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TECNOLÓGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE

ECATEPEC

DIVISIÓN DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA

INGENIERÍA BIOQUÍMICA

ECATEPEC, EDO. DE MÉXICO

i
ACADEMIA DE BIOQUÍMICA

MANUAL DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA


SANITARIA

SÉPTIMO SEMESTRE

Elaboró:
M. en C. María Aurora Martínez Trujillo

ii
PRESENTACIÓN

En las industrias de alimentos, la calidad de los mismos depende en gran medida de las
características microbiológicas de éstos. Lo anterior sugiere el estudio detallado de los
principales microorganismos contaminantes o patógenos, así como los parámetros
fisicoquímicos que permiten conservar los alimentos del ataque microbiano.

El presente manual ha sido elaborado con el objeto de dirigir el trabajo experimental del
alumno hacia el manejo de muestras y material en microbiología, así como el empleo
de los métodos de conservación más comúnmente empleados en la industria de los
alimentos al comprender el efecto que estos tienen sobre la viabilidad y el crecimiento
microbiano.

Para ello se presentan seis prácticas que los estudiantes realizarán durante las
primeras 9 semanas del semestre, empleando las cuatro horas que tienen asignadas
para el trabajo en laboratorio.

Estas prácticas han sido estructuradas con el objetivo de que el alumno tenga un punto
de partida para el desarrollo de las mismas, pero evitando que el trabajo de laboratorio
se reduzca a la repetición o ensayo de técnicas de análisis, ya que, de la manera en la
que están planteadas, el alumno podrá:
a) Elegir el alimento con que desea trabajar, y todo lo que ello implica, como
obtención, preparación y tratamiento de la muestra.
b) Seleccionar sus variables de trabajo.
c) Plantear los objetivos específicos de acuerdo a sus intereses.
d) Plantear su propia hipótesis de trabajo.
e) Seleccionar la técnica o técnicas de análisis mas adecuadas para el alimento
que eligió.
Todo lo anterior siempre dentro del cumplimiento de los objetivos.
Se sugiere que para el desarrollo de las prácticas, se trabajen tipos de alimentos y/o
técnicas de análisis (según sea el caso) diferentes en el grupo y después se

iii
intercambien resultados para poder establecer comparaciones. En ocasiones, dos o
tres prácticas podrán convertirse en una sola, empleando un diseño experimental, en la
que cada equipo del grupo desarrolle una parte. En este caso, la práctica final se
conformará con los resultados obtenidos por todo el grupo, y se discutirán y analizarán
en una sesión especial.

Después de realizar las prácticas, los estudiantes deberán desarrollar un proyecto de


investigación aplicada para el diseño de una planta que proponga la elaboración de un
producto alimenticio de elevada calidad, de acuerdo a los temas vistos en clase,
empleando, de ser necesario, algunas de las técnicas aprendidas durante el desarrollo
de las prácticas de este manual.

Con esta forma de trabajo se pretende que el alumno adquiera madurez académica y
desarrolle una visión encaminada a la investigación apoyando así el modelo de
educación que sigue el TESE, fortaleciendo principalmente el saber hacer y el innovar.

iv
INDICE

Reglamento de trabajo en el laboratorio de microbiología y 1


procedimientos generales de trabajo en el laboratorio de
microbiología

Práctica 1. Preparación del material para esterilizar 8

Práctica 2. Aislamiento y recuento de bacterias aerobias 14

Práctica 3. Aislamiento y cultivo de hongos filamentosos y 19


levaduras

Práctica 4. Efecto de la actividad de agua sobre la viabilidad 26


y el crecimiento microbiano

Práctica 5. Efecto de la temperatura de incubación sobre el 32


crecimiento microbiano

Práctica 6. Influencia del pH sobre el crecimiento microbiano 38

Proyecto de investigación 44

v
Reglamento de trabajo en el laboratorio de
microbiologia y procedimientos generales de trabajo en
el laboratorio de microbiología

1
TECNOLÓGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE ECATEPEC
DIVISIÓN DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA
ASIGNATURA: Microbiología Sanitaria CARRERA: Ingeniería Bioquímica

Reglamento de trabajo en el laboratorio de microbiología

Tomando en consideración que los microorganismos con los que se trabaja en este
curso pueden llegar a ser patógenos, se deberán seguir estrictamente las
indicaciones de este documento. No se debe menospreciar el riesgo a la salud que
representan muchas de las substancias que se emplean ni las precauciones en el
uso de mecheros de gas, debiendo dar aviso inmediato en el caso de fugas o
derrames.

 De preferencia, las horas de entrada y salida del laboratorio deben cumplirse


puntualmente.
 Dentro del laboratorio, deberá tenerse la bata puesta y abotonada.
 No se permitirá la entrada a personas ajenas al laboratorio.
 Las chicas deberán traer el cabello levantado mediante una coleta.
 Limpiar la mesa de trabajo con una solución desinfectante antes de empezar y
al terminar el trabajo.
 Se deberán colocar todos los objetos personales en fuera del área de trabajo.
 Abstenerse de comer, fumar, beber, aplicarse maquillaje e introducirse objetos a
la boca.
 En la medida de lo posible, el trabajo debe realizarse sentado. No se
debe pasear entre las mesas del laboratorio, tratando de hablar sólo lo
necesario cuando se esté trabajando ante el mechero.
 Deberá leerse con sumo cuidado el diagrama de flujo que se realice con la
ayuda del profesor antes de empezar la práctica. Si no entiende, pregunte.
 Se deberá informar al profesor sobre cualquier accidente que ocurra.
 Depositar en los botes para basura todo el material de desecho no
contaminado, como papel, algodón, cerillos, etc.
 Al finalizar cada sesión, deberá colocarse el material debidamente
separado en los lugares asignados para ello: material contaminado para
esterilizar, sin etiquetas; material sucio para lavar; material para incubar; y
reactivos debidamente cerrados y ordenados.
 El material para incubar debe llevar la siguiente identificación: Grupo, Equipo,
nombre del alumno, nombre del profesor, condiciones de la incubación, fecha y
nombre del microorganismo o experimento.
 Colocar los bancos debajo de la mesa al terminar la sesión y lavarse las manos
antes de salir del laboratorio.

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Procedimientos generales de trabajo en el laboratorio de
microbiología.
El trabajo en el laboratorio de microbiología sanitaria requiere de un lugar
apropiado y de una serie de procedimientos rutinarios que aseguren la realización de
operaciones limpias y sin riesgo. El laboratorio es un lugar especial de trabajo en el que
se requieren condiciones apropiadas.
Como medida de precaución ante la posibilidad de que el operador reciba
derrames o salpicaduras de material indeseable, se deberá trabajar con una bata,
preferentemente blanca, de algodón, con manga larga, que se cierre de tal forma que
cubra el frente del cuerpo. Ya que la naturaleza del trabajo requiere la observación
minuciosa de recipientes, a veces abiertos, y manipulación de objetos delicados, las
manos deben estar limpias y el cabello largo debe estar recogido firmemente en la
nuca.
Las operaciones de pipeteo deberán ser realizadas con el uso de una pera de
hule o algún otro dispositivo de succión controlable, evitando tanto como sea posible el
uso de la boca, sobre todo cuando se trate del manejo de organismos peligrosos,
líquidos cáusticos, corrosivos, tóxicos o que produzcan vapores. Debe cuidarse de
poner un filtro de algodón en la boquilla de la pipeta para el manejo de muestras
microbiológicas.
Es muy importante que del lado izquierdo se coloquen las gradillas con tubos,
matraces, cajas de petri y toda clase de recipientes que se habrán de manipular. Del
lado derecho deben estar cerillos o encendedor, asa y pota asa, marcador, tijeras,
pipetas y un recipiente de dimensiones apropiadas para desechar los diferentes
materiales que se deberán esterilizar, principalmente pipetas y los tapones de algodón
que se ponen al final de estas. Al frente, a unos 30 cm del borde de la mesa se coloca
el mechero, cuya llama debe ser estable y de unos 15 cm de altura.
Para el trabajo en condiciones asépticas, si no se dispone de una campana de
flujo laminar, se deben hacer las manipulaciones a una distancia horizontal no mayor de
20 cm y a una altura de 5 a 10 cm de la base de la llama. Este espacio constituye la
zona de seguridad del mechero.
Siempre debe esterilizarse el asa bacteriológica, antes y después de usarla. El
procedimiento consiste en introducir en la llama del mechero el alambre en posición
inclinada a unos 45º y dejar que alcance el rojo vivo, después se flamea el porta asa
hasta una distancia igual a la profundidad de los recipientes que se utilicen, sean tubos
o matraces.
La boca de tubos y matraces se debe flamear, con objeto de quemar los
filamentos de algodón que puedan adherirse provenientes del tapón, igualmente para
destruir los contaminantes de la mano, que se adhieren en el momento de retirar el
tapón, esta operación se realiza inmediatamente antes de volverlo a colocar. No se
debe exagerar esta operación sobrecalentando, ya que esto puede hacer que el tapón
se queme, o que cualquier manejo subsecuente del material ocasione una quemadura
al operador.

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Diferentes tipos de operación.

Toma de una muestra de un tubo con líquido. Se esteriliza el asa, se toma el tubo con
la mano izquierda, con el dedo meñique y la palma de la mano derecha se sostiene
firmemente el tapón y se retira rotando el tubo suavemente y con firmeza. Se flamea la
boca del tubo. Con el tubo inclinado, nunca en posición horizontal, se introduce el asa
tocando la pared del tubo hasta entrar en el líquido, cuidadosamente se retira el asa
con un movimiento que permita la adhesión de una gotita en el circulo de alambre. No
basta con que se forme una película. Se saca el asa sin tocar la pared del tubo, se
flamea la boca del tubo y se tapa.

Descarga de la gota acarreada en el asa. La gota que se ha tornado asépticamente


puede tener diferentes destinos:
a) El más simple es que se deposite en el centro de un portaobjetos para hacer alguna
preparación. Inmediatamente después se debe esterilizar el asa.
b) A menudo, el destino de una gota tomada con el asa es servir de inóculo, para lo
cual se deben seguir los pasos siguientes:
i) Inóculo a otro medio liquido en tubo o matraz. La operación es similar a la toma de
la muestra, se sostiene firmemente el recipiente con la mano izquierda y el tapón se
retira con el dedo meñique de la mano derecha, se flamea la boca del recipiente y se
introduce el asa cuidadosamente sin tocar las paredes hasta romper la superficie del
liquido, ahí se hace un ligero movimiento de rotación y se retira el asa, se flamea la
boca del recipiente, se coloca su tapón y se esteriliza el asa.
ii) Si es a un medio sólido, se hace una estría con el asa, observando que parte del
material tornado quede extendido a lo largo del trazo. A menos que se indique, no se
debe romper la superficie del medio sólido.

Toma de una muestra de un medio sólido. Las operaciones son las mismas
descritas anteriormente, excepto que con el asa se debe tocar y separar un fragmento
del material de interés, ya sea una colonia bacteriana, o parte de una pasta o material
viscoso. El destino de la muestra puede ser el mismo que en el párrafo anterior.
i) Si se va a hacer una preparación para observar al microscopio, el material se
suspende en una pequeña gota de agua destilada colocada previamente en el centro
de un portaobjetos.
ii) Si va a ser un inoculo, se trata igual como se describió si es a un medio liquido.
iii) Si es a un medio sólido, se hace una estría con el asa, observando que parte del
material tornado queda extendido a lo largo del trazo. A menos que se indique, no se
debe romper la superficie del medio sólido.

Manipulación de cajas de Petri. Estos recipientes generalmente contienen un


medio de cultivo solidificado con agar, cuya firmeza depende de la concentración del
mismo, la cual regularmente es del 2.5 %. En la mayoría de los casos esta sustancia es
inerte y no interfiere con el desarrollo de los microorganismos. A menos que se indique
lo contrario, las cajas de petri se mantienen con la tapa abajo y la base arriba, con lo
cual el agua de condensación que se forma en la tapa no cae sobre el medio de cultivo
y la tapa permite levantar la caja sin destaparla accidentalmente.

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Con la mano izquierda se toma la caja y con un giro de la muñeca se tiene la caja en
posición invertida, la base abajo y la tapa arriba, se deja caer la base en la palma de la
mano y se sostiene la tapa can la yema de los dedos, se invierte el giro de la muñeca y
se deja la tapa de la caja sobre la mesa junto al mechero. Sosteniendo la base entre los
dedos se vuelve a girar la muñeca y la superficie del medio de cultivo queda expuesta
al operador. En estas condiciones se puede observar la superficie del medio, tomar una
muestra, inocular con el asa, etc. Cualquiera que sea la operación debe hacerse en un
tiempo mínimo, ya que aunque se trabaje en la zona de seguridad del mechero, la
probabilidad de que los contaminantes lleguen aumenta al prolongar el tiempo de
exposición.
En caso de tener que transferir un volumen de líquido con una pipeta, se recomienda un
procedimiento diferente:
Se coloca la caja sobre la mesa, junto al mechero, con la tapa arriba y la base abajo, se
destapa suavemente con la mano izquierda al tiempo que se introduce la punta de una
pipeta y se descarga el volumen deseado. Inmediatamente después se retira la pipeta y
se coloca la tapa.
Otra forma de manipular las cajas de Petri, que se recomienda sólo después de tener
cierta habilidad y confianza en el trabajo es el de tomar la caja de petri con la mano
izquierda, en posición invertida, la base abajo y la tapa arriba, la base se apoya sobre
los dedos meñique y anular, mientras que la tapa se sostiene con los dedos índice y
pulgar y haciendo un movimiento de tijeras se abre una rendija por la cual se hace la
operación deseada. Con cierta práctica se puede abrir la caja casi por completo.

Aislamiento de colonias. Una vez que se ha depositado en la superficie del medio en la


caja de Petri el material que en general sirve de inóculo, se debe extender éste, para lo
cual se siguen diferentes procedimientos. Para aislar colonias, se extiende el inóculo
con el asa haciendo varios trazos en forma de secante cada vez mayor de la orilla hacia
el centro, pero solamente una distancia de 1 a 2 cm de la orilla. Se esteriliza el asa, se
deja enfriar o se introduce en el medio en un lugar que no interfiera con las siguientes
estrías. Se gira la caja de Petri un quinto de vuelta y con el asa esterilizada se hace una
nueva serie de estrías que deben extender una pequeña porción de la primera serie en
forma similar con trazos que vayan de la orilla hacia el centro. La operación se repite
dos veces más y en la quinta se hace una serie de estrías abiertas

Crecimiento uniforme o masivo en la superficie. En caso de requerir que ocurra un


crecimiento uniforme del inóculo, este se debe extender ya sea con el asa o con un
hisopo, haciendo numerosas estrías en todas direcciones o bien, con la ayuda de una
varilla de vidrio acocada, la cual se esteriliza flameándola después de introducirla en
alcohol, se deja enfriar y se hace un movimiento de vaivén sobre la superficie del medio
al tiempo que se hace girar varias veces la caja de petri sobre la mesa, extendiendo el
inóculo hasta cubrir toda la superficie.

Toma de muestras con pipeta. Se rompe el papel de envoltura cerca de la boquilla. Se


siguen los pasos correspondientes a la manipulación de tubos y matraces,
introduciendo en el liquido la punta de la pipeta, succionando el volumen deseado,
aforando a la marca correspondiente, se retira sin tocar las paredes, se flamea y tapa el
recipiente, manteniendo la punta de la pipeta dentro de la zona de seguridad del

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mechero. Se toma el recipiente al que se va a transferir el líquido manipulándolo como
se describió antes y se descarga el volumen deseado del contenido de la pipeta en el
recipiente. Esta operación debe ser muy rápida, pues el calor del mechero hace que el
aire dentro de la pipeta se dilate y expulse el líquido, lo que causa derrames
indeseables sobre la mesa, la bata u otros recipientes. La pipeta se debe desechar
introduciéndola en un recipiente con una solución desinfectante, después de lo cual se
puede lavar o si se quiere se puede esterilizar con todo el material sucio en el
autoclave. Alternativamente, se puede colocar nuevamente en la envoltura de papel en
la que se esterilizó, mientras se termina el trabajo y se dispone la esterilización de todo
el material sucio.

Toma de muestras e inoculación con hisopo. Un hisopo consiste de un palillo de


madera de unos 15 cm de largo, con un poco de algodón enredado en un extremo.
Estos instrumentos se esterilizan en tubos gruesos o envuelto en papel. Se saca un
hisopo cuidadosamente de su contenedor con la mano derecha sin tocar el extremo con
algodón, que servirá para impregnarse del material que interesa., se introduce el
extremo con algodón y se deja humedecer o empapar, se retira el hisopo son tocar las
paredes y se lleva a sui destino. Si es un medio líquido basta con un movimiento de
inmersión o extracción. Si es a un medio sólido se descarga humedeciendo la superficie
con un movimiento suave. Si se quiere conservar la muestra tomada en el hisopo se
introduce este en un tubo estéril ya sea seco o con un líquido conservador para su
transporte y se sujeta con el propio tapón del tubo, dejando fuera la parte que ha sido
tocada con los dedos. Una vez que se ha utilizado el hisopo, para desecharlo hay varios
caminos: se le sumerge en una solución desinfectante o se le pone en un recipiente
para su posterior esterilización o se incinera.

Preparación de medios de cultivo.


En la mayoría de las ocasiones, los medios de cultivo se adquieren comercialmente de
diversos proveedores y marcas, son preparados deshidratados en polvo, cuya
composición varía de acuerdo con las necesidades. En general, el fabricante señala la
cantidad de polvo que debe usarse por cada litro de medio de cultivo. En un recipiente
del doble del volumen que se desea preparar se pone el polvo y agua destilada para
disolverlo. Si el medio contiene agar se requiere del calentamiento hasta ebullición para
lograr la disolución del mismo, en el caso en que este medio deba ser utilizado para
preparar tubos inclinados. Cuando este agar se prepara para vaciar en cajas, esta
disolución no es necesaria, puesto que se alcanzará sin problemas durante la
esterilización. Hay que tener mucha precaución, ya que los medios con agar tienden a
hervir abrupta y violentamente, lo cual podría causar quemaduras graves del operador.
Por lo anterior, se recomienda que al realizar la ebullición del mismo, la boca del matraz
nunca apunte en dirección del operador y que éste utilice guantes de asbesto para su
protección y esté atento en todo momento del matraz.
El paso siguiente consiste en envasar los volúmenes convenientes en los tubos de
cultivo y esterilizarlos en autoclave. Si el medio se va a utilizar en cajas de petri, se tapa
con algodón el recipiente en que se disolvió, se cubre con papel y se esteriliza en
autoclave.

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Después de esterilizar.
a) Medios de cultivo líquidos. Los tubos y otros recipientes con medio de cultivo líquido
se sacan del autoclave y se dejan enfriar a temperatura ambiente.
b) Medios de cultivo sólidos. Los recipientes con medio sólido se sacan del autoclave y
se hace lo siguiente:
i) Si son tubos, se dejan enfriar en posición inclinada de tal modo que se forme
una superficie plana larga y que no alcance el límite del tapón de baquelita. Al enfriarse
se solidifica el medio de cultivo cuando alcanza una temperatura entre 40 y 45°C.
ii) Si son recipientes cuyo contenido se va a utilizar en cajas petri, se dejan enfriar
hasta alcanzar una temperatura de 45 a 50°C, y se p rocede a verter el medio todavía
líquido en las cajas estériles, en una operación aséptica cerca de la llama del mechero,
evitando la formación de burbujas. En caso de que se formen burbujas, se pueden
romper flameando ligeramente la superficie con el mechero. Cada caja puede contener
de 12 a 15 ml. Se dejan enfriar sobre la mesa hasta que el medio solidifique. Se
invierten para que la tapa quede abajo y la base arriba. Si no se utilizan en ese
momento, las cajas pueden mantenerse en refrigeración, debidamente etiquetadas y
selladas con papel parafilm, con la tapa hacia abajo y la base de la caja en la parte
superior.

Rotulado.
En todos los casos, se debe rotular cada portaobjetos, tubo, matraz, caja de Petri o
cualquier otro recipiente en el que se haga un cultivo, reactivo o prueba, con el fin de
conocer sin lugar a dudas lo que se tiene entre manos. Nunca se debe depositar toda la
confianza en la memoria.
En caso de que no hubiera espacio suficiente para poner todos los datos necesarios, se
debe utilizar una clave simple y confiable, que contenga la iniciales del operador,
material, cultivo, cepa, muestra o prueba y fecha. Esto mismo debe registrarse en el
cuaderno de trabajo en donde estarán explícitos todos los datos.

Material personal
Cada estudiante debe tener bata blanca de manga larga que cubra el frente, un
cuaderno de trabajo, lápices de colores, un rollo de cinta adhesivo, tijeras, pinzas de
disección de punta roma, asa y porta asa, botes de lamina (de los usados para
conservas y alimentos enlatados) y cerillos o encendedor.

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PRACTICA No. 1

Preparación del material para esterilizar

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TECNOLÓGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE ECATEPEC
DIVISIÓN DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA
ASIGNATURA: Microbiología Sanitaria CARRERA: Ingeniería Bioquímica

PRÁCTICA No. 1

PREPARACION DEL MATERIAL PARA ESTERILIZAR

I.- RELACIÓN DE CONOCIMIENTOS:

Conocimientos requeridos Conocimientos por adquirir

- Conceptos de microbiología general. - Metodologías adecuadas para el


- Bases teóricas de los manejo de materiales y muestras
procedimientos utilizados en el que contengan microorganismos.
laboratorio de microbiología. - Unificación de criterios para el
adecuado trabajo en microbiología,
de acuerdo al profesor que imparte
la materia

II.- OBJETIVO:

General
Preparar para esterilizar el material de vidrio más usado en el laboratorio de
Microbiología sanitaria. Conocer el material y equipo más común para la esterilización y
el trabajo en condiciones de esterilidad.

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III.- INTRODUCCIÓN:
La esterilización es un proceso mediante el cual se eliminan por muerte o remoción
todos los organismos viables de un objeto, superficie o medio. Un objeto libre de
cualquier forma de vida se dice que esta estéril. El concepto de esterilidad es absoluto,
es decir no existe un material casi, más o menos, o 99% estéril.
Para realizar un estudio de microorganismos en una muestra o área determinada en el
trabajo cotidiano de un laboratorio de microbiología es necesario que todo el material
utilizado, tal como pipetas, tubos de ensaye, cajas de Petri de vidrio o de plástico,
medios de cultivo y soluciones estén estériles. Por lo tanto el material a esterilizarse
deberá prepararse para que se conserve estéril. Existen varios métodos físicos y
químicos de esterilización. La selección de uno u otro depende de la naturaleza del
material que se piensa esterilizar. La tabla 1 muestra la clasificación de los métodos de
esterilización comúnmente utilizados en un laboratorio de microbiología, respecto a su
fundamento físico o químico, así como los materiales que se esterilizan por cada uno de
los métodos mencionados.

Tabla 1. Métodos de esterilización


Húmedo Vapor a presión (autoclave) →
medios líquidos.
Aire caliente (horno) → material de
Calor
Seco vidrio.
Flameado → asas bacteriológicas y
espátulas.
Métodos físicos
Filtros de membrana o filtros
Filtración
absolutos → sustancias termolábiles.
No Rayos ultravioleta
ionizantes Rayos infrarrojos
Radiaciones
Rayos X
Ionizantes
Rayos γ (cobalto-60)
Gases Oxido de etileno
Métodos químicos Formaldehído, β-propiolactona,
Líquidos
alcohol al 70%, benzal, etc.

La muerte de los organismos contaminantes ocurre principalmente por


desnaturalización de las macromoléculas (proteínas, RNA y DNA) y coagulación de
proteínas.
La esterilización con calor seco se usa principalmente para material de vidrio y

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materiales sólidos estables al calor, requiere mayor duración e intensidad porque la
conducción del calor es menos rápida que en un ambiente húmedo. La temperatura que
se utiliza es generalmente entre 160 y 180°C durant e 1.5 horas. Las cajas de Petri de
vidrio y las pipetas se colocan en cilindros de metal con aberturas que permitan el paso
del aire caliente. La inactivación de los contaminantes ocurre por pérdida de agua y
oxidación de todos sus componentes esenciales.
El calor húmedo destruye los microorganismos por coagulación de sus proteínas
celulares.
La filtración a través de membranas se usa para esterilizar soluciones de sustancias
termolábiles en donde los microorganismos son retenidos en el filtro. El filtrado estéril
debe recibirse en un recipiente también estéril.
En las campanas de flujo laminar que se usan como áreas estériles en el trabajo
microbiológico, el aire se esteriliza por filtración a través de mallas de fibras de diversos
materiales (filtros absolutos).

IV.- MATERIAL Y METODOLOGÍA:


El alumno determinará la cantidad de material que utilizará para comprender o recordar
la forma de preparar y esterilizar matraces, pipetas, cajas petri y medios de cultivo. La
lista de material de laboratorio será elaborada por el estudiante, una vez que haya
revisado con profundidad los métodos de esterilización antes mencionados, y haya
preparado una metodología adecuada que revise detenidamente con el profesor.
El alumno deberá desarrollar una adecuada búsqueda bibliográfica que le permita
generar un diagrama de flujo que lo guíe en esta etapa experimental. Con el uso de
dicho diagrama, el alumno determinará el orden en que desarrollará las actividades
dentro del laboratorio. Deberá considerar que esta práctica es sólo de repaso y que no
deberá durar más de una sesión. De esta forma, antes de realizar cualquier actividad,
deberá discutir con el profesor las actividades que pretende desarrollar. Las actividades
que deberá desarrollar para la construcción del diagrama de flujo son:

1. Preparación de tubos de vidrio y matraces con solución (solución salina o medio


de cultivo respectivamente) para esterilizar en la autoclave, siguiendo las reglas
básicas de la microbiología.

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2. Preparación de pipetas y cajas de petri para esterilizar en la autoclave y calor
seco.
3. Preparación del sistema de filtración en membrana para esterilizarlo en la
autoclave (sólo será demostrativo).
4. Conocimiento de las autoclaves y campanas de flujo laminar. Esto con el objetivo
de conocer o repasar su funcionamiento, para utilizarlas de manera adecuada en
las prácticas futuras.

V.- ANÁLISIS DE RESULTADOS:


- El alumno deberá analizar los resultados obtenidos de la experiencia de manera
comparativa para detectar ventajas y/o desventajas de los métodos empleados.
- El alumno deberá escribir el reporte científico con base en lo discutido en clase
con el profesor. Esta será la primera oportunidad que ambos tengan para revisar y
reformular el trabajo en el laboratorio, corrigiendo vicios futuros.

VI.- CONCLUSIONES:
Deben ir referidas al logro de los objetivos planteados al principio de la práctica.

VII.- CUESTIONARIO:

1. Cual es el método mas apropiado para esterilizar el siguiente material? ¿Porqué?

MATERIAL METODOLOGÍA
Solución de vitaminas
Cajas de Petri de plástico de desecho
Aceite mineral
Medios de cultivo para vaciar en cajas
petri
Membranas para filtración de sustancias
lábiles.
Solución de glucosa al 50%.

2. ¿Con qué finalidad se les pone a las pipetas un filtro de algodón?

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5. ¿Cual es el diámetro del poro en los filtros de esteres de celulosa utilizados para
esterilizar por filtración? y ¿Cuanto mide una bacteria de las mas pequeñas que
se conocen?
6. ¿Porqué las cajas de petri con un medio de cultivo sólido deben incubarse con la
tapa hacia abajo?
7. ¿Pasteurización es sinónimo de esterilización? Diga en qué casos se aplica la
Pasteurización. Fundamente la respuesta.

VIII.- BIBLIOGRAFÍA

No. Autor / Año Título Editorial / Edición

Ninth edition.
Madigan, M.; Martinko, J.; Biology of
1 Prentice Hall. Inc.
Parker, J. 2000 Microorganisms.
New Jersey
Esterilización: Métodos de Ed. EI Manual
2 Breach, M.R. 1976
Control. Moderno, S.A.
Manual of Methods for American Society for
3 Gerhardt, P. (Ed.). 1994. General and Molecular Microbiology.
Bacteriology Washington, D.C.
JM Jay, MJ Loessner, DA
4 Modern Food Microbiology Springer
Golden, DA Golden - 2005

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PRACTICA No. 2

Aislamiento y recuento de bacterias aerobias

TECNOLÓGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE ECATEPEC


DIVISIÓN DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA
ASIGNATURA: Microbiología Sanitaria CARRERA: Ingeniería Bioquímica

PRÁCTICA No. 3

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Determinación del contenido de proteínas en un alimento.

I.- RELACIÓN DE CONOCIMIENTOS:

Conocimientos requeridos Conocimientos por adquirir

- Clasificación de las bacterias - Metodologías adecuadas para aislar


- Características de las bacterias y cuantificar las bacterias contenidas
- Alimentos que contaminan las en un alimento.
bacterias. - Importancia del aislamiento y
cuantificación de bacterias
contaminantes de alimentos.

II.- OBJETIVO:

General
Obtener un cultivo axénico de una bacteria aerobia a partir de un alimento contaminado

Específicos
 Aprender y practicar las técnicas de aislamiento por medio de la estría cruzada y
el método de las diluciones.
 Realizar la estimación cualitativa y cuantitativa del contenido microbiano de
diferentes muestras de alimento.
 Obtener cultivos axénicos de las especies presentes en la muestra analizada.

III.- INTRODUCCIÓN:
Los microorganismos generalmente se encuentran en la naturaleza como poblaciones
mixtas y para poder caracterizar e identificar un tipo particular de microorganismo, este
debe ser aislado y conservado como un cultivo puro o axénico, que significa que esta
formado por microorganismos de la misma especie.
Para estudiar a los microorganismos de una muestra es importante considerar la
naturaleza de esta. Si es líquida se tendrá que homogenizar para distribuir a los
microorganismos en la misma y al tomar una alícuota esta sea representativa de la

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original. Si la muestra es sólida se deberá tratar de tal manera que se separen sus
componentes en un diluente para que se suspendan los microorganismos en el líquido.
Para el aislamiento de microorganismos se cuenta con varios métodos. Los más
usados son el método de la estría cruzada y el de las diluciones.
Las colonias aisladas presentan características morfológicas diferentes debido a que
cada grupo filogenético de microorganismos tiene características peculiares que se ven
influidas por las condiciones del medio. Una colonia se desarrolla en el medio sólido y
procede de una sola bacteria, espora o agrupación de microorganismos de la misma
especie, a los que se denomina unidades formadoras de colonias (UFC). Para calcular
el numero de UFC en una muestra procesada por el método de las diluciones, se
cuenta el numero de colonias formadas en las placas, de preferencia aquellas que
tengan entre 30 y 300, se determina el número de UFC contenidas en 1 mililitro de la
dilución usada para inocular cada placa y se multiplica por la inversa de la dilución
correspondiente.
No todos los microorganismos viables presentes en la muestra pueden cultivarse in
vitro; dependiendo de la muestra, se estima que solamente crecen en los diferentes
medios de cultivo entre un 20 y 50% de las especies presentes, y en casos como
ambientes extremos, solamente del 0.1 al 1 %. Esto es debido a que algunas de ellas
viven en simbiosis obligada, son inhibidas por microorganismos presentes, crecen muy
lentamente en los medios usados, son inhibidas por los componentes de los medios de
cultivo, tienen requerimientos nutricionales que el medio de cultivo no les proporciona,
etc.
Para el éxito del aislamiento de microorganismos a partir de muestras de ambientes
naturales también se puede requerir de medios de transporte especiales o de técnicas
de enriquecimiento previas, y medios de cultivo ricos, selectivos o diferenciales.
El oxigeno puede ser esencial para algunos microorganismos pero tóxico para otros. La
capacidad de los microorganismos para crecer en presencia o ausencia de oxigeno
está directamente relacionada con su metabolismo y con la presencia o ausencia de
enzimas que los protegen del efecto tóxico de los productos del oxigeno (por ejemplo,
superoxido dismutasa y catalasa). Con base en los requerimientos de oxigeno, los
microorganismos se han agrupado en aerobios estrictos, anaerobios facultativos,

16
anaerobios estrictos, anaerobios aerotolerantes y microaerofilicos.
Los microorganismos aerobios estrictos respiran usando al oxigeno como aceptor final
de electrones en su cadena respiratoria; los anaerobios facultativos pueden obtener su
energía tanto por procesos respiratorios como fermentativos, es decir, pueden tener
como aceptores finales de electrones al oxigeno o compuestos orgánicos. Los
microorganismos microaerofílicos requieren oxigeno pero a tensiones menores del
15 %.

IV.- MATERIAL.

El alumno determinará la cantidad de material que utilizará para homogenizar la


muestra del alimento que analizará, y desarrollar el análisis microbiológico adecuado.
Para lo anterior, deberá desarrollar un diagrama de flujo, que deberá ser discutido con
el profesor con base en el material bibliográfico consultado por el alumno.

V. METODOLOGÍA:
El alumno deberá hacer una extensa búsqueda bibliográfica que le indique el tipo de
bacterias que puede contener el alimento de su elección, y deberá plantear la
metodología adecuada para realizar dos actividades principales:
1. Aislamiento de bacterias por el método de las diluciones.
2. Aislamiento de bacterias por la técnica de la estría cruzada.
La búsqueda bibliográfica deberá incluir los fundamentos de cada uno de los métodos
de aislamiento de bacterias, mencionando pros y contras en cada caso.

VI.- ANÁLISIS DE RESULTADOS:

- El alumno deberá analizar los resultados obtenidos de manera comparativa para


detectar ventajas y/o desventajas de las determinaciones hechas.
- Deberá relacionar las características fisiológicas y morfológicas de las colonias
aisladas con los resultados de su búsqueda bibliográfica, para poder identificar
el tipo de bacteria que ha aislado.

17
- Se deberá conservar un tubo inclinado con el cultivo axénico de la cepa aislada,
para emplearlo en futuras prácticas. De preferencia, la cepa aislada no deberá
ser una especie patógena.

VII.- CONCLUSIONES:
Deben ir referidas al logro de los objetivos planteados en un principio, así como a las
características de la especie contaminante del alimento.
El alumno deberá concluir acerca de:
a) aspectos técnicos de la determinación realizada
b) efecto en la relación de variables seleccionadas, de haberlas.

VIII.- CUESTIONARIO:
1. ¿Por qué el método de las diluciones es cualitativo y cuantitativo?
2. ¿Por qué es importante el método de la estría cruzada para verificar la pureza de
un cultivo?
3. Mencione dos técnicas físicas y dos químicas de enriquecimiento para
microorganismos que estén en baja concentración en una muestra.
4. Si como se menciona en la introducción, el oxígeno molecular es un agente
oxidante muy tóxico, ¿cómo es que los microorganismos aerotolerantes lo
soportan a concentraciones tan altas como la atmosférica del 21%?

X.- BIBLIOGRAFÍA

No. Autor / Año Título Editorial / Edición

JM Jay, MJ Loessner, DA
1 Modern Food Microbiology Springer
Golden, DA Golden - 2005
Fundamental Food CRCV, Press,
2 Bibek Ray - 2004
Microbiology Tercera Edición

18
PRACTICA No. 3

Aislamiento y cultivo de hongos filamentosos y


levaduras

19
TECNOLÓGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE ECATEPEC
DIVISIÓN DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA
ASIGNATURA: Microbiología Sanitaria CARRERA: Ingeniería Bioquímica

PRACTICA No. 3

Aislamiento y cultivo de hongos filamentosos y levaduras

I.- RELACIÓN DE CONOCIMIENTOS:

Conocimientos requeridos Conocimientos por adquirir

- Clasificación de los hongos y las - Metodologías adecuadas para aislar


levaduras y cuantificar los hongos y levaduras
- Características fisiológicas y contenidos en un alimento.
morfológicas de hongos y levaduras - Importancia del aislamiento y
- Alimentos que contaminan los cuantificación de hongos y levaduras
hongos y las levaduras. contaminantes de alimentos.

II.- OBJETIVO:

General
Aislar, cultivar y reconocer la morfología colonial y microscópica de hongos y/o
levaduras obtenidos de muestras de distintos alimentos contaminados.

Específicos
 Aprender y practicar las diferentes técnicas utilizadas para el aislamiento de
hongos y levaduras a partir de una muestra de alimento.
 Realizar la estimación cualitativa y cuantitativa del contenido microbiano de
diferentes grupos de microorganismos de diferentes muestras de alimento.
 Obtener cultivos axénicos de las especies presentes en la muestra analizada.

20
III.- INTRODUCCIÓN:
Los hongos son microorganismos eucarióticos unicelulares o pluricelulares heterótrofos,
quimioorganotróficos, aerobios o anaerobios facultativos que se nutren por absorción. Con
base en las características morfológicas, forma de reproducción y modo de crecimiento,
los hongos se dividen en dos grandes gropos: hongos filamentosos y levaduras.
Los hongos filamentosos están constituidos por células cuyo diámetro de 1 a 30 µm y
tienen una pared celular constituida por polisacáridos, (quitina en su mayoría y celulosa en
los oomicetos) y forman filamentos o hifas las cuales son estructuras tubulares en cuyo
interior fluyen los organelos contenidos en el material citoplásmico y además presentan un
crecimiento apical (por las puntas o ápices). El conjunto de hifas se ramifica y forma una
red que se denomina micelio.
A lo largo de Ia hifa pueden presentarse invaginaciones, que se derivan de la pared, y
formar tabiques con un orificio central llamado poro. Al miceIio que presenta estos
tabiques se Ie denomina micelio septado.
Existe también un grupo importante de hongos fiIamentosos cuyas hifas carecen de
septos, así que más bien se Ie denomina micelio cenocítico o micelio continuo. En ambos
tipos de micelio se pueden encontrar células mono y multinucleadas. La presencia o
ausencia de septos o tabicaciones en el micelio constituye un criterio taxonómico.
Algunos hongos son capaces de producir pigmentos que cuando se acumulan en el
interior de las hifas dan origen al micelio pigmentado; este pigmento puede ser de tipo
carotenoide (cuando la estructura química del compuesto corresponde a los carotenos) o
bien fuliginoso (cuando se deriva de la melanina). El micelio hialino se puede observar en
los hongos que no producen ni acumulan ningún pigmento en el interior de sus hifas.
También existen en la naturaleza algunos hongos que producen pigmentos pero los
vierten al entorno, lo que provoca un cambio en el color del medio que los rodea.
Generalmente son inmóviles, aunque algunos poseen zoosporas móviles. Su
reproducción puede ser asexual por fragmentación en las formas filamentosas, por
gemación en las formas levaduriformes y por formación de esporas. También en muchos
hongos se han descrito la reproducción sexual ya sea con hifas homotálicas de hongos
hermafroditas o con hifas heterotálicas de hongos dióicos que inician la secuencia de la
plasmogamia, cariogamia, meiosis y formación de esporas sexuales. Las esporas de los

21
hongos, aunque son ligeramente más resistentes que el micelio vegetativo a las
condiciones de estrés (temperatura elevada, radiaciones, desecación, etc.), no son formas
de resistencia como las endosporas bacterianas sino más bien de propagación. Existe una
clasificación de las esporas de los hongos basada en su origen asexual o sexual y en la
forma de la estructura que los contiene.
Son microorganismos ubicuos como saprófitos, simbiontes, parásitos o hiperparásitos, las
enfermedades causadas por hongos se llaman micosis.
Los hongos tienen un crecimiento lento comparado con el de la mayoría de las bacterias.
Esto puede dificultar su aislamiento de fuentes naturales donde abundan las bacterias.
Para evitar el crecimiento de bacterias, se usan medios selectivos con altas
concentraciones de azúcar (4%) con un pH ácido (5 a 6) y con inhibidores del crecimiento
bacteriano (colorantes o antibióticos).las levadura, a diferencia de los hongos filamentosos
cuyo crecimiento es apical, tienen un tipo de crecimiento isodiamétrico, uniformemente
distribuido en toda la superficie de la célula. Se reproducen asexualmente por gemación
dando origen a dos células iguales e independientes. Esta forma de reproducción y
crecimiento da como resultado la formación de colonias con aspecto húmedo y
consistencia cremosa. La morfología macroscópica y microscópica de las levaduras es
completamente diferente a la de los hongos filamentosos, pero su ultraestructura es muy
parecida.
Los hongos son importantes desde el punto de vista industrial, ya que producen una gran
cantidad de metabolitos, tales como ácidos orgánicos, cetonas, enzimas, vitaminas,
antibióticos, etc.) de importancia en diversas industrias alimenticias y farmacéuticas.
Ciertos hongos se adicionan a quesos como el Roquefort, Camembert y Cabrales para
proporcionarles sabores, aromas y texturas especiales. Por otra parte, hay varios hongos
que producen micotoxinas en algunos alimentos que pueden provocar intoxicaciones
alimentarias y cáncer. Además, su presencia en algunos alimentos puede generar
pérdidas importantes para las industrias encargadas de transformar y comercializar dichos
alimentos. Algunas levaduras por su parte, son utilizadas para la elaboración de pan y en
la preparación de bebidas fermentadas, como la cerveza, el vino y la sidra.

22
IV.- MATERIAL.

El alumno determinará la cantidad de material que utilizará para homogenizar la


muestra del alimento que analizará, y desarrollar el análisis microbiológico adecuado.
Para lo anterior, deberá desarrollar un diagrama de flujo, que deberá ser discutido con
el profesor con base en el material bibliográfico consultado por el alumno.

V. METODOLOGÍA:
El alumno deberá hacer una extensa búsqueda bibliográfica que le indique el tipo de
hongos y/o levaduras que puede contener el alimento de su elección, y deberá plantear
la metodología adecuada para realizar cuatro actividades principales:
1. Aislamiento por diluciones del material biológico contenido en la muestra a analizar.
2. Cultivo y descripción de la morfología colonial de levaduras.
3. Descripción de la morfología colonial de los hongos filamentosos.
4. Observación de cigosporas (esporas sexuales).
La búsqueda bibliográfica deberá incluir los fundamentos de cada uno de los métodos
de aislamiento de estos microorganismos, mencionando ventajas y desventajas en
cada caso.

VI.- ANÁLISIS DE RESULTADOS:


- El alumno deberá analizar los resultados obtenidos de manera comparativa para
detectar ventajas y/o desventajas de las determinaciones hechas.
- Deberá relacionar las características fisiológicas y morfológicas de las colonias
aisladas con los resultados de su búsqueda bibliográfica, para poder identificar
el tipo de microorganismo que ha aislado.
- Se deberá conservar un tubo inclinado (levadura) o una caja petri (hongo) con el
cultivo axénico de la cepa aislada, para emplearlo en futuras prácticas. De
preferencia, la cepa aislada no deberá ser una especie patógena.

23
VII.- CONCLUSIONES:
Deben ir referidas al logro de los objetivos planteados en un principio, así como a las
características de la especie contaminante del alimento.
El alumno deberá concluir acerca de:
a) aspectos técnicos de la determinación realizada
b) efecto en la relación de variables seleccionadas, de haberlas.

VIII.- CUESTIONARIO:

1. Mencione tres ejemplos de hongos (género y especie) que tengan:


Importancia médica
a) Patógenos del hombre
Importancia agrícola
a) Patógenos de plantas
b) Formadores de micorrizas
Importancia industrial
a) Productores de ácidos orgánicos
b) Productores de antibióticos
Importancia alimentaria
a) Comestibles
b) Venenosos
c) Alucinógenos

2. Analice y discuta las dificultades e inconvenientes (no debidos a errores en la


realización de la técnica de las diluciones) que existen para contar hongos a partir de un
alimento determinado? Dicho de otro modo, ¿pueden contarse en forma confiable los
hongos filamentosos?.

3. Menciones tres diferencias entre las esporas de los hongos y las endosporas de
bacterias.

4. ¿Qué son una micorriza y un liquen? ¿En que se parecen y en que son diferentes?

5. Mencione cinco semejanzas y cinco diferencias entre los hongos y las bacterias.

24
X.- BIBLIOGRAFÍA

No. Autor / Año Título Editorial / Edición

The filamentous fungi. Vol. Ed. Arnold, Great


1 Smith, J.E. y Berry, D.R. 1975
1 Industrial Mycology Britain, London
Introducción a la
2 Wainwright. 1992 Biotecnología de los Ed. Acribia
hongos
Aspergillus: 50 years on.
Martinelli, S. y Kinghorn, J.R. Ed. Elsevier,
3 Progress and industrial
1997 Amsterdam
microbiology, vol 29.
JM Jay, MJ Loessner, DA
4 Modern Food Microbiology Springer
Golden, DA Golden - 2005

25
PRACTICA No. 4

Efecto de la actividad de agua sobre la viabilidad y el


crecimiento microbiano

26
TECNOLÓGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE ECATEPEC
DIVISIÓN DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA
ASIGNATURA: Microbiología Sanitaria CARRERA: Ingeniería Bioquímica

Práctica No. 4

Efecto de la actividad de agua sobre la viabilidad y el crecimiento microbiano

I.- RELACIÓN DE CONOCIMIENTOS:

Conocimientos requeridos Conocimientos por adquirir

- El concepto de actividad acuosa. - Desarrollo de experimentos que


- La clasificación de los permitan observar el efecto de la
microorganismos respecto a la actividad acuosa en la viabilidad y
actividad acuosa en la que crecen. crecimiento de los microorganismos.
- Métodos de conservación de
alimentos que tengan como
fundamento el control de la actividad
acuosa.

II.- OBJETIVO:
Observar el efecto de la baja actividad de agua promovida por elevadas
concentraciones de cloruro de sodio y sacarosa sobre el crecimiento microbiano.
Observar el efecto de la desecación sobre la viabilidad de varios microorganismos.

III.- INTRODUCCIÓN:
Todos los organismos requieren de agua para vivir. Sin embargo la disponibilidad
del agua en diferentes ambientes varia debido a que esta se puede encontrar
fuertemente adsorbida o en solución formando parte de la esfera de solvatación de una
molécula o ion. La disponibilidad del agua se expresa de diferentes maneras, pero la

27
más simple es mediante el término actividad de agua (aw). El agua destilada pura tiene
una aw = 1.0. Si se adiciona azúcar, 1a actividad de agua disminuye. Así por ejemplo, el
jarabe de arce (maple) tiene una actividad de agua de 0.9. Del mismo modo, una
solución saturada de cloruro de sodio tiene una aw de 0.8 (Tabla 1). La actividad de
agua es un índice del agua disponible que puede ser utilizada por los microorganismos.
Cada microorganismo tiene requerimientos de aw que permiten su proliferación.
Algunas bacterias, hongos y las levaduras son capaces de crecer mejor en medios con
una actividad de agua baja. Hay microorganismos, conocidos como xerotolerantes, que
pueden crecer a aw muy baja, como algunas levaduras que crecen en soluciones
concentradas de azúcar con una aw de 0.60. Sin embargo esas mismas levaduras son
incapaces de crecer con una aw de 0.98 conseguida con la adición de NaCl. Como regla
general, los hongos son capaces de crecer en aw más bajas que otros
microorganismos, como las bacterias, y es por esta razón que pueden ser encontrados
creciendo en la superficie de miel, jaleas, mermeladas o frutas deshidratadas. La
incapacidad de la mayoría de los microorganismos para crecer en bajas aw es
aprovechada para la conservación de alimentos en salmueras, almíbares, salados o
azucarados.
La variación en la concentración del soluto no sólo altera la disponibilidad de
agua, sino también la presión osmótica, que es 1a fuerza que resulta de las diferencias
en la concentración de soluto en ambos lados de una membrana.
E1 interior de las células tiene concentraciones de solutos más altas que la
mayoría de los ambientes naturales y medios de laboratorio, por lo que existe una
constante tendencia a que entre agua, creando una presión osmótica de dentro hacia
afuera. Esta presión no destruye la integridad de la membrana debido a que la pared
celular compensa esa fuerza. En ausencia de esta envoltura las células se romperían.
En cambio, el aumento en la concentración externa de soluto por arriba de la
encontrada en el interior de la célula, promueve la salida del agua, lo que provoca una
disminución del volumen 10 que hace que e1 citoplasma se encoja y la membrana se
separe de la pared. Este fenómeno se denomina plasmolisis y la pérdida de agua
disminuye y detiene el metabolismo y la división celular, aunque las bacterias no
mueren de inmediato (efecto bacteriostático). Esta es la razón por la que los alimentos

28
conservados por desecación no son estériles, ya que contienen una población
microbiana en estado latente que puede crecer y dañar el producto, después de que
este es reconstituido con agua.
Los organismos que pueden proliferar aunque mas lentamente (con una
velocidad de crecimiento menor) en medios con altas concentraciones de solutos (baja
actividad de agua), se denominan osmotolerantes. En cambio, los osmofílicos requieren
para su crecimiento óptimo concentraciones elevadas de solutos. Específicamente, se
les denomina halofílicos y sacarofílicos cuando son el NaCI y la sacarosa
respectivamente los solutos requeridos. Algunas arqueas halofílicas extremas como
Halobacterium y Halococcus requieren concentraciones de saturación de NaCl
(aproximadamente 25%).

IV.- MATERIAL.

El alumno determinará la cantidad de material que utilizará para homogenizar la


muestra del alimento que analizará, y desarrollar el análisis microbiológico adecuado.
Para lo anterior, deberá desarrollar un diagrama de flujo, que deberá ser discutido con
el profesor con base en el material bibliográfico consultado por el alumno.

V. METODOLOGÍA:
El alumno deberá hacer una extensa búsqueda bibliográfica que le indique los tipos de
microorganismos que puede contener un alimento de acuerdo a su actividad acuosa, y
clasificará a los cultivos axénicos que obtuvo en las prácticas anteriores de acuerdo a
este criterio. Posteriormente, deberá plantear la metodología adecuada para realizar
tres actividades principales:
1. Determinar el efecto del cloruro de sodio sobre el crecimiento de los
microorganismos.
2. Determinar el efecto de la sacarosa sobre el crecimiento de los microorganismos.
3. determinar el efecto de la desecación sobre el crecimiento de los microorganismos.
La búsqueda bibliográfica deberá incluir los fundamentos de cada uno de los métodos
utilizados, lo cual facilitará la discusión de resultados por parte del alumno.

29
VI.- ANÁLISIS DE RESULTADOS:
- El alumno deberá analizar los resultados obtenidos de manera comparativa para
determinar el nivel de actividad acuosa en el que los microorganismos de sus
cultivos axénicos pueden ser o no viables.
- Deberá analizar los distintos métodos de conservación de alimentos que
emplean el control de la actividad acuosa como posibles agentes capaces de
reducir o erradicar la contaminación de alimentos por los microorganismos con
los que cuenta en sus cultivos axénicos.

VII.- CONCLUSIONES:
Deben ir referidas al logro de los objetivos planteados en un principio, así como a las
características de los cultivos axénicos respecto a la actividad acuosa en la que son
capaces de crecer.
El alumno deberá concluir acerca de:
a) aspectos técnicos de los experimentos desarrollados
b) efecto en la relación de variables seleccionadas, de haberlas.

VIII.- CUESTIONARIO:

1. Defina el témino "actividad de agua".


2. Mencione el nombre (género y especie) de tres bacterias osmofílicas, indicando
si se trata de bacterias halofílicas o sacarofílicas.
3. Diga si Ia deshidratación de alimentos, Ia cual crea un efecto de disminución en
Ia actividad de agua, resulta en una esterilización de los mismos. Discuta su
respuesta.
4. Cual será Ia utilidad práctica de conocer Ia actividad de agua a la que se
desarrolIan los microorganismos?
5. Si usted desea aislar una levadura sacarofílica, ¿dónde la buscaría?
6. Mencione !as estructuras bacterianas que determinan la resistencia a la baja
actividad de agua originada por la desecación.

30
7. Diga tres nombres (género y especie) de microorganismos resistentes a la
desecación y tres de sensibles a ella.

IX.- BIBLIOGRAFÍA

No. Autor / Año Título Editorial / Edición

Osmoregulation through
acumulation and Release of
Bremer E. Y R Kramer. Compatible Solutes in ASM Press,
1
2000. Bacteria. En Bacterial Stress Washington., D.C.
Responses. Edit. por G.
Storz y R Hengge Aronis
Strategies for microbial
growth at reduced water
2 Hocking, H.D. 1988
activities. Micr. Sciences
5:280-284
What is the true internal
environment of halophilic and
3 Kushner, D.l 1988.
other bacteria? Can. J.
Microbiol. 34:482-487.
JM Jay, MJ Loessner, DA
4 Modern Food Microbiology Springer
Golden, DA Golden - 2005

31
PRÁCTICA No.5

Efecto de la temperatura de incubación sobre el


crecimiento microbiano.

32
TECNOLÓGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE ECATEPEC
DIVISIÓN DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA
ASIGNATURA: Microbiología Sanitaria CARRERA: Ingeniería Bioquímica

PRÁCTICA No.5

Efecto de la temperatura de incubación sobre el


crecimiento microbiano.

I.- RELACIÓN DE CONOCIMIENTOS:

Conocimientos requeridos Conocimientos por adquirir

- La clasificación de los - Desarrollo de experimentos que


microorganismos respecto al rango de permitan observar el efecto de la
temperaturas en el que son capaces temperatura de
de sobrevivir y desarrollarse. cocción/almacenamiento sobre la
- Métodos de conservación de viabilidad y crecimiento de los
alimentos que tengan como microorganismos.
fundamento el control de la
temperatura de
cocción/almacenamiento de los
alimentos.

II.- OBJETIVO:

Observar el efecto de la temperatura de cocción/almacenamiento sobre el crecimiento y


determinar la temperatura de crecimiento óptimo de los microorganismos con los que se
cuenta.

33
III.- INTRODUCCIÓN:
La temperatura es un factor ambiental que afecta todas las reacciones bioquímicas y
por lo tanto el crecimiento de los organismos.
Los límites de temperatura dentro de los cuales pueden encontrarse organismos vivos
son amplios y van desde temperaturas menores a 0 °C hasta superiores a 100 °C
(Tabla 1). En general, los organismos eucarióticos tienen limites superiores de
temperatura de crecimiento menores a los de los procarióticos, y entre estos, las
arqueas tienen los límites superiores de crecimiento más elevadas. Algunos
microorganismos crecen en intervalos de temperatura muy estrechos por lo que se les
denomina estenotérmicos, como Neisseria gonorrhoeae que crece entre 30 y 38 °C.
Otros procarióticos crecen en intervalos de temperatura muy amplios por lo que se les
conoce como euritérmicos, como Enterococcus faecalis capaz de crecer entre 0 y 44
°C.
Todos los microorganismos tienen temperaturas mínima, óptima y máxima de
crecimiento a las que se conocen como las temperaturas cardinales. De acuerdo con
las temperaturas cardinales (principalmente la óptima de crecimiento), los
microorganismos se han clasificado en psicrofílicos, psicrotróficos o psicrofílicos
facultativos, mesofílicos, termofílicos y termofílicos extremos.
Algunos ambientes naturales en los que se pueden encontrar microorganismos
psicrofílicos son los océanos, las regiones polares y de alta montaña. Una de las
adaptaciones que poseen los microorganismos psicrofílicos radica en la alta proporción
de lípidos insaturados de la membrana celular que permiten que esta estructura se
mantenga fluida a temperaturas cercanas al punto de congelación del agua. Los hongos
y bacterias psicrotróficos o psicrofílicos facultativos son los principales causantes de la
descomposición de la comida refrigerada, aunque también los podemos encontrar en
forma natural en el suelo y en el agua. Los microorganismos mesofílicos posiblemente
sean son los mas ampliamente distribuidos en la naturaleza; a este grupo pertenecen
casi todos los microorganismos patógenos para los humanos. Los termofílicos y
termofílicos extremos pueden encontrarse en manantiales termales y fumarolas
volcánicas terrestres y marinas. Las adaptaciones que tienen los microorganismos

34
termofílicos son múltiples e incluyen una alta proporción de ácidos grasos saturados en
la membrana celular, como en el caso de las arqueas, la membrana celular está
compuesta por lípidos atípicos que forman una monocapa con una mayor rigidez y
estabilidad que en una bicapa. Asimismo los termofílicos poseen proteínas, enzimas y
ácidos nucléicos que son estables a temperaturas altas. Las temperaturas bajas son
utilizadas como una forma para limitar el crecimiento microbiano y así conservar las
cepas, las macromoléculas y productos con actividad biológica.
Los microorganismos termofílicos están siendo utilizados cada vez más en procesos de
fermentación; con arqueas metanógenas se hace el tratamiento microbiano anaerobio
de desechos sólidos, líquidos o sustancias recalcitrantes. Actualmente varias enzimas,
entre ellas amilasas, isomerasas, proteasas y celulasas obtenidas de termofílicos, se
usan en procesos industriales. Asimismo, varias enzimas que se usan en ingeniería
genética se están comercializando, como las DNA polimerasas, Taq de Termus sp., las
Pfu de Pyrococcus furiosus, la Tbr de Thermus brockianus y Vent de Thermococcus
litorales usadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR); la transcriptasa
reversa Tht de Thermus thermophilus; la RNA polimerasa de Thermus sp.; y varias
enzimas de restricción de Thermus sp., Bacillus sp., y Sulfolobus sp.
Es importante reconocer la diferencia que existe entre un organismo termofílico y uno
termorresistente. Un microorganismo termofílico es aquel que requiere temperaturas
elevadas para su crecimiento individual y poblacional, mientras que un termorresistente
es aquel que soporta altas temperaturas. Los termorresistente pueden ser psicrofilicos o
mesofílicos incapaces de crecer a altas temperaturas. La termorresistencia suele estar
relacionada a la presencia de endosporas.

IV.- MATERIAL.

El alumno determinará la cantidad de material que utilizará para homogenizar la


muestra del alimento que analizará, y desarrollar el análisis microbiológico adecuado.
Para lo anterior, deberá desarrollar un diagrama de flujo, que deberá ser discutido con
el profesor con base en el material bibliográfico consultado por el alumno.

35
V. METODOLOGÍA:
El alumno deberá hacer una extensa búsqueda bibliográfica que le indique los tipos de
microorganismos que puede contener un alimento de acuerdo a su temperatura de
acocción/almacenamiento, y clasificará a los cultivos axénicos que obtuvo en las
prácticas anteriores de acuerdo a este criterio. Posteriormente, deberá plantear la
metodología adecuada para realizar la siguiente actividad:
1. Determinar el efecto de utilizar diferentes temperaturas sobre el crecimiento del
microorganismo, utilizando experimentos independientes que se trabajen a las mismas
condiciones de concentración de medio de cultivo, así como porcentaje de inóculo
La búsqueda bibliográfica deberá incluir los fundamentos de cada uno de los métodos
utilizados, lo cual facilitará la discusión de resultados por parte del alumno.

VI.- ANÁLISIS DE RESULTADOS:


- El alumno deberá analizar los resultados obtenidos de manera comparativa para
determinar el rango de temperatura en el que los microorganismos de sus
cultivos axénicos pueden ser o no viables.
- Deberá analizar los distintos métodos de conservación de alimentos que
emplean el control de la temperatura de cocción/incubación como posibles
agentes capaces de reducir o erradicar la contaminación de alimentos por los
microorganismos con los que cuenta en sus cultivos axénicos.

VII.- CONCLUSIONES:

Deben ir referidas al logro de los objetivos planteados en un principio, así como a las
características de los cultivos axénicos respecto al rango de temperaturas en los que
son capaces de crecer.
El alumno deberá concluir acerca de:
a) aspectos técnicos de los experimentos desarrollados
b) efecto en la relación de variables seleccionadas, de haberlas.

36
VIII.- CUESTIONARIO:

1. ¿Qué ventajas tiene realizar un proceso de fermentación para la obtención de un


metabolito de interés industrial a altas temperaturas?
2. En 1983 en la revista más prestigiada del ambiente científico, Nature (303: 423-
426), J. A. Baross y J.W. Deming publicaron un artículo titulado “Growth of “Black
smoker” bacteria at temperaturas of at least 250ºC”. Discute la posibilidad de vida
a estas temperaturas desde un punto de vista químico.

IX.- BIBLIOGRAFÍA

No. Autor / Año Título Editorial / Edición

JM Jay, MJ Loessner, DA
1 Modern Food Microbiology Springer
Golden, DA Golden - 2005
Fundamental Food CRCV, Press,
2 Bibek Ray - 2004
Microbiology Tercera Edición

37
PRÁCTICA No.6

Influencia del pH sobre el crecimiento microbiano.

38
TECNOLÓGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE ECATEPEC
DIVISIÓN DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA
ASIGNATURA: Microbiología Sanitaria CARRERA: Ingeniería Bioquímica

PRÁCTICA No.6

Influencia del pH sobre el crecimiento microbiano.

I.- RELACIÓN DE CONOCIMIENTOS:

Conocimientos requeridos Conocimientos por adquirir

- La clasificación de los - Desarrollo de experimentos que


microorganismos respecto al rango de permitan observar el efecto del pH
pH en el que son capaces de sobre la viabilidad y crecimiento de los
sobrevivir y desarrollarse. microorganismos.
- Métodos de conservación de
alimentos que tengan como
fundamento el control del pH de los
alimentos.

II.- OBJETIVO:

Observar el efecto del pH del medio de cultivo sobre el crecimiento y determinar el pH


de crecimiento óptimo de los microorganismos con los que se cuenta.

III.- INTRODUCCIÓN:
El pH de una solución representa a la concentración molar de iones hidrogeno [H+]
expresada como logaritmo negativo según la ecuación:

[ ]
pH = − log H +

La escala de valores de pH va de 0 a 14. Una so1ución es neutra cuando tiene un valor

39
de pH de 7.0, acida con un pH menor a 7.0 y alcalina con un pH mayor de 7.0.
El crecimiento microbiano depende del valor de pH en el medio de cultivo. Todos los
microorganismos tienen un intervalo de crecimiento específico fuera del cual su
multiplicación se detiene y en ocasiones mueren.
El metabolismo fermentativo de azúcares de los microorganismos produce y acumula
ácidos orgánicos que disminuyen el pH del medio de cultivo, lo que puede detener el
crecimiento microbiano aun cuando el medio contenga suficientes nutrientes. Por otro
lado, los microorganismos pueden degradar proteínas, aminoácidos y otras sustancias
nitrogenadas liberando amonio que alcaliniza el medio, lo que afecta el desarrollo
microbiano. Estos efectos pueden ser minimizados adicionando reguladores o
amortiguadores de pH al medio.
Los microorganismos, de acuerdo con los pHs que requieren para su crecimiento se
pueden clasificar como acidofilicos, neutrofilicos o alcalofilicos. Se dice que los
acidofilicos y alcalofilicos son obligados cuando son incapaces de crecer o mueren en
un pH cercano a la neutralidad.
En la naturaleza existen ambientes con pHs que van desde 1 hasta 12 y a partir de
ellos se han podido aislar microorganismos. Asi, existen bacterias que requieren un pH
cercano a la neutralidad y que son incapaces de crecer a un pH menor de 5.5 o mayor
de 9. Otros microorganism os procarióticos son acidofilicos obligados, como la bacteria
Thiobacillus y las arqueas Sulfolobus y Thermoplasma requieren de un pH de 1 a 2
para crecer, o como Alcaligenes, que requiere un pH de 10 para desarrol1arse. La
mayoría de los hongos y levaduras requieren de medios ligeramente ácidos para su
crecimiento óptimo o esporulación.
En los microorganismos no adaptados a condiciones extremas de pH este puede
afectar la estructura de la membrana, pared celular y membrana externa, cambiar la
conformación de las enzimas inhibiendo su actividad o precipitándolas, afectar el
metabolismo central, el transporte de sustancias nutritivas o los mecanismos de
acoplamiento del ATP. Asimismo los microorganismos acidofilicos extremos obligados
pierden la estabilidad de su membrana y se destruyen cuando se transfieren a medios
con un pH neutro.
Existen varias pruebas bioquímicas útiles para la identificación de microorganismos

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basadas en la capacidad que tienen algunos de ellos para fermentar ciertos substratos,
producir ácidos orgánicos y modificar el pH del cultivo.
La capacidad del pH acido para limitar el crecimiento microbiano es utilizada en la
industria alimenticia para conservar bebidas y alimentos. Thiobacillus que produce
H2S04 se utilizan en minería para liberar metales a partir de los minerales. Helicobacter
en el estómago es el responsable de las úlceras gástricas y posiblemente uno de los
factores que desencadena cáncer en esa localización.

IV.- MATERIAL.

El alumno determinará la cantidad de material que utilizará para homogenizar la


muestra del alimento que analizará, y desarrollar el análisis microbiológico adecuado.
Para lo anterior, deberá desarrollar un diagrama de flujo, que deberá ser discutido con
el profesor con base en el material bibliográfico consultado por el alumno.

V. METODOLOGÍA:
El alumno deberá hacer una extensa búsqueda bibliográfica que le indique los tipos de
microorganismos que puede contener un alimento de acuerdo a su pH, y clasificará a
los cultivos axénicos que obtuvo en las prácticas anteriores de acuerdo a este criterio.
Posteriormente, deberá plantear la metodología adecuada para realizar la siguiente
actividad:
1. Determinar el efecto de utilizar diferentes pHs sobre el crecimiento del
microorganismo, utilizando experimentos independientes que se trabajen a las mismas
condiciones de concentración de medio de cultivo, así como porcentaje de inóculo.
La búsqueda bibliográfica deberá incluir los fundamentos de cada uno de los métodos
utilizados, lo cual facilitará la discusión de resultados por parte del alumno.

VI.- ANÁLISIS DE RESULTADOS:


- El alumno deberá analizar los resultados obtenidos de manera comparativa para
determinar el rango de pH en el que los microorganismos de sus cultivos
axénicos pueden ser o no viables.

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- Deberá analizar los distintos métodos de conservación de alimentos que
emplean el control del pH como posibles agentes capaces de reducir o erradicar
la contaminación de alimentos por los microorganismos con los que cuenta en
sus cultivos axénicos.

VII.- CONCLUSIONES:

Deben ir referidas al logro de los objetivos planteados en un principio, así como a las
características de los cultivos axénicos respecto al rango de pH en los que son capaces
de crecer.
El alumno deberá concluir acerca de:
a) aspectos técnicos de los experimentos desarrollados
b) efecto en la relación de variables seleccionadas, de haberlas.

VIII.- CUESTIONARIO:

1. De acuerdo con los resultados de la práctica, ¿en qué grupo clasificaría cada
una de las cepas estudiadas y por que?
2. Cómo demostraría que el pH de un medio de cultivo detuvo el crecimiento aún
en presencia de nutrientes?
3. Mencione 3 metabolitos microbianos que aumentan y 3 que disminuyen el pH del
medio de cultivo.
4. ¿Cómo podría formular un medio de cultivo de pH neutro que en forma visible
indique que se alcanza un pH ácido?
5. Mencione 3 indicadores químicos del pH.
6. ¿Qué son los reguladores de pH y qué efecto tienen en el crecimiento?

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IX.- BIBLIOGRAFÍA

No. Autor / Año Título Editorial / Edición

JM Jay, MJ Loessner, DA
1 Modern Food Microbiology Springer
Golden, DA Golden - 2005
Fundamental Food CRCV, Press,
2 Bibek Ray - 2004
Microbiology Tercera Edición

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Proyecto de Investigación

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TECNOLÓGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE ECATEPEC
DIVISIÓN DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA
ASIGNATURA: Microbiología Sanitaria CARRERA: Ingeniería Bioquímica

Proyecto de Investigación

I.- RELACIÓN DE CONOCIMIENTOS:

Conocimientos requeridos Conocimientos por adquirir

Todos los conocimientos teóricos Desarrollo de un producto alimenticio que


aprendidos en el curso, las herramientas incluya buenas prácticas de laboratorio y el
desarrolladas durante la realización de las sistema de análisis de puntos críticos de
prácticas anteriores control, como factores que afectan la
calidad final del producto.

II.- OBJETIVO:

Que los estudiantes de séptimo semestre de la carrera de Ingeniería Bioquímica


adquieran la capacidad de desarrollar un proyecto de investigación aplicada enfocado
hacia la innovación y/o mejora de un producto alimenticio, aplicando los conocimientos
adquiridos en relación a la calidad microbiológica de los alimentos, así como la
aplicación de los controles de calidad (nutricional y sensorial) en materia prima y
producto terminado.

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III. Metodología:

Esta actividad será muy guiada por el profesor, deberá hacerse hincapié en las
características de un proyecto de investigación, antes de iniciar el trabajo experimental,
será necesario presentar un protocolo de investigación para evaluar sus alcances y
objetivos. Las hipótesis que se establezcan en el proyecto, deberán ser el resultado de
un análisis minucioso del tema de estudio.

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