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Medida del crecimiento

El crecimiento de una poblacin bacteriana puede ser entendido desde diferentes


perspectivas y de acuerdo a stas se puede llegar a determinar la medida del
crecimiento mediante diversas metodologas.

Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las clulas
individuales, esto es iniciar y completar una divisin celular. De esta forma, se
considera a los microorganismos como partculas discretas y el crecimiento es
entendido como un aumento en el nmero total de partculas bacterianas. Existen
dos formas para determinar el nmero total de microorganismos en una muestra:

Recuento microscpico de partculas


Recuento electrnico de partculas

Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de


formar colonias debido a que slo se tiene en cuenta el nmero de microorganismos
viables, esto es capaces de crecer indefinidamente. Las determinaciones que se
utilizan son:

Recuento de colonias
Mtodo del nmero ms probable

Para los fisilogos bacterianos, bioqumicos y bilogos moleculares una medida del
crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos, la sntesis macromolecular y un
incremento en la capacidad para la sntesis de los componentes celulares es una
medida del crecimiento. Para este grupo la divisin celular es un proceso esencial
pero menor que rara vez limita el crecimiento, ya que lo que limita el crecimiento es
la capacidad del sistema enzimtico para utilizar los recursos del medio y formar
biomasa.

Determinacin de peso hmedo


Determinacin de peso seco
Determinacin de nitrgeno total
Determinacin qumica de un cido nucleico

Un ltimo grupo entiende al crecimiento sobre la base de la influencia que ejercen


los microorganismos en los cambios qumicos de su entorno como consecuencia del
incremento de la biomasa.

Recuentos Directos

Recuento microscpico: Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un


equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de microbiologa. Para estos
recuentos se utilizan generalmente cmaras de recuentos, aunque tambin pueden
realizarse a partir de muestras filtradas en membranas y transparentadas o teidas
con colorantes fluorescentes (Naranja de acridina).

La mayor dificultad del recuento en cmara es obtener reproducibilidad en el llenado


de la cmara con lquido. Otra dificultad es la adsorcin de las clulas en las
superficies del vidrio, incluyendo pipetas. Esta adsorcin es crtica en el proceso de
dilucin de la muestra y se minimiza al realizar las diluciones en medios de alta
fuerza inica (solucin fisiolgica o medios mnimos sin fuente de carbono).

Las cmaras ms utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-Hausser. La


primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersin, aunque
la mayora de los recuentos se realizan con objetivos secos. Una de las mayores
ventajas del recuento microscpico es brindar informacin adicional sobre el tamao
y la morfologa de los objetos contados.

Camara de recuento de Petroff-Hausser

Area Volumen Factor


Tipo de cuadro
[cm2] [ml] [1/Volumen]
Cuadrado total 1.00 x 10-2 2.00 x 10-5 5.00 x 104
Cuadrado grande 4.00 x 10-4 8.00 x 10-7 1.25 x 106
Cuadrado pequeo 2.50 x 10-5 5.00 x 10-8 2.00 x 107

1/Dilucin: Inversa de la dilucin utilizada para llenar la cmara de recuento.


Nmero de cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la cmara que
se utilizaron para contar un el nmero de bacterias.
Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de la cmara. Depende
del tipo de cuadrado en donde se realiz el recuento. Por ejemplo, cada
cuadrado pequeo tiene un volumen de 5 x 10-8 ml (50 m x 50 m x 20 m
= 5 x 104 m3 = 5 x 10-8 ml)

Recuento electronico: Los contadores electrnicos permiten realizar recuentos de


bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y
microorganismos filamentosos o miceliares.

Estos instrumentos constan bsicamente de dos compartimientos comunicados a


travs de un pequeo conducto. En ambos compartimientos hay electrodos que
miden la resistencia elctrica del sistema, y como el orificio del conducto es muy
pequeo y su resistencia es muy alta, la resistencia elctrica de cada compartimiento
es independiente. El principio de funcionamiento de estos instrumentos es el que se
explica a continuacin. Un volumen fijo de una suspensin bacteriana es forzada a
pasar desde un compartimiento al otro a travs del pequeo conducto, en un muy
breve intervalo de tiempo. Cuando un microorganismo pasa al nuevo
compartimiento, la resistencia de ste se incrementa debido a que la conductividad
de la clula es menor que la del medio. Estos cambios en la resistencia son
convertidos en pulsos o voltaje y contados.

Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes. Ciertas bacterias muy


pequeas producen cambios en la resistencia que son comparables al "ruido"
generado por la turbulencia que se desarrolla al pasar el fluido por el orificio. No
pueden medirse clulas que formen filamentos o agregados o soluciones muy
concentradas de microorganismos, debido a que el pasaje de ms de una clula en
un breve perodo de tiempo va a ser tomado como una clula ms grande. Es comn
la obstruccin del orificio por microorganismos muy grandes.

Medida de la Biomasa

La medida de la masa de los constituyentes de la clula bacteriana es utilizada


frecuentemente como base para la medida de una actividad metablica, o de un
constituyente metablico o qumico.

Algunos de los mtodos para cuantificar la biomasa son obvios y confiables, pero
pueden volverse complicados si se busca la exactitud.

Peso hmedo: Se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es pesada


luego de la separacin de las clulas por filtracin o centrifugacin. Es una tcnica
til para grandes volmenes de muestra.

La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular


y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de lquido retenida puede ser
importante, por ejemplo, un pellet de clulas bacterianas muy empaquetadas puede
contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la
forma y deformacin celular. Para corregir el peso hmedo se determina la cantidad
de lquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugacin,
para ello se utilizan soluciones de polmeros no inicos (como el Dextran) que
pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes
bacterianas.

Peso seco: El peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas que se
encuentran en una suspensin se obtiene por el secado de un volumen en un horno
a 105C hasta peso constante. Esta tcnica es til para grandes volmenes de
muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso
de un gran nmero de bacterias.

La desventaja de este mtodo es que componentes voltiles de la clula pueden


perderse por el secado y puede existir alguna degradacin. Tambin la muestra seca
puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una
humedad relativa alta.

Determinacin de cidos nucleicos: Es una tcnica que permite determinar


indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. Se determina la cantidad
existente de un determinado cido nucleico (generalmente DNA) y a partir de este
dato se estima la masa de la poblacin.

Determinacin de nitrgeno: Es una tcnica que permite determinar indirectamente


la masa de una poblacin bacteriana. Existen distintas tcnicas para determinar la
cantidad de nitrgeno que contiene una muestra con relacin al compuesto que se
quiera determinar. Puede analizarse el nitrgeno no proteico mediante el NO2-, NO3-,
NH4+, el nitrgeno proteico mediante absorcin en UV, Reaccin de Biuret, Reaccin
de Lowry, o el nitrgeno total mediante la Digestin de Kjeldahl.

Incorporacin de precursores radiactivos: Es una tcnica que permite determinar


indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. En esta tcnica se adiciona al
medio un compuesto marcado radiactivamente que puede ser incorporado a la
clula, y luego se determina la cantidad de marca incorporada por toda la poblacin.

Dispersin de la Luz

Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partcula en suspensin, parte
de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida.
La nefelometra mide la luz dispersada por una solucin de partculas. La
turbidimetra mide la luz dispersada como un decrecimiento de la luz transmitida a
travs de la solucin. Con relacin a la longitud de onda y al tamao de la partcula
pueden existir tres tipos de dispersin.

Los mtodos de dispersin de la luz son las tcnicas ms utilizadas para monitorear
el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy tiles y poderosos pero pueden
llevar a resultados errneos. Principalmente, dan informacin sobre el peso seco
(contenido macromolecular).

Turbidimetra: La turbidimetra mide la reduccin de la transmisin de luz debido a


partculas de una suspensin y cuantifica la luz residual transmitida.

Estudios tericos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de


diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamao celular, tienen casi la
misma absorbancia por unidad de concentracin de peso seco. Esto quiere decir
que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso
seco, independientemente del tamao celular del microorganismo. Sin embargo, se
encuentran absorbancias muy diferentes por partcula o por UFC (Unidad Formadora
de Colonia) cuando los tamaos de las clulas bacterianas son diferentes. Por esta
razn, para estimar el nmero de microorganismos totales o el nmero de
microorganismos viables de una suspensin bacteriana debe realizarse una "curva
de calibracin" con cada tipo de microorganismo, slo de esta forma es posible
relacionar Absorbancia (Densidad ptica) con el nmero de microorganismos totales
o con UFC.
Absorbancia en funcin del Peso Seco

Absorbancia = K x Peso Seco

K: constante que vara con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del
peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de
la absorbancia (1/W 0).

Peso seco: Concentracin celular bacteriana expresada en unidades de peso seco


(g/ml-mg/ml).

La relacin directa entre la absorbancia y el peso seco slo se aplica para


suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una
absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la ley
de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede
involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de
absorcin.
Absorbancia en funcin del Peso Seco

Absorbancia en funcin del Nmero de Microorganismos Totales

En estos grficos se puede apreciar que suspensiones diluidas de dos


microorganismos diferentes con igual peso seco tienen la misma absorbancia,
mientras que para el mismo nmero de microorganismos totales la absorbancia de
cada suspensin es distinta.