DETERMINACIÓN DE BACTERIAS MESO FILAS VIABLES

I. INTRODUCCION
El análisis de los alimentos está catalogado por diversas técnicas y métodos
Para determinar microorganismos que se encuentran viables en los alimentos ya
Sean sólidos como las carnes, verduras y frutas, o líquidos ya sea leche y jugos
De frutas; entre estos métodos tenemos la numeración de microorganismos
Aerobios mesó filos, la cual nos permite determinar cuántos microorganismos
Contaminantes presenta un alimento sobre su superficie o en su interior. Según
La norma técnica Peruana para la leche cruda (NTP 202.086:2001) y la norma
Técnica Peruana para jugos de frutas (NTP 203.002:1979) establecen que el
número
De microorganismos aerobios mesó filos y facultativos deben ser hasta un máximo
De 1000000 ufc/ml, para que puedan ser consumidos por la población.
Por otro lado las técnicas para poder encontrar la numeración de aerobios
Mesófilos viables son: el recuento de colonias en placa por profundidad, superficie
O por goteo; otro el Método del número más probable (MPN) de gérmenes como
Cálculo estadístico del número de células viables.
El recuento total de bacterias en placa es un método útil para obtener una
Idea del grado de frescura o pronta alteración de los alimentos, dependiendo de
La cantidad de bacterias presentes. La mayoría de los alimentos deben ser
Considerados como inadecuados para el consumo cuando contienen un gran
Número de microorganismos, aun cuando estos microorganismos no
sean Conocidos como patógenos y no hayan alterado de forma
apreciable los Caracteres organolépticos del alimento. (Thatcher y Clark, 1973)
La presencia de microorganismos aerobios mesófilos en los alimentos puede
Ser relacionada directamente con la manipulación, el estado de frescura o de
Descomposición del producto y la temperatura de conservación del producto. Un
Número relativamente bajo de estas bacterias no es sinónimo de buena cálida
 II. OBJETIVOS

 Se trata de conocer el número total de microorganismos presentes en el

alimento

 Expresar el resultado como unidades formadoras de colonias (ufc)/g de

alimento.

 Organizar e interpretar los resultados.

III. MATERIALES

El necesario para hacer disoluciones de la muestra (ver protocolo de

disoluciones).

Placas de Petri y pipetas de 10 mL y 1 mL, estériles.

Agar triptosa-glucosa-extracto de levadura (Plate count agar) fundido, en el

baño termostático a 45°C, estéril.

IV. MARCO TEÓRICO

Se trata de conocer el número total de microorganismos presentes en el alimento.

Este número no guarda relación con el de microorganismos patógenos por lo que
no puede usarse como índice de su presencia y sólo debe considerarse un
indicador de las características higiénicas generales del alimento.

Dependiendo de las características del medio utilizado (medio rico, medio limitado
en nutrientes para medida de la flora no láctica de alimentos fermentados) y de las
condiciones de incubación (mesófilos, psicrófilos) los microorganismos analizados
serán miembros de poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia
de microorganismos aerobios o aerotolerantes (anaerobios facultativos); aunque,
en ciertas situaciones (alimentos envasados al vacío), puede ser de interés hacer
recuentos de anaerobios totales.

En general los recuentos bacterianos bajos están asociados con alimentos

seguros. La mayoría de los alimentos industrializados (excepto, por ejemplo, los
productos fermentados) deben ser considerados como inadecuados para el
consumo cuando contienen un gran número de microorganismos aun cuando
estos microorganismos no sean conocidos como patógenos y no hayan alterado
de forma apreciable los caracteres organolépticos del alimento. Algunos
microbiólogos han estimado el recuento bacteriano como uno de los mejores
indicadores del grado de alteración de los alimentos.

Se han desarrollado técnicas que hacen posible la automatización del proceso.

Hay cuatro técnicas biológicas básicas técnicas de recuento de viable

Preparación del medio, incubación y expresión de resultados

Hacer disoluciones de la muestra al 1/10. 1/100.etc, según estime el grado de

contaminación.

Poner 1mL de cada disolución decimal en placas de Petri (por duplicado).

Añadir 15 mL de medio de cultivo (fundido, a 45°C en un baño termostático) y dar

movimientos circulares y de vaivén para que se distribuya la muestra
uniformemente.

Incubar: una serie de placas a 20°C/ 3 días (psicrófilos) y otra serie de placas a
35°C/ 2 días (mesófilos). Para incubar las placas introducirlas invesrtidas en la
estufa.

Pasado el período de incubación contar las placas que tengan entre 30 y 300
colonias.

Expresar el resultado en ufc/g de alimento. Para ello se cuenta el duplicado y se

halla la media, multiplicándose por la inversa del factor de dilución en el que se
realizó el recuento.

También es adecuado expresar el resultado calculando el logaritmo del valor

anterior log ufc/g.


Interpretación.

El medio utilizado es selectivo para gérmenes sulfito- reductores. El sulfito sódico,

por la acción sulfito reductora de la mayor parte de los Clostridium, se reduce a
sulfuro. El sulfuro, al reaccionar con el citrato de hierro, da lugar a sulfuro de
hierro, que se manifiesta formando un precipitado negro alrededor de las colonias.
La sulfadiazina sódica es selectiva e inhibe el crecimiento de gérmenes Gram
negativos.

Crecimiento de colonias de Clostridium en agar SPS

Preparación del medio

VRBG: Agar biliado rojo violeta glucosa.

Se disuelven 19 g en 500 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 1L de

capacidad y se hierve la mezcla hasta disolver el medio en placa calefactora con
agitación.

No resulta necesario ni deseable una esterilización.

Trasvasar a botes de pyrex de 100 mL de capacidad previamente esterilizados.

Conservar en el frigorífico hasta el momento de su utilización.

Sacar el medio del frigorífico y fundir mediante calentamiento en microondas.

Atemperar a 45-50ºC en un baño termostático.

Poner 1 mL. de cada dilución en placa de Petri, estéril.

Añadir 10-15 mL. de agar VRBG, y dar movimientos circulares y de vaivén para
que el inóculo se distribuya uniformemente. Dejar solidificar.

Añadir 4-5 mL. del mismo medio sobre la superficie solidificada, para evitar el
crecimiento en superficie.

Incubar 18-24 horas a 37°C.

Contar las colonias típicas y expresar el resultado como ufc de colonias por gramo
o mL. de alimento.

Interpretación.

Las sales biliares y el cristal violeta que forman parte del medio inhiben el
crecimiento de la flora competitiva. Todas las Enterobacteriaceae fermentan la
glucosa con producción de ácido, lo que se pone de manifiesto por un viraje al rojo
y la precipitación de las sales biliares alrededor de las colonias. Las colonias de
color rojo violeta rodeadas de un halo de precipitación también violeta, se
consideranEnterobacteriaceae.

Lactosa positiva (coliformes)

Fundamento

Para la detección de Enterobacterias lactosa positivas

(coliformes) se aprovechan ciertas características que
las diferencian de otras Enterobacteriaceae como, por
ejemplo, su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas en
presencia de sales biliares.

El necesario para hacer diluciones de la muestra.

Pipetas de 1 y 10 mL, estériles.

Tubos.

Ser-O-Tap.

Campanas Durham.

Caldo lactosado con bilis y verde brillante (BBGB).

Estufa a 37°C Y A 45ºC

Preparación del medio:

BGBL o BGVB: Caldo lactosado biliado verde brillante.

Agregar 40 g a 1 litro de agua destilada en un Erlenmeyer de 1,5 L de capacidad.

Se preparan tres series (una por cada dilución decimal) de cinco tubos por cada
alimento, añadiendo 10 mL del medio en cada tubo. Introducir una campana de
Durham en cada tubo. Tapar con Ser-O-tap.

Esterilizar en autoclave a 121°C durante 20 min. Comprobar que ha desaparecido

el gas de todas las campanas de Durham.

Método e interpretación

Seguir la técnica del número más probable (NMP) como se describe a

continuación:

En cada uno de los tubos de la primera serie se vierte 1 mL de la dilución de la

muestra 1/10.

En cada uno de los tubos de la segunda serie se vierte 1 mL de la dilución de la

muestra 1/100.

En cada uno de los tubos de la tercera serie se vierte 1 mL de la dilución de la

muestra 1/1000.
Incubar las tres series a una temperatura entre 30 y 37ºC haciendo lecturas a las
24 y 48h.

La reacción es positiva cuando se produce desprendimiento de gas en la campana

Durham, por lo menos en 1/10 parte de su volumen, como consecuencia de la
fermentación de la lactosa con formación de ácido y gas en presencia de sales
biliares a la temperatura indicada.

Con el número de tubos positivos en cada serie, se recurre a la tabla del NMP
donde se obtendrá el recuento por gramo o mililitro de muestra.

Si la misma técnica la realizamos en paralelo e incubamos posteriormente a 45ºC

seleccionamos el grupo de “Coliformes fecales”, que contienen una alta proporción
de E. coli. Por lo que se pueden utilizar como indicadores de una contaminación
fecal del alimento.

Caldo verde brillante con reacción negativa y positiva (presencia de gas en la campana
durham) al crecimiento de coliformes

Recuento de entero cocos

Los Enteros cocos pueden tener un papel significativo como indicadores de

prácticas de limpieza y desinfección deficientes en las industrias alimentarias,
debido a su gran resistencia a la desecación, a las temperaturas elevadas y bajas
y a los detergentes y desinfectantes.

El necesario para realizar diluciones decimales.

Pipetas de 1 mL.

Placas de Petri estériles.

Botes pyrex de 100 mL.

Preparación del medio

Agar KAA ( Agar Kanamacina Aesculina Azida)

Se disuelven 24 g en 500 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 1L de

capacidad y se hierve la mezcla hasta disolver el medio en placa calefactora con
agitación. Pasar a botes de pyrex de 100 mL.

Esterilizar en autoclave a 121ºC durant

Atemperar el medio una vez fundido en un baño a 50ºC.

Poner 1 mL de cada dilución en una placa de Petri, estéril.

Añadir 15 a 20 mL de medio KAA

Realizar movimientos rotatorios y homogenizar.

Incubar 24 horas a 37ºC

Contar las colonias típicas (pequeñas, de color gris oscuro con halo negro, como
consecuencia de la hidrólisis de la esculina) y expresar el resultado como ufc de
colonias por gramo o mL. de alimento.

Determinación del número de microorganismos en una muestra. Determinación de la

actividad metabólica, biomasa y proteínas.

Métodos para el conteo de microorganismos viables Cuenta en placa Vaciado en placa

Extendido en placAsa calibrada

Miles y Mirsa Filtración

Número más probable (NMP)

Métodos para el conteo de microorganismos totales

Recuento microscópico
Cuenta de Breed Cámara de Neubauer

Cámara de Prettof Hausser

Turbidimetría

Métodos para el conteo de microorganismos viables

 Estos métodos se basan en poner en evidencia la

presencia de los microorganismos vivos.
 Requieren al menos 24 horas para el cultivo y la
interpretación de resultados.
 Se emplean medios de cultivo general, enriquecido
selectivo y diferencial dependiendo de los
microorganismos a cuantificar.

Cuenta en placa

Se determina el número de microorganismos en una

muestra en relación a las colonias que forman, las UFC
(Unidades Formadoras de Colonias). Se emplean
soluciones diluidas o diluciones de una muestra
concentrada para que cada colonia formada provenga de
un solo microorganismo aunque algunas agrupaciones no
pueden ser separadas por las diluciones. Se utilizan
principalmente para la cuantificación de bacterias,
levaduras y hongos filamentosos. Se reporta como:
Diluciones y cuenta en placa

Vaciado en placa y extendido en placa

Cuenta de colonias

Pueden emplearse medios selectivos y

diferenciales
Miles y Misra

Involucra la preparación de diluciones seriadas de una suspensión bacteriana. Las placas

son divididas en sectores separados. Se inocula cada sector una gota empleando una
Pipeta Pasteur calibrada o bien micropipetas inoculando 0.02mL. Las placas se incuban de
18 a 24 horas a la temperatura adecuada (37ºC). Se toman en cuenta los sectores donde
hay menos de 20 UFC. El número de bacterias viables se obtiene calculando la media de
cada dilución en las repeticiones realizadas.

Asa calibrada
La utilización de agujas o asas calibradas
permite tomar volúmenes pequeños, que son
inoculados en la superficie del agar mediante la
técnica de siembra masiva. Las colonias son
contadas y se multiplican por el factor de
dilución del asa empleada. El uso más frecuente
de esté método es en el urocultivo. Se
determinan las UFC/g o mL de muestra.

Filtración
La membrana de celulosa retiene a los
microorganismos en su malla con poros de
0.25- 0.45mm. Esta membrana se transfiere a
un medio de cultivo para el desarrollo de
colonias

Número Más Probable (NMP)

También llamada técnica de dilución en tubo,
proporciona una estimación estadística de la
densidad microbiana presente con base a que
la probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el
volumen de muestra inoculado.

Número Más Probable (NMP)

10-19-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios.
Determinación de bacterias coliformes. Técnica del número más probable. Cochran,
W. C. (1950). Estimation of bacterial densities by means of té “most probable
Análisis Microbiológico del Agua

Métodos para el conteo de microorganismos totales

Estos métodos se basan en poner en evidencia la presencia de los microorganismos vivos y
muertos los cuales no se pueden distinguir. •Son rápidos pero se requiere contar en algunos
casos con curvas de calibración.

Recuento microscópico

Cámaras de Petroff-Hausser y de Neubauer

Limitaciones:
•Es muy tedioso, no es práctico para un gran
número de muestras.
•No es muy sensible, se necesitan al menos 106
bacterias/mL para que sean observadas al
microscopio.
•No distinguen células vivas de muertas.

Cuenta de Breed •
Muestra a evaluar (directa o diluida) •Microscopio •Objetivo micrométrico •Asa calibrada
o micropipeta •Portaobjetos •Colorantes de Gram u otros colorantes

Cuenta de Breed
Extra: Uso del equipo micrométrico

Nefelometría (Turbidimetría)
Turbidez

La turbidez se determina por la densidad óptica (DO) que

puede ser expresada como Absorbancia, % de
Transmitancia o Unidades Klett (UK).
Escala de Mc Farland
Klett-Summerson Colorimeter

Actividad metabólica (producción de CO2 )

 CO2 + 2NaOH → Na2CO3 + H2O Na2CO3 + BaCl2 → BaCO3
+ 2NaCl NaOH (residual) + HCl → NaCl + H2O

1. Muestra de suelo 2. Recipiente

con agua 3. Solución de NaOH 0.5
N 4. Aguja #20 (Venocat calibre
17) 5. Jeringa desechable de 20mL
6. Tubo de plástico flexible de 1- 2
mm de diámetro 7. Plastilina CO2
+ 2NaOH → Na2CO3 + H2O
Na2CO3 + BaCl2 → BaCO3 + 2NaCl NaOH (residual) + HCl → NaCl + H2O Peso seco
Peso seco y determinación de proteína
•La proteína se relaciona al crecimiento,
por lo que un incremento en la cantidad
de proteína en el paquete celular indica
que hay mayo concentración de células.
•El peso seco (contenido de sólidos) de
las células bacterianas que se
encuentran en una suspensión se
obtiene por el secado de un volumen en
un horno a 105°C hasta peso constante.
•Es útil para grandes volúmenes. La
desventaja de este método es que
componentes volátiles de la célula
pueden perderse por el secado y puede
existir alguna degradación. La muestra
seca puede recobrar humedad durante
el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta. Curva patrón para
la determinacion de proteínas por el método de Lowry Curva de
Curva de crecimiento Viables vs Totales

V. CONCLUSIONES
 Hemos concluido un método muy utilizado cuando se necesita determinar el
tamaño de la población bacteriana de una muestra.

 La utilización de agujas o asas calibradas permite tomar volúmenes pequeños, que son
inoculados en la superficie del agar

 Determinación del número de microorganismos en una muestra.

BIBLIOGRAFA
https://es.scribd.com/doc/38138496/Recuento-y-Cuantificacion-de-Microorganismos
https://www.google.com.pe/webhp?sourceid=chrome-instant&ion=1&espv=2&ie=UTF-
8#q=conteo%20de%20bacterias%20viables
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U4b_MedicionCrecimiento_19837.pdf