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UNIVERSIDAD POLITECNICA DEL VALLE DE TOLUCA

INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA
PRÁCTICA DE LABORATORIO:

“Identificación de microorganismos”

Asignatura: Microbiología Avanzada

Profesora: M. en C. Susana González Aguilar

INTRODUCCIÓN

Una de las tareas fundamentales del laboratorio de microbiología es la aplicación de una

metodología que permita la identificación de los microorganismos. De manera rutinaria, el
laboratorio de microbiología aplica técnicas fenotípicas que permiten lograr los objetivos
expuestos. Estos métodos están consolidados en los laboratorios de microbiología y en la práctica
rutinaria diaria muestran algunas limitaciones que se observan de manera específica y más
evidente para algún tipo de microorganismos. Para una identificación más precisa se utilizan
técnicas moleculares o proteómicas.

La identificación bacteriana se realiza por medio de métodos convencionales, basados en las

características fenotípicas, puesto que su realización y coste los hace más accesibles. Los
esquemas tradicionales de identificación fenotípica bacteriana se basan en las características
observables de las bacterias, como su morfología, desarrollo, y propiedades bioquímicas y
metabólicas. En el cultivo es esencial la correcta elección del medio de crecimiento y las
condiciones de incubación.

En el proceso de identificación bacteriana tradicional se establecen tres niveles de procesamiento:

a) Todas las características fenotípicas conocidas son importantes y hay que tenerlas en
cuenta cuando se inicia el proceso de identificación, pero en principio se seleccionan
aquellas que se consideran pruebas primarias, que son rápidas y sencillas de realizar,
como la morfología en la tinción de Gram u otras tinciones, crecimiento en diferentes
atmosferas de incubación, crecimiento en varios tipos de medios de cultivo, oxidasa y
catalasa. Utilizando estas pocas pruebas generalmente es posible situar a las bacterias, de
manera provisional. El estudio microscópico en fresco y tras tinción revela la forma, la
manera de agruparse, la estructura de las células y su tamaño. Las tinciones son el primer
paso para la identificación bacteriana. Las tinciones más utilizadas e imprescindibles son la
del azul de metileno y la de Gram.
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b) El segundo nivel de identificación debe especificar el género al que pertenece el

microorganismo. Tanto en este nivel como en el anterior, la hipótesis sobre la probable identidad
de un microorganismo se apoya en las características del cultivo (por ejemplo atmósfera) y en
pruebas primarias, con las cuales se puede determinar el género, grupo de género o en algún caso
familia a la que pertenece un aislamiento. Las pruebas primarias son: Gram, morfología, catalasa,
oxidasa, oxidación-fermentación, fermentación de glucosa, producción de esporas, crecimiento en
aerobiosis y anaerobiosis y movilidad.

c) Identificación a nivel de especie. El empleo de ciertas pruebas bioquímicas permite identificar

con un alto grado de precisión la mayoría de las bacterias clínicamente significativas. El resultado
se coteja y compara con pruebas estandarizadas o en base a perfiles numéricos de identificación.
El inconveniente de este proceso es que resultados erróneos en las pruebas primarias pueden
conducir a una identificación equivocada, perdiendo tiempo y recursos, y llevar también a un
resultado erróneo.

MATERIALES Y REACTIVOS.

Cantidad  Material Requerido  Reactivos Específicos 

1 Autoclave Reactivos para tinción Gram
1 Vaso de precipitado de 250 ml Azul de metileno
1 Piseta con agua
1 Mechero Fisher y un bunsen
2 Asas bacteriológicas
1 Microscopio
4 Porta objetos y cubre objetos
1 Colorímetro
1 Turbidímetro

PROCEDIMIENTO
a) Pruebas bioquímicas
1. Inocular una muestra en diferentes pruebas bioquímicas
2. Dejar durante 12 horas de incubación el crecimiento de bacterias y anotar los resultados según
el tipo de prueba bioquímica aplicada
3. Cuantificar y describir las colonias crecidas en el medio de cultivo

b) Crecimiento en medios líquidos

1. Medir en el turbidímetro colorímetro el crecimiento de los microorganismos
2. Tomar una muestra y aplicar tinción Gram

3. Identificar al microscopio los microorganismos, anotando sus características morfológicas y en

cuanto a tinción identificar si son Gram positivas o Gram negativas.
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CUESTIONARIO

1. Menciona las técnicas para cuantificación de microorganismos

 Conteo en placa de Petri
Método más usado para contar bacterias. Se prepara un caldo de cultivo, el cual
posteriormente se vierte en las placas de petri.
 Conteo por filtración
Es realizado cuando la cantidad de bacterias es muy pequeña, como en casos de lagos
y arroyos relativamente puros. En esta técnica se necesitan al menos 100 mL de agua
que atraviesen una membrana delgada de un filtro, con poros tan pequeños que no
permitan el paso de bacterias, de esta forma éstas son retenidas en la superficie del
filtro.
 Método del número más probable (NMP)
Es una técnica de estimación estadística basada en el hecho que a mayor número de
bacterias en una muestra, mayor será la dilución necesitada para reducir la densidad
hasta el punto en que ninguna bacteria se le permita crecer en la serie de tubos de
dilución.
 Determinación directa por microscopio
Las células se pueden contar en un frote teñido, como es el caso del Método de Breed,
colocando en la preparación un volumen conocido de la suspensión de células sobre
un área conocida del portaobjetos. Después de haber fijado y teñido el frote, es
posible contar con un microscopio las bacterias.
 Método de turbidez
es una forma práctica de monitorizar el crecimiento bacteriano. Como una bacteria se
multiplica en un medio líquido, éste se torna turbio o de aspecto nublado por las
células.
 Determinación del peso seco en las células
Es el método más directo para las mediciones cuantitativas de la masa celular y
probablemente el más fácilmente realizable y reproducible, aunque se debe aplicar
solo en suspensiones celulares muy densas y las células deben ser lavadas muy bien
para removerles todo material extra.

2. Además de técnicas de identificación en base a morfología, que otras técnicas para

identificación de microorganismos existen

 Métodos fenotípicos
Características microscópicas
Características macroscópicas: morfología y hemólisis;
Cultivo: Medios de cultivo y requisitos de crecimiento en relación a atmósfera,
temperatura y nutrición.
 Pruebas bioquímicas, diferenciando
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Pruebas que se utilizan en la identificación preliminar y con lectura inmediata

como la catalasa y oxidasa
*lectura en menos de 6h tal y como la hidrólisis del hipurato, la β-galactosidasa
(ONPG), las aminopeptidasas, la uresa y el indol
*pruebas lentas, con lectura de 18 a 48h que incluirían la óxido-fermentación,
reducción de nitratos, rojo de metilo, Voges-Proskauer, Agar hierro de Kligler,
fermentación de azúcares, hidrólisis de la esculina, coagulasa, fenilalanina-
*desaminasa, DNasa, hidrólisis de la gelatina, decarboxilasas, lipasa, lecitinasa,
utilización de citratos, utilización de malonato, y prueba de CAMP entre las más
frecuentes
*pruebas basadas en caracteres de resistencia a ciertas sustancias tal y como
optoquina, bacitracina, solubilidad en bilis, y crecimiento en caldo hipersalino.
 Sistemas comerciales manuales o galerías multipruebas
API (bioMérieux), Enterotube (BBL), Oxi/Ferm Tube (BD), RapID systems y MicroID
(Remel), Biochemical ID systems (Microgen)
 Métodos moleculares
El ARNr 16S (rrs)
Es un polirribonucleótido codificado por el gen rrs o ADN ribosomal ARNr 16S
(ADN 16S) incluido en la subunidad 30S del ribosoma bacteriano.
16S-23S ARNr
Espacio intergénico del 16S-23S ARNr (ITS)4. Estas ITS se presentan en un número
variable en función del número de operones ARNr o alelos rrs.
ARNr 23S
Puede ser una buena alternativa en los casos en los que la fracción 16s no
proporciona resultados concluyentes
RpoB (subunidad β de la ARN polimerasa)
La ARN polimerasa (RNAP) es una enzima imprescindible en el proceso de
transcripción y constituye la diana final de las diferentes rutas que controlan la
expresión génica en los organismos vivos.
GyrB (subunidad ß de la ADN girasa)
Es el gen codificante de la subunidad β de la ADN girasa o topoisomerasa II y está
implicado en la replicación del ADN bacteriano.

3. Describe de dos pruebas bioquímicas la reacción que se produce para la identificación de

los microorganismos, menciona que tipo de microrganismos puedes identificar en dicha
prueba
Prueba de la Catalasa
La prueba de la catalasa es un método rápido y fácil para la diferenciación de
Streptococcus y Staphylococcus.
Todas las especies de Streptococcus son catalasa negativa y Staphylococcus son catalasa
positivo.
Realización de una prueba de catalasa
Materiales necesarios
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Placa de agar que contiene colonias bacterianas que han demostrado ser cocci gram
positivo
El peróxido de hidrógeno (3% de solución)
portaobjetos de microscopio
Puntas de pipeta o bucle bacteriana o toothpics para recoger una colonia bacteriana
Procedimiento de prueba
Coloque una gota de peróxido de hidrógeno al 3% en un portaobjetos de microscopio
Hacerse con una colonia de bacterias a prueba de la placa de agar utilizando un bucle
bacteriana o punta de pipeta
Agitar la colonia bacteriana en el peróxido de hidrógeno y el reloj para que se formen
burbujas
Si la colonia bacteriana es Staphylococcus, abundantes burbujas se verán inmediatamente.
Si no aparecen burbujas, la colonia es una especie Streptococcus El siguiente video
muestra estas reacciones. Nota las burbujas que se forman cuando una colonia de
Staphylococcus se expone a peróxido de hidrógeno.

Prueba ROJO DE METILO

Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar la
glucosa con producción de ácido por la vía ácido mixta o con producción de un producto
final neutro (acetoína) por la vía butanodiólica.

MEDIO DE CULTIVO

Disuelva los ingredientes en agua destilada, distribuya en tubos y esterilice

en autoclave por 15 minutos a 121°C. (15 libras de presión).
Solución Indicadora de Rojo de Metilo
Se prepara disolviendo 0,1 g de rojo de metilo en 300 mL de etanol al 95%
y diluyendo luego con agua hasta 500 mL
PROCEDIMIENTO
Inocule con el asa de platino transfiriendo una porción de cultivo puro. Incube a 35°C por
24 a 48 horas.
REVELADO
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Transfiera 5 mL del cultivo a un tubo y añada 5 gotas de solución indicadora de Rojo de

Metilo.

Prueba de Rojo de Metilo

Una coloración roja, indicadora de la presencia de ácidos provenientes de la
fermentación de la glucosa, constituye un resultado positivo, una coloración
amarilla constituye una reacción negativa.

4. Menciona
las diferencias
entre bacterias Gram positivas y negativas, incluye ilustración
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La técnica de la tinción Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología que

permite diferenciar rápida y fácilmente las bacterias según sus características morfológicas. El
principio del método se basa en la tinción de todas las bacterias mediante cristal violeta o violeta
de genciana y posteriormente decolorar los microorganismos con alcohol-acetona, lo que sucede
con los Gram-, mientras que los Gram+ siguen manteniendo la coloración.

Posteriormente se utiliza un colorante de contraste para visualizar los microorganismos Gram-

como la fucsina o safranina. De este modo podemos visualizar las bacterias Gram+ de color azul-
violáceo mientras que las Gram- se visualizaran de color rojo o rosa.

Los fundamentos de la diferenciación entre ambos grupos se basan exclusivamente en las

características diferentes de las paredes celulares entre ambos grupos de bacterias. La clave es el
peptidoglucano -más conocido como mureina-, uno de los principales constituyentes de la pared
celular, formando una gruesa capa en los Gram+, mientras que tienen una delgada capa en los
Gram-.

Algunos antibióticos eficaces contra Gram+:

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- Penicilinas, Amoxicilinas, Ampicilinas, Algunos antibióticos eficaces contra Gram-:

Cefalosporinas. - Neomicina, Gentamicina, Estreptomicina.
- Bacitracina - Enrofloxacina
- Enrofloxacina - Sulfamidas
- Sulfamidas - Tetraciclinas
- Tetraciclinas - Colistina
- Tilosina

Bacterias Gram+: • Haemophilus

• Bacillus • Klebsiella
• Listeria • Legionella
• Staphylococcus • Pseudomonas
• Streptococcus • Escherichia
• Enterococcus • Proteus
• Clostridium Salmonella typhi . Gram- E. Coli Gram-
• Mycoplasmas (se tiñen como Gram-) • Enterobacter
• Mycobacterias (se tiñen como Gram-) • Salmonella
• Pasteurella
• Bordetella
Bacterias Gram-:
• Riemerella

Resultados y conclusiones de la practica

Se detecto presencia de microorganismo por medio de Tinción Gramm en

una prueba de medio M.I.O contaminado
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Caja Petri con crecimiento de Microorganismo provenientes de la CERVEZA, lo más probable es

que sean  Saccharomyces cerevisiae

Caja Petri con crecimiento de Microorganismo provenientes de la LECHE,

La leche puede contener microorganismos nocivos como salmonella, escherichia coli

O157:H7, listeria monocytogenes, staphylococcus aureus, yersinia enterocolitica, bacillus
cereus, clostridium botulinum, mycobacterium bovis, brucella abortus y brucella melitensis.
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Las bacterias del tipo Lactobacillus normalmente se describen como bacterias «buenas»

o beneficiosas.

Caja Petri con medio

TBCS sin aparente crecimiento de microorganismos

Tubos con medio UREA sin inocular Tubos con medio UREA inoculados

saliva humana saliva de perro

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Tubos con medo INDOL sin inocular Tubos con medo INDOL inoculados
MEDIO MICROORGANISMOS
Cepas
TCBS V. cholerae NCTC 8021 o ATCC 9459
V. parahaemolyticus ATCC 17802
V. alginolyticus ATCC 17749
E. faecalis ATCC 29212
E. coli ATCC 25922
Ps. aeruginosa ATCC 27853
Sin inocular
SS Escherichia coli ATCC 25922
Enterococcus faecalis ATCC 29212
Salmonella Typhimurium ATCC 14028
Shigella flexneri ATCC 12022
Sin inocular
AGAR SANGRE Staphylococcus aureus ATCC® 25923
Enterococcus faecalis ATCC® 29212
Streptococcus pneumoniae ATCC®
49619
Medio no inoculado
Mc CONKEY Escherichia coli ATCC 25922
Proteus mirabilis ATCC 12453
Salmonella Typhimurium ATCC 14028
Salmonella Abony DSM 4224
Shigella flexneri ATCC 12022
Enterococcus faecalis ATCC 29212
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Sin inocular
LIA Salmonella arizonae ATCC 13314
-Leche
-Agua de inodoro
-Agua limpia
-Cerveza
REPORTE
(resultado del crecimiento)
Crecimiento de regular a excelente; zonas amarillas alrededor de las colonias
Crecimiento de regular a excelente; colonias de color de verde a verde azulado; medio prác
cambios
Crecimiento de regular a excelente; zonas amarillas alrededor de las colonias
Inhibición de parcial a completa; colonias pequeñas de color am
Inhibición de parcial a completa; colonias pequeñas y translúcid
Inhibición de parcial a completa; colonias de color azul
Color verde a azul verdoso
Inhibición de parcial a completa; colonias de color rojo car
precipitación
Inhibición completa
Crecimiento de bueno a excelente; colonias de color beige co
blancos
Crecimiento de adecuado a excelente; colonias de color de ro
incoloras
Rojo anaranjado, tono rosado
Buen crecimiento – presencia de β-hemólisis
Buen crecimiento – hemólisis ausente
Buen crecimiento – presencia de α-hemólisis
Medio sólido opaco, con color rojo vivo homogéneo, libre de prec
partículas visibles, pudiendo presentar pequeños coágulos aislados
Crecimiento; colonias de color rosa
Crecimiento; colonias de incoloras a color beige, agrupamiento dinámic
Crecimiento; colonias de incoloras a color beige
Crecimiento; colonias de incoloras a color beige
Crecimiento; colonias incoloras
Inhibición de parcial a completa
Inhibición de parcial a completa
Rosa claro, ligeramente opalescente
Bueno K/K + +
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Escherichia coli ATCC 25922 Bueno K/K (-) + / (-)

Proteus mirabilis ATCC 25933 Bueno R/A (-) (-)
Shigella flexneri ATCC 12022 Bueno K/A (-) (-)
CITRATO SIMMONS Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Satisfactorio Azul
Salmonella typhimurium ATCC 14028 Satisfactorio Azul
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Satisfactorio Azul
Escherichia coli ATCC 25922 Negativo Verde
Shigella flexneri ATCC 12022 Negativo Verde
Medio sin inocular Sin cambios

BIBLIOGRAFÍA

Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos Generales (2da
edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela.

Difco y BBL. 2003. Manual de Medios de Cultivo Microbiológicos. Merck. 2002. Microbiology
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Fernández Olmos A., García de la Fuente C., Saéz Nieto J.A., Valdezate Ramos S. 2010. Métodos
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