UNIVERSIDAD DEL QUINDÍO

FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS Y TECNOLOGÍAS

PROGRAMA DE QUÍMICA

Microbiología (2021 - II )

INFORME DE LABORATORIO: LOS MICROORGANISMOS: PRUEBAS E

IDENTIFICACIÓN
Ramírez Sepúlveda Manuela; mramires_1@uqvirtual.edu.co
Campeón Nicolás; nicolas.campeonv@uqvirtual.edu.co

RESUMEN:
En este informe se muestran las diferentes practicas realizadas en el laboratorio, comenzando con los medios de cultivo
como el PDA donde permite el crecimiento de mohos y levaduras, PCA el cual sirve para el crecimiento de mesófilos,
Verde Brila que se usa para saber si hay coliformes totales y fecales en la muestra de estudio, Agua peptonada el cual
puede funcionar como medio de cultivo que sirve como diluyente potencial y BHI que es una infusión de corazón y
cerebro el cual funciona para una alta variedad de tipos de microorganismos, incluso las bacterias, levaduras y hongos
filamentosos los cuales se utilizaron en el transcurso del semestre teniendo en cuenta cada una de las características de
ellos, para posteriormente usar los microorganismos que se usaron para sembrar en estos medios y se le realizaron
diferentes pruebas específicas para la identificación como las pruebas bioquímicas para las bacterias como el TSI, LIA,
MIO, SIM, KIA, citrato de Simmons y caldo de Urea, la identificación de microorganismos coliformes totales y fecales, y
la tinción de gram.

Palabras clave: PDA, PCA, BHI, agua peptonada, TSI, LIA, MIO, KIA, Citrato Simmons y caldo de Urea.

ABSTRACT:
This report shows the different practices carried out in the laboratory, starting with culture media such as PDA where it
allows the growth of molds and yeasts, PCA which is used for the growth of mesophiles, Green Brila that is used to know
if there is total and fecal coliforms in the study sample, Peptone water which can function as a culture medium that serves
as a potential diluent and BHI which is a heart and brain infusion which works for a wide variety of types of
microorganisms, including bacteria , yeasts and filamentous fungi which were used in the course of the semester taking
into account each of their characteristics, to later use the microorganisms that were used to sow in these media and
different specific tests were carried out for identification such as the Biochemical tests for bacteria such as TSI, LIA, MIO,
SIM, KIA, Simmons citrate and Urea broth, the iden tification of total and fecal coliform microorganisms, and gram
staining.

Keywords: PDA, PCA, BHI, Peptone Water, TSI, LIA, MIO, KIA, Simmons Citrate, and Urea Broth.

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Microbiología (2021-II)
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos componen gran parte del
planeta, e incluso de los seres vivos. Por esta
razón es importante estudiarlos a profundidad,
para conocer las funciones que tienen y como
estas pueden ser optimizadas y mejoradas a
través de diferentes estrategias que incluyen
principalmente el área de biotecnología. Sin
embargo, para realizar dichas acciones es
necesario identificar primero estos
microorganismos; conocer sus características y
estructura, los cuales van a dar una base
fundamental para luego comenzar con sus
modificaciones. La identificación constituye una
gran cantidad de procesos, dentro de los cuales
algunos involucran todos los microorganismos
mientras que otros son más específicos.
Con cada microorganismo se debe tener especial
cuidado, no solo por lo peligroso que puede llegar
a ser para la salud humana, sino también para
permitir su reproducción en ciertos medios y
estudiarlos de forma precisa, sin contaminaciones.
Por lo tanto, lo más adecuado es implementar un
proceso de limpieza y desinfección en cada uno
de los materiales y espacios a utilizar. Algunos
métodos como el utilizado a través de la cabina de
flujo laminar permite la eliminación de todo tipo de
microorganismo y espora que pueda liberar,
dentro de un espacio específico, permitiendo la
esterilización. Otros métodos para cumplir con la
esterilización, pero en materiales, es a través de la
autoclave, el cual realiza el procedimiento gracias
a la acción de vapor de agua. Los procedimientos
de limpieza y desinfección suelen ser más
sencillos en los que principalmente actúan
sustancias químicas desinfectantes, como el
hipoclorito de sodio, etanol, peróxido de
hidrógeno, etc. Estos agentes destruyen
estructuras importantes en las células y
membranas, y se usan directamente sobre los
microorganismos o sobre superficies e existen diferentes tipos de medios de cultivo para
instrumentos de laboratorio. Debido a que su
acción es más sencilla no se garantiza la
eliminación de esporas, lo que da lugar a un
margen de error muy grande en cuanto a
contaminación de muestras. Todos estos procesos
son indispensables en la preparación del material
de laboratorio y del área de trabajo, con el fin de
cumplir con las normas de bioseguridad (que
además incluyen el correcto uso de la bata de
laboratorio y guantes) y un adecuado estudio de
los microorganismos.
Teniendo claros los procesos de limpieza y
desinfección se puede proceder a la siembra de
microorganismos. La reproducción se da a través
de medios de cultivos, los cuales se pueden
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clasificar en muchos tipos: por su utilidad, el tipo
de siembra (por agotamiento por estrías, por
dimensión en superficie, por difusión feriada), los
nutrientes del medio de cultivo, su origen
(naturales, sintéticos, semisintéticos), el estado del
medio (sólido, liquido, semisólido), etc. Estos
tienen condiciones favorables para los
microorganismos; principalmente el pH, la
temperatura y los nutrientes adecuados. Se
procura también la preservación de estos medios
de cultivo, para optimizar el trabajo y permitir una
nueva siembra a partir del mismo. Principalmente
este procedimiento se puede realizar a través de
refrigeración, a temperaturas reguladas. Dentro de
las estrategias se encuentran la liofilización y la
criospreservación.
En cada uno de los medios de cultivo existe un
crecimiento microbiano, con etapas de vida
definidas. Entre ellas están la fase de latencia,
donde el microorganismo se prepara para
reproducirse y se adaptan al medio. Luego se
encuentra la fase exponencial, en la cual el
microorganismo comienza a reproducirse
rápidamente. Después se presenta la fase
estacionaria, en la cual disminuye la reproducción
y el número de individuos es muy constante. Esta
se ve regulada por los nutrientes o por la
acumulación de metabolitos inhibidores.
Finalmente, se observa la fase de muerte, en la
cual ya no puede sostenerse el crecimiento y
comienza a disminuir considerablemente la
cantidad de individuos. Todas estas etapas se
representan gráficamente en una curva de
crecimiento microbiano y se expresa como el
Logaritmo de células viables (eje x) a través de un
tiempo determinado (eje y).
El siguiente paso en el estudio de
microorganismos es el de identificación. La prueba
inicial de identificación es la tinción. Así como
microorganismos específicos, existen tinciones
específicas, con el fin de confirmar la presencia de
estos, además de visualizar microscópicamente su
estructura. A rasgos generales se dividen en tres
tipos: simples (toda la muestra se tiñe del mismo
color), diferenciales (se visualiza más de un color)
y específicas (anticuerpos marcados con
moléculas fluorescente para identificar la
estructura celular). A continuación, se muestran
las más importantes:
 Tinción de Gram: tinción diferencial para
bacterias gram positivas y gram
negativas. Desarrollada por Hans
Christian Gram.
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 Tinción de Wright: tinción policromática
(tiñe sustancias ácidas y básicas)
utilizada principalmente para visualizar
las células sanguíneas. Desarrollada por
James Homer Wright.
 Tinción de Ziehl-Neelsen: Desarrollada
por Franz Ziehl y Karl Adolf Neelsen. Útil
para la diferenciación de bacterias que
pueden resistir la decoloración con
alcohol-ácido y aquellas que no.
 Tinción Negativa: desarrollada
originalmente para microscopía de luz
para delinear bacterias no teñidas y otros
materiales microscópicos. Su limitación
principal es el fondo oscuro que no
permite una identificación adecuada.
 Tinción de azul algodón de lactofenol: Se
usa principalmente en hongos y permite
apreciar fácilmente las estructuras con el
fin de establecer una correcta
identificación. Su fundamento es la
inactivación de enzimas líticas de la
célula.
En esta área es fundamental conocer la
morfología de los microorganismos y distinguir
entre el material celular que puede encontrarse en
bacterias, hongos, protozoos, etc. Pues es uno de
los pasos principales para desarrollar y enfocar el
estudio.
Dentro del estudio microbiológico se encuentra un
campo muy importante: la identificación de
mesófilos en ambientes, sustancias o materiales
que son usados por el ser humano, como el agua.
Los mesófilos son microorganismos que crecen
rápidamente en temperaturas entre 25 y 40 °C. A
este grupo pertenecen una serie de bacterias
conocidas como coliformes que a su vez incluyen
otro grupo conocido como coliformes fecales. Los
primeros crecen a 37°C y los segundos a 44,5°C
aproximadamente y ambos son gram negativos.
Para esta identificación es necesario entonces un
recuento de estos y principalmente se utilizan dos
métodos: el de número más probable (NMP) o el
método del filtro de membrana (MF). La técnica
NMP es la más usada y se basa en la
determinación de presencia o ausencia en
diluciones consecutivas de la muestra obtenida
que se desea realizar. Esto se realiza en medios
muy específicos para estos microorganismos, con
las temperaturas adecuadas y la presencia se
confirma por la formación de CO2 en el medio por
parte de estos.
Para completar un procedimiento básico de
identificación microbiológica se deben tener en
3
cuenta las pruebas bioquímicas, las cuales nos
permiten confirmar la presencia de
microorganismos en un medio. Estas pruebas son
muy selectivas y por medio de ellas se pueden
afirmar que un microorganismo es de cierta familia
e incluso género. Su fundamento son las
reacciones químicas en vías metabólicas del
microorganismo y su expresión a nivel visual en el
medio. Dependiendo del resultado se conoce la
presencia o ausencia de una enzima o ruta
metabólica. Las pruebas bioquímicas se clasifican
en dos grupos: pruebas de identificación rápidas y
los medios de cultivo diferenciales. Las pruebas
de identificación rápida son cuatro: prueba de la
catalasa, prueba de la oxidasa, prueba de la
coagulasa y las pruebas de PYR. Las pruebas de
medios de cultivo diferenciales son siete: MIO
(Motilidad-Indol-Ornitina), SIM (Sulfuro-Indol-
Motilidad), Caldo Urea, TSI (Triple Sugar Iron), LIA
(Lysine iron Agar), KIA (Kligler iron Agar) y Citrato
de Simmons.
OBJETIVOS GENERALES
 Preparar adecuadamente los medios de
cultivo sea tipo agar o caldo, tener claro
los medios de cultivo selectivo y
diferenciador e identificar el método de
esterilización adecuado.
 Identificar los coliformes totales y fecales
y entender y reconocer una prueba
positiva o negativa.
 Identificar las pruebas bioquímicas
necesarias para la diferenciación de las
bacterias, tener claro el método de
inoculación para cada una de ellas y
saber cómo leer y analizar los resultados.
METODOLOGIA
Para realizar la esterilización del material, se
lavaron todos los materiales con jabón
cuidadosamente con el fin de eliminar la suciedad
y posteriormente se empacaron pipetas
volumétricas, tubos de ensayo, tubos de hemólisis
y cajas de Petri en papel kraft y se
llevaron a autoclave para su esterilización.
Posteriormente se hicieron los cálculos
correspondientes para realizar los cálculos
respectivos para preparar los medios PCA donde
se usaron 3,5g, para el PAD donde se usaron
7,8g, para el verde brila se usaron 8g, agua
peptonada se usaron 4g y por ultimo para el BHI
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se tomaron 7,4g, cada uno se disolvió con 250mL
de agua destilada, se pusieron a calentar hasta
ebullición, se les puso el tapón y se llevaron a
autoclavar para usarlos en la posterioridad.
Continuamente se realizó el lavado y diluciones de 10-1 , 10-2 y 10-3. Después de tomo
empaquetado del material de vidrio que se usó
durante las practicas suministradas por el
laboratorio de Materiales de la universidad del
quindio, el cual se empaco en papel Kraft y se
llevó a autoclavar, ya que el uso de autoclave es
un método eficiente de esterilización perteneciente
al calor húmedo en el que se utilizan presiones y
temperaturas elevadas para la coagulación de las
proteínas presentes en los microorganismos y
así eliminarlos, se utiliza comúnmente en
instrumentación quirúrgica, de laboratorios,
artículos farmacéuticos, entre otros.
Medios de cultivo y sembrado:
Para la realización del sembrado, se tomó el BHI y
el PCA y autoclavados y reposados por una
semana en la nevera, se calentó hasta fundir el
medio, se preparó el espacio designado para
trabajar, desinfectándolo y manteniéndolo esteril
con dos mecheros ubicados en cada esquina del
espacio seleccionado para hacer la inoculación, el
microorganismo (levadura de la borla de café) fue
prestado a inocular fue suministrado por la
profesora, teniendo ya los medios bien fundidos y
atemperados se procedió a añadir un poco en
cada caja de petri esterilizada con una medida de
un poco más de la mitad del medio en esta, se
dejó solidificar para posteriormente hacer el
sembrado por agotamiento, se selló y se guardó
en un ambiente adecuado para permitir el
crecimiento de los microorganismos.
Identificacion de coliformes totales y fecales:
Los coliformes fecales son bacterias Gram
negativas que fermentan lactosa produciendo gas
en48h aproximadamente, esta es la base del
recuento de coliformes, se realiza por el método
del número más probable NMP, en el que se usa
un medio de cultivo que contiene sales biliares,
los tubos que resulten positivos (formación de
burbujas en tubos Durham) se siembran en
medios selectivos y diferenciales para buscar
EColi.
Se realizó la atemperación del Verde Brila en la
estufa para posteriormente tomar 9 tubos de
ensayo y añadirles 9mL a cada uno, el
microorganismo a estudiar se tomó del sembrado
anterior, el cual se diluyo en agua peptonada, se
preparó la dilución madre, en donde se tomó con
un asa del medio una pequeña parte del
4
microorganismo, se añadió en 10mL de agua
peptonada, de esta se tomó 1mL y se añadió al
segundo tubo con 9mL de agua peptonada y se
repitió este procedimiento 3 veces, obteniendo 3
1mL de cada disolución y se añadió en los tres
primeros tubos con el verde brila, este
prodedimiento se hizo por triplicado y por último se
insertó los tubos de hemolisis invertidos, quitando
las posibles bombas de aire formadas con unos
pequeños golpes, se tapó y se dejó reposar por
48h, para poder leer el resultado.
Identificación de microorganismos por
medio de pruebas bioquímicas.
Para las pruebas bioquímicas, los medios fueron
otorgados por la auxiliar de laboratorio. Estos
medios fueron calentados hasta punto de
ebullición a una temperatura media, después se
dejó enfriar a temperatura ambiente, cada
prueba bioquímica se adiciono a un tubo de
ensayo previamente autoclavado, el llenado delos
tubos fue dependiendo de la prueba a
realizar, de forma inclinada o horizontal.
Después se procedió a introducir el inoculo
encada uno de ellas, el cual contenía la muestra
problema. La metodología para la siembra fue la
siguiente:
Medios inclinados:
 TSI, LIA y citrato de simmons:
picadura profunda con asa recta y por
estría en el pico.
 Medio de Urea: Estría y pico de flauta.
Medios en forma Horizontal:
 MR-VP: Siembra por inoculación
directa (Liquido)
 SIM: picadura profunda.
 Agar de hierro y lisina (LIA), medio de
agar-agar citrato de Simmons, media
agar-agar urea, Medio MIO (Movilidad,
Indol y Ornitina) y Medio MR-VP
( Rojo de metilo y
VogesProskauer).
Todos fueron suministrados por el laboratorio de
reactivos de la Universidad del Quindío. Material
Orgánico. Para la realización de las pruebas
bioquímicas las muestras de microorganismos
fueron presentadas por la práctica de
laboratorio.
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enzimática debe dar positivo y E. coli dio positiva,

algo improbable ya que es gram negativa. Esto
pudo darse por un error en el proceso de
etiquetado de las muestras, en cual
probablemente el auxiliar de laboratorio cambió
las etiquetas y las muestras quedaron contrarias.
Por otra parte, también es preciso tener en cuenta
el tiempo de antigüedad que tienen cada una de
RESULTADOS Y DISCUSIÓN las muestras, pues las que se usaron ya tenían
bastante tiempo de ser preparadas. Esta situación
crea falsos positivos y también falsos negativos,
que en momento de analizar afectan directamente
el resultado.

Los resultados de coliformes fueron todos

negativos, pues definitivamente no se encontraban
presentes en la muestra. A pesar de saberlo
previamente se realizó para descartar cualquier
presencia de estos.

Figura 1. Bacilos bacterianos

Figura 2. Imagen ampliada

Se realizó una tinción con azul algodón de
lactofenol donde puede verse claramente la Figura 3.
presencia de bacterias en forma de bacilos que
corresponden a un cultivo selectivo del género Como es posible observar en la figura, no hay
Bacillus. presencia de aire dentro de la campana de
Durham, por lo tanto, no hay presencia de
Esta tinción se realizó con azul de metileno, el coliformes.
cual facilita la visualización de la morfología
externa de las bacterias ya que penetra en el Donde se obtuvo mejores resultados fue en los
citoplasma y tiñe las células muertas que ya no medios de cultivo diferenciales, donde en varios
tienen la capacidad de transformar este de ellos las pruebas fueron positivas claramente.
compuesto en otros compuestos incoloros.
En cuanto a las pruebas bioquímicas solo se TSI (Triple Sugar Iron)
realizó la prueba de la catalasa, gracias a su
practicidad. Dos tipos de bacterias fueron
sometidas a esta prueba: grampositivas y
gramnegativas; por un lado, se tenía la S. aureus
y por el otro E. coli, que respectivamente
corresponden a los grupos mencionados. Al ser
sometidas se dieron resultados incongruentes,
pues la muestra de S. aureus dio negativa, cuando
está comprobado que por su producción

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SIM (Sulfuro Indol Motilidad)

Figura 4.

Esta prueba es negativa, no se presentó ningún

cambio de coloración para comprobar la
degradación de azúcares o la formación de H2S y
tampoco existe separación para confirmar la
formación de gas.

LIA (Lysine Iron Agar)

Figura 6.

Se presenta cierta turbidez en la línea de

inoculación, por lo tanto, puede confirmarse la
motilidad en esta bacteria. Sin embargo, no se
presenta un cambio de coloración a rojo o negro
para comprobar la producción de indol o H2S
respectivamente.

Citrato de Simmons

Figura 5.

En esta prueba si hay un cambio de coloración.

Existe una descarboxilación del aminoácido lisina,
sin embargo, no se encuentra una separación del
medio por formación de gas o coloración negra
para decir que se formó H2S.

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efectivo para el correcto análisis de

microorganismos. Además, este cuenta
con gran cantidad de procedimientos que
involucran sin fin de pruebas para todo
tipo de muestras. Aquí solo se nombran
los principales, pues existen muchos
otros caminos para el estudio
microbiológico.

 Factores externos, como el etiquetado, el

uso de material, la correcta desinfección,
entre otros, juegan un papel fundamental
en el proceso de estudio, pues si alguno
de estos es realizado de una forma
errónea se pueden acarrear márgenes de
error muy grandes, que al final
incrementan la incertidumbre en el
conocimiento que se ha adquirido de
dicho estudio.

Figura 7.  El papel de los estudios microbiológicos

es supremamente importante en la
En esta prueba no hay un cambio de coloración a actualidad, ya que a nivel medicinal se
azul, lo que descarta el uso del citrato como fuente pueden combatir gran variedad de
exclusiva de carbono. enfermedades que afectan la salud
humana. También se pueden
implementar métodos de producción de
sustancias a nivel industrial que
Caldo Urea favorezcan el cuidado ambiental,
frenando el incremento de residuos. Y
evidentemente se puede traer a
relevancia el tratamiento de residuos por
parte de microorganismos.

 Es necesario continuar con el estudio de

microorganismos, pues estos aportan en
gran manera al ser humano en diversas
áreas, pero primero es necesario
conocerlos a profundidad para explotar el
máximo potencial que pueden llegar a
tener en un futuro.

REFERENCIAS

 OMS. Manuel de Bioseguridad en el

Figura 8.
Esta prueba es urea negativa, lo que indica que la
bacteria no tiene la capacidad de degradar la urea
por medio de la enzima ureasa.
Conclusiones
 Todo este proceso de identificación es
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