diferencias
significativas entre ellos (p> 0,1), que la gentamicina y la ciprofloxacina
aumentaron la supervivencia,
subpoblación de células tolerantes a los antibióticos en ~ 5 y 2 log 2
veces respectivamente en relación con ningún compuesto, mientras que AA y

3-AA no afectó la supervivencia celular. Es importante destacar que este ensayo

Ejemplo 2: detección de un compuesto ' s efecto sobre el tamaño de una
subpoblación tolerante a los antibióticos
Otra aplicación práctica del método SGT es la detección de compuestos
que afectan la formación de células tolerantes a los antibióticos. Para
demostrar esta aplicación, examinamos los efectos de cuatro compuestos
sobre el tamaño de las subpoblaciones persistentes en los cultivos de
PA14 expuestos a una dosis letal de meropenem (10 mg / L). En concreto,
los compuestos utilizados fueron: ( yo) el precursor HAQ ácido antranílico
(AA) [16]; ( ii) el análogo de AA 3-AA; y los dos antibióticos ( iii) gentamicina
y iv) ciprofloxacina (Figura 3A).
puede ampliarse para evaluar simultáneamente la eficacia de triplicados de 32
compuestos en placas de 96 pocillos o triplicados de 128 compuestos en placas de
384 pocillos.
Conclusiones
El método SGT es una forma reproducible, precisa y rápida de estimar el
número de células bacterianas vivas presentes en un cultivo líquido. No es
laborioso y se puede realizar sin ningún entrenamiento o equipo
especializado más allá de un lector de placas automático básico. A diferencia
de los datos de CFU, los valores de SGT no pueden ser sesgados por grupos
de
bacterias. Como OD convencional 600 nm lectura de placas, SGT
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UN segundo

7
1.0

Iniciar sesión 2 veces la fracción de células de tolerancia a antibióticos

0,8 6

Sin tratar
Crecimiento (OD 600nm)

0,6 5
Automóvil club británico
0.4 4
3-AA
3
Caballero

0,2 2
Cipro

0 0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
-1
Tiempo (h)
Sin tratar 3-AA
Automóvil club británico Caballero Cipro

figura 3 Ejemplo de uso del método SGT: evaluación de la eficacia relativa de los compuestos sobre el tamaño de la fracción de células persistentes utilizando el método SGT. (UN) Las células PA14 se
cultivaron hasta la etapa logarítmica media (flecha) en ausencia o presencia de AA (0,75 mM), 3-AA (0,75 mM), gentamicina (Gent, 1,5 mg / L) y ciprofloxacina (Cipro, 0,04 mg / L). Se aplicó meropenem
como en la Figura 2. ( SEGUNDO) Una comparación de la fracción de supervivencia
Tamaños obtenidos por métodos de conteo SGT (barras vacías) y CFU (barras llenas), presentados como log 2 doblar el cambio. Los valores de SGT se determinaron utilizando un

OD umbral 600 nm = 0,15. Δ SGT Los valores se calcularon como la diferencia entre los valores de SGT de cultivos tratados y no tratados con meropenem y ΔΔ SGT valores como la diferencia
entre cultivos tratados con compuesto y el calibrador sin tratar. Los datos de recuento de SGT y CFU no fueron
significativamente diferente (p> 0.05).

detecta solo bacterias vivas y simultáneamente proporciona información adicional
sobre la naturaleza del estado de crecimiento, como el tiempo de duplicación
celular y el tiempo para entrar en la fase estacionaria. Sin embargo, SGT es
mucho más sensible que
OD convencional 600 nm lectura, ya que puede detectar concentraciones de
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
Autores ' contribuciones
RH, YQ y LGR diseñaron el método SGT. RH, YQ y DM llevaron a cabo los experimentos. RH, YQ
y LGR escribieron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

bacterias tan bajas como ~ 10 bacterias / mL. El SGT

El método se puede utilizar para una diversidad de aplicaciones, incluyendo HTS
de compuestos y condiciones que afectan la viabilidad bacteriana y estudios de
tolerancia a antibióticos y formación de células persistentes.
El método SGT tiene algunas limitaciones que deben tenerse en cuenta. En
primer lugar, a diferencia del recuento de UFC, el método SGT requiere que los
cultivos de calibrador y muestra se cultiven en las mismas condiciones con tiempos
de duplicación similares, ya que supone que el tiempo necesario para que un
Agradecimientos
Agradecemos a Michal Levitzky-Shpinner por ayudar con el análisis de datos SGT. Este trabajo fue
apoyado por Shriners ' beca de investigación # 8770 (LGR) y en parte por la beca AI063433 del Instituto
Nacional de Salud. YAQ fue apoyado por una subvención de la Swiss National Science Foundation / Swiss
Medical Association (FMH)
# PASMP3-123226 y una subvención de la Fundación SICPA. RH fue apoyado por Shriners ' Beca de
investigación de hospitales # 8494.
Detalles del autor
1 Departamento de Cirugía, Escuela de Medicina de Harvard y Hospital General de Massachusetts, Boston,

MA 02114, EE. UU. 2 Departamento de Microbiología e Inmunobiología, Escuela de Medicina de Harvard,

cultivo bacteriano en crecimiento alcance el umbral es proporcional a la
Boston, MA 02114, EE. UU. 3 Hospitales Shriners para Niños Boston, Boston, MA 02114, EE. UU. 4 IYAR,
concentración de la inicial. inóculo. En segundo lugar, en condiciones que afecten
Instituto Israelí de Investigación Avanzada, Rehovot, Israel.
la fase de retraso del crecimiento, los valores de SGT deben tomarse con
precaución. Por ejemplo, las células cultivadas en medios mínimos podrían imitar
Recibido: 23 de julio de 2012 Aceptado: 25 de octubre de 2012 Publicado: 13
falsamente inóculos bajos en comparación con las células de la misma
de noviembre de 2012
concentración cultivadas en medios ricos. En tercer lugar, en el caso de la
evaluación de células persistentes, los cambios o diferencias en la " despertar " La Referencias
cinética de estas células podría causar un sesgo potencial, ya que las células de 1. Miller JH: Determinación de recuentos de células viables: curvas de crecimiento bacteriano. En

Experimentos en Genética Molecular. Editado por Miller JH. Nueva York: Cold Spring Harbor; 1972: 31 - 36.
rápido despertar podrían interpretarse falsamente como un número elevado de
células. En tales casos, como se usa en la evaluación de pares de oligonucleótidos 2. Bapat P, Nandy SK, Wangikar P, Venkatesh KV: Cuantificación de biomasa metabólicamente activa usando

en qPCR, se necesitaría una única curva de calibración de SGT frente a CFU para Prueba de reducción de colorante azul de metileno (MBRT): medición de UFC en aproximadamente 200 s. Métodos

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determinar la linealidad de los valores de SGT. Finalmente, al realizar HTS usando
sesenta y cinco: 107 - 116.
SGT, sería prudente la validación de aciertos usando el método convencional de 3. Jepras RI, Paul FE, Pearson SC, Wilkinson MJ: Evaluación rápida de los efectos de los antibióticos en Escherichia
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Deziel E, Lepine F, Milot S, He J, Mindrinos MN, Tompkins RG, Rahme LG:

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doi: 10.1186 / 1471-2180-12-259

Cite este artículo como: Hazan et al .: Un método para la determinación de alto rendimiento de recuentos de

células bacterianas viables en placas de 96 pocillos. Microbiología BMC 2012 12: 259.

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