Fundamentos de Microbiología Predictiva: aplicaciones Código FMP V.

01
teóricas y prácticas

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DESARROLLO DE UN MODELO DE RELACION ENTRE DENSIDAD OPTICA (MÉTODO

TURBIDIMÉTRICO) VS RECUENTO EN PLACA.

1.1. OBJETIVOS

Los objetivos que se buscan con esta práctica son:

 Diferenciar entre los distintos tipos de métodos de recuento bacteriano y discernir cuál de
ellos emplear bajo diversas situaciones.
 Comprender los fundamentos que rigen los diversos métodos instrumentales de recuento
microbiano.
 Construir una curva de relación para la medida indirecta del crecimiento diversas bacterias
(E. coli, S. aureus, Salmonella spp., etc.) para futuras prácticas.
 Ahorrar material de laboratorio, tiempo de trabajo, etc., en el desarrollo de las futuras
actividades relacionadas a la asignatura de Microbiología predictiva.
 Obtener ecuaciones de primer orden para la predicción del crecimiento de estas bacterias
dependiente de la población inicial a temperatura constante.

1.2. MARCO TEÓRICO

El crecimiento de una población bacteriana puede ser entendido desde perspectivas diferentes y de
acuerdo a éstas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento mediante diversas
metodologías. Para algunos, el crecimiento es la capacidad que tienen las células individuales para
multiplicarse, esto es iniciar y completar una división celular. De esta forma, se considera a los
microorganismos como partículas discretas y el crecimiento es entendido como un aumento en el
número total de partículas bacterianas. Existen varias formas de determinar el número total de
microorganismos en una muestra: Determinación del número de microorganismos, Determinación de
la masa celular, y Determinación de la actividad celular.

Independientemente de los métodos empleados para el conteo bacteriano estos se pueden agrupar
en dos modalidades claramente definidas, así pues tendríamos los métodos de recuento directo o
cuantitativos (como su nombre lo indica nos permite contar directamente el número de células) y
aquellos indirectos o cualitativos, que a través de la determinación de diversos factores nos permite
correlacionar la medida de los mismos con un número de bacterias. En la práctica habitual del
laboratorio, los ensayos se realizan siempre con poblaciones bacterianas, a menudo tomando
muestras en diversos momentos de su crecimiento en un medio de cultivo. En el resto del manual
nos vamos a referir al crecimiento microbiano a escala de poblaciones. Comenzaremos con describir
algunos métodos habituales de medir ese crecimiento poblacional, algunos de los cuales serán
reforzados por el alumno en las siguientes prácticas de laboratorio.

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El crecimiento de una población o cultivo bacteriano se puede expresar en función de:

 Aumento del número de células (microorganismos).
 Aumento de masa del cultivo (masa celular).
 Aumento de la actividad celular.

Estos tipos de expresiones son equivalentes entre sí en cultivos que estén en crecimiento
balanceado o equilibrado (en el que todos los componentes aumentan una misma proporción por
unidad de tiempo). En cultivos cerrados (discontinuos o no equilibrados) estas expresiones de
crecimiento son coincidentes durante algún periodo pero transcurrido el tiempo, dejan de ser
equivalentes, por ejemplo la masa celular y la actividad celular.

La medida del crecimiento bacteriano puede medirse también mediante dos tipos de métodos:
directos (los cuales requieren preparaciones limpias, sin partículas extrañas) e indirectos. Ahora
bien, hagamos una descripción de cada uno de ellos:

1.2.1. DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE MICROORGANISMOS

Estos métodos pueden ser indirectos como el Recuento en placa ya sea en superficie o incorporado,
Método de las diluciones múltiples o del Número Más Probable, Filtración por membrana e
incubación de ésta sobre medio de cultivo sólido, o métodos directos como Recuento microscópico
directo de los microorganismos, ya sea en frotis o en cámaras, Conteo al microscopio de
membranas, Conteo electrónico de partículas (tipo Coulter), Recuento proporcional de Wright.

1.2.2. DETERMINACIÓN DE LA MASA CELULAR

El crecimiento de una población bacteriana pueden determinarse por medio de métodos directos de
conteo de la población: medida del peso seco, medida del peso húmedo, medida del volumen,
determinación del contenido de N, etc., o bien por métodos indirectos como turbidimetría (escala de
McFarland y espectrofotometría) y Nefelometría.

1.2.3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD CELULAR

Este tipo de conteo nos permite entre otros la determinación de una actividad enzimática,
determinación de un metabolito, medida del consumo de oxígeno, medida de ATP, calorimetría,
medida de impedancia, radiometría (de C02). A los efectos de llevar a cabo cualquier técnica de
recuento, hay que tener en cuenta el tipo de muestra sobre la que se va a trabajar, por cuanto es
posible que algunos de los métodos no sean aplicables. Cuando es necesario llevar a cabo

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diluciones, la toma y preparación de la muestra se realiza de la manera común. En las descripciones

que siguen se denominará homogeneizado a la muestra preparada para su análisis microbiológico.
Los primeros incluyen normalmente el recuento en placa (mucho trabajo, costos, tiempo) o conteo
directo al microscopio (cámara de Neubauer), mientras los segundos cuantifican indirectamente la
población a través de diferentes métodos:
 Métodos eléctricos: impedancia, conductancia.
 Métodos turbidimétricos ópticos: Escala de McFarland.
 Métodos turbidimétricos instrumentales: Absorbancia, Tramitancia.
 Citometría de flujo
 Otros.

1.2.4. MÉTODOS TURBIDIMÉTRICOS INSTRUMENTALES

La medición del crecimiento por métodos turbidimétricos resulta ser más rápido y útil, para obtener
una estimación del número de células o biomasa. Una suspensión celular aparece turbia porque las
células dispersan la luz que atraviesa la suspensión. Cuantas más células haya más luz se dispersa
y más turbia aparece la suspensión. La turbidez puede medirse con un fotómetro o un
espectrofotómetro, aparatos que hacen pasar la luz a través de una suspensión celular y detectan la
cantidad de luz no dispersada. La mayor diferencia entre estos dos instrumentos es que el fotómetro
emplea un filtro simple (normalmente rojo, verde o azul) para generar luz incidente de una amplitud
de onda relativamente ancha, mientras que el espectrofotómetro emplea un prisma o red de
difracción para generar luz incidente de banda estrecha. Sin embargo, ambos aparatos miden
solamente luz no dispersada expresando los resultados en unidades fotométricas (por ejemplo,
Unidades Klett) o unidades de densidad óptica (DO) para espectrofotómetro.

Para organismos unicelulares, las unidades fotométricas DO son proporcionales (dentro de ciertos
límites) a la masa celular y también al número de células. Por tanto las medidas de turbidez pueden
utilizarse como un sustituto para otros métodos de contaje. Sin embargo y antes de utilizar la
turbidez como método de contaje, hay que realizar una curva estándar que relacione medidas
directas (microscópicas o por recuento en placa) con las unidades indirectas de turbidez (DO)
(Francois et al., 2007). Tales curvas contienen datos para número de células y masa celular,
permitiendo la estimación de ambos parámetros a partir de una sola medida de la turbidez.

A elevadas concentraciones de células, la luz dispersada de la unidad detectora puede ser

rescatada por otra (apareciendo a la fotocélula como si nunca se hubiese dispersado). Cuando esto
ocurre, la correspondencia uno a uno entre número de células y turbidez pierde linealidad. Sin
embargo, dentro de ciertos límites, las medidas de turbidez pueden ser razonablemente precisas y
además tienen la virtud de ser rápidas y fáciles de tomar. Adicionalmente, las medidas de turbidez

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pueden tomarse sin distorsionar mucho las muestras. Por estas razones, las medidas de turbidez se
emplean ampliamente para seguir el crecimiento de los cultivos microbianos; se puede medir
repetidamente la misma muestra y construir gráficos semilogarítmicos para calcular tiempos de
generación. La población bacteriana puede determinarse midiendo la turbidez del cultivo a diferentes
intervalos de tiempo y confrontando estos resultados con medidas directas de la población a los
mismos intervalos de tiempo por ejemplo mediante recuento directo en placa.

El cambio de luz se registra en el espectrofotómetro como porcentaje de transmisión (cantidad de luz

transmitida) y absorbancia o densidad óptica (D.O.), valor derivado del porcentaje de transmisión,
correspondiente al log del cociente entre la intensidad de luz incidente sobre la suspensión (Io) y la
de la luz transmitida por la suspensión (I). A = log Io/I.

Cuando se inocula una pequeña población bacteriana en un medio de cultivo líquido adecuado,
generalmente el crecimiento no comienza inmediatamente, sino que hay un período de latencia. Una
vez que empieza el crecimiento, se observa un incremento exponencial en la densidad celular, que
corresponde a la fase exponencial de crecimiento. Esta fase es la más significativa en el ciclo de
crecimiento de los microorganismos y se caracteriza porque los parámetros cinéticos del crecimiento
(µ, k) se mantienen constantes. A medida que el crecimiento avanza, la concentración de los
nutrientes esenciales disminuye, y se acumulan los productos finales del metabolismo, hasta que el
crecimiento llega a detenerse, de modo que el cultivo entra en fase estacionaria. Después las células
lentamente se mueren, lisándose en algunos casos, en una última fase de muerte celular (Fig. 1.1).

Figura 1.1. Representación gráfica de las fases de crecimiento bacteriano

(Tomado de Labuza, 1994).

Tomado de Schlessinger et al., 1994.

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1.3. MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS

2 frascos Erlenmeyer con 99 mL de caldo CASO.

48 tubos de ensayo con 9 mL de agua peptona.
64 Pipetas estériles de 1 mL.
16 Pipetas estériles de 10 mL.
96 cajas de petri estériles
1920 ml de agar CASO.
12 tubos de ensayo estériles.
Incubadora de 35ºC +/- 2ºC
Espectrofotómetro calibrado a 600 nm.
Celdas plásticas para espectrofotometría.

1.4. REACTIVOS

Patrón de McFarland 5 (0,5 ml de BaCl2 al 1,175% + 9,5 ml de H2SO4 al 1%) (Ver anexo 1.1 y 1.2,
preparación y control de calidad del estándar de McFarland).

1.5. PROCEDIMIENTO

1.5.1. Cultivos
Se usara un cultivo puro en fase exponencial de Salmonella enteritidis var enteritidis mantenido a
37ºC durante 18 horas en caldo CASO (Oxoid Ltd., Basingstoke, UK).

1.5.2. Preparación del inoculo, mantenimiento del cultivo y medida directa del crecimiento:
1. A partir de un cultivo bacteriano (en fase exponencial) preparar una suspensión inicial (Patrón
1 – P1) de la cepa seleccionada y ajustarla a una turbidez correspondiente al patrón
McFarland 0,5, el cual equivale aproximadamente a 1,5x108 bacterias/ml (ICONTEC, 2000).
De este cultivo preparar una dilución 1:10 (Patrón 2 – P2) inoculando 1 ml de P1 en un tubo
conteniendo 9 ml de caldo CASO (población final equivalente a 1,5x107 bacterias/ml).
2. A partir de P2 preparar cinco diluciones 1:10 en caldo CASO para obtener los patrones P3,
P4, P5 y P6 con unas poblaciones aproximadas a 1,5x106 bacterias/ml; 1,5x105 bacterias/ml;
1,5x104 bacterias/ml; 1,5x103 bacterias/ml, respectivamente.
3. A partir de cada patrón preparar diluciones decimales (1:10) consecutivas en agua peptona
estéril de tal forma que la población teórica final sea de 1,5x102 bacterias/ml, según el
esquema anexo al final de la guía (ver anexo 1.3). De la última dilución sembrar en
profundidad y por duplicado 0,1 ml para cada patrón. De la dilución anterior sembrar en

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profundidad y por duplicado 1 ml de cada patrón. Adicionar 15 mL de agar CASO y

homogenizar las cajas, llevando a incubar la totalidad de las cajas a una temperatura de 35ºC
± 2ºC por 24 – 48 horas.
4. Al finalizar el tiempo de incubación, realizar los cálculos de la población así:

De esta forma se calcula la población en ufc/mL equivalentes al patrón 1, la cual será

correlacionada con el valor inicial de la curva obtenida por espectrofotometría.
5. A partir de cada patrón (P1, P2, P3, P4, P5, P6) determine el valor de la absorbancia a 600
nm, de esta forma obtendremos el equivalente en Ab para cada patrón, la cual será
correlacionada con el recuento en placa profunda para cada patrón.
6. Con ayuda de Excel obtener una gráfica de dispersión donde ubicaremos en el eje X el valor
de la absorbancia y en el eje Y el Log 10 de la población. Posteriormente usando regresión
lineal, agregar la línea de tendencia que mejor ajuste tenga según el coeficiente de regresión
(R2) y obtener el valor de la ecuación.
7. Esta ecuación será validada en la práctica posterior y si es fiable se usara para futuros
cálculos de población. Solo basta con preparar el inoculo inicial del microorganismo (en
nuestro caso Salmonella enteritidis var enteritidis) medir la absorbancia y reemplazar este
valor en la variable X de la ecuación. De esta forma obtendremos el valor aproximado de la
población en ufc/ml.

1.6. RESULTADOS

Construir la curva experimental de absorbancia vs LnN empleando los datos recogidos en la

siguiente tabla 1.1:

Tabla 1.1. Tabla de resultados de la actividad práctica 1.

Patrón Media
Población teórica Absorbancia Población real
(dilución del Población
(cel/ml) media (600 nm) (Ln ufc/ml)
patrón) (ufc/ml)

1 (100) 1,5x108

2 (10-1) 1,5x107
3 (10-2) 1,5x106
4 (10-3) 1,5x105

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5 (10-4) 1,5x104

6 (10-5) 1,5x103

Ajustar la curva a la función más adecuada (lineal, exponencial, logarítmica o polinómica). Calcular
la ecuación de predicción y corregir hasta obtener un R2 > 0,98. Trabajar con un mínimo de 4 valores
de referencia. La ecuación así obtenida será la que se empleará para los cálculos de la población
final a diferentes intervalos de tiempo en las prácticas siguientes.

1.7. NIVEL DE RIESGO

Para el desarrollo de la presente práctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya que
se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algún momento por malas
prácticas de laboratorio pueden conllevar algún peligro para los manipuladores. Por tanto, todo
estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deberá usar los
siguientes equipamientos:
 Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo, Pantalón
Largo.

1.8. BIBLIOGRAFÍA

Schlessinger, D., Schaechter, M., Eisenstein, B.I. (1994). Biología de los agentes infecciosos,
capítulo 3. En: Microbiología. Mecanismos de las enfermedades infecciosas, enfoque
mediante la resolución de problemas. 2da edición. Editores: Schaechter, M., Medoff, G.,
Eisenstein, B.I., Guerra, H. Editorial Médica Panamericana, S.A. Buenos aires. Argentina.
Págs. 47 – 76.
http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/cholera/ch9.pdf.
Fernández, C.M., González, M., Illnait, M.T., Martínez, G. (1998). Determinación de la concentración
mínima inhibitoria de Anfotericina B en levaduras de interés médico. Rev Cubana Med Trop.,
50(1): 48-53.
Francois, A., Valero, A., Geeraerd, A.H., Van Impe, J.F., Debevere, J., García-Gimeno, R.M., Zurera,
G., Devlieghere, F. (2007). Effect of preincubation temperature and pH on the individual cell
lag phase of Listeria monocytogenes, cultured at refrigeration temperatures. Food Microbiol.,
24: 32 – 43.
ICONTEC. Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación. (2000). NTC 2455.
Desinfectantes. Limpiadores líquidos. Desinfectantes para uso doméstico. Tercera
actualización. 25-10-2000.

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Madigan, M.T., Martinko, J.M., Parker, J. (2001). Crecimiento microbiano, Capítulo 5. En: Brock
Biología de los Microorganismos. 8ª edición revisada. Editorial Prentice Hall Iberia, Madrid,
España. ISBN: 84-89660-36-0. 4ª reimpresión. Págs. 155 – 157.
Willett, H.P. (1997). Fisiología del Crecimiento Bacteriano, Capítulo 5. En: Zinsser, Microbiología. 20ª
edición. Editores: Joklik, W.K., Willett, H.P., Amos, D.B., Wilfert, C.M. Editorial Médica
Panamericana, S.A. Buenos Aires. Argentina. Págs. 78 – 109.

ANEXOS

ANEXO 1.1. Escala de McFarland

Fundamento: El patrón o la escala de McFarland consiste en una serie de tubos herméticamente
cerrados, previamente calibrados y con una densidad óptica diferente originada por la aparición de
un precipitado de sulfato de bario (SO4Ba) resultante de la reacción entre el cloruro de bario (Cl2Ba)
al 1,175% (0,048 M) y el ácido sulfúrico (H2SO4) al 1% (0,36N). Esta turbidez puede interpretarse
ópticamente o por métodos espectrofotométricos y cada una de ellas se corresponde a una
concentración conocida de bacterias/ml. Para cada cepa bacteriana hay que establecer la
equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la masa o la concentración de bacterias (cel/ml) que
genera una turbidez similar.

Inconveniente: Es un método poco preciso, que solo se emplea cuando no hace falta exactitud, ha
sido desplazado por los métodos espectrofotométricos.

Conservación: El estándar de McFarland puede ser almacenado hasta por 6 meses en la oscuridad
y a temperatura ambiente entre 22º a 25ºC. Sin embargo, se recomienda almacenarse a ser posibles
en refrigeración.

Cuidados: Descartar después de 6 meses o antes si su volumen es menor. Antes de cada uso,
debe agitarse muy bien usando un shaker, hasta que el precipitado blanco de sulfato de bario se
haya disuelto en todo el medio. Para asegurar la densidad del estándar de McFarland así preparado
puede ser chequeado usando un espectrofotómetro con una celda de cuarzo de 1-cm; para el
estándar 0,5 de McFarland, la absorbancia a una longitud de onda de 625 nm puede estar entre 0,08
a 0,1. Alternativamente, el aseguramiento del estándar de McFarland puede ser verificado por ajuste
de una suspensión de una cepa control (por ejemplo, E. coli ATCC 25922) a la misma turbidez,
preparando diluciones seriadas 1:10, y realizando el respectivo recuento en placa. La suspensión así
ajustada puede tener un conteo de 1,5x108 ufc/ml.

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Para levaduras el estándar 0,5 de McFarland es equivalente a una suspensión de 10 6 ufc/ml (Andreu
et al., 1998).

Preparación: Se adicionan cantidades crecientes (o decrecientes según corresponda) de

BaCl2*2H2O al 1,175% (p/v) en H2SO4 al 1% (v/v) de acuerdo a la siguiente tabla (Tabla 1.2.) para
obtener la equivalencia deseada:

Tabla 1.2. Preparación del estándar de McFarland.

Escala de
BaCl2*2H2O (0.048M) H2SO4 (0.36N) ml final [ ] celular
McFarland
1 0,1 9,9 10,0 3 x 108
2 0,2 9,8 10,0 6 x 108
3 0,3 9,7 10,0 9 x 108
4 0,4 9,6 10,0 12 x 108
5 0,5 9,5 10,0 15 x 108
6 0,6 9,4 10,0 18 x 108
7 0,7 9,3 10,0 21 x 108
8 0,8 9,2 10,0 24 x 108
9 0,9 9,1 10,0 27 x 108
10 1,0 9,0 10,0 30 x 108
Fuente: ICONTEC, 2000.

Los estándares de turbidez se preparan en tubos similares a los que se emplearan para preparar la
suspensión del inoculo. Después, el tubo debe ser bien tapado usando una tapa rosca con teflón,
Parafilm, o algún otro medio que evite la evaporación del mismo. Esta escala de 3x10 8 a 3x109
bacterias por ml es de gran utilidad en cuanto que, en la mayoría de los experimentos, los conteos
quedarán dentro de estos límites, excepto en los casos de muy bajo crecimiento.

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ANEXO 1.2. Procedimiento para la preparación y control de calidad del estándar 0,5 de
McFarland (Equivalente a 1,5x108 bact/ml)

Fuente: Fernández et al., 1998.

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ANEXO 1.3. Esquema de trabajo curva de calibración de población por método turbidimétrico
y recuento en placa.

LECTURA TURBIDIMÉTRICA RECUENTO EN PLACA

P1 Cultivo madre de E. coli / o S. aureus

PT = 108

1 ml
PT =102
P2 1 ml
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
PT = 107
0,1 ml

1 ml PT =101

PT =102
P3 1 ml
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Medir Absorbancia a 600 nm

PT = 106
0,1 ml

1 ml PT =101
PT =102
1 ml
P4 1 ml 1 ml 1 ml
PT = 105
0,1 ml

PT =101
1 ml
PT =102
1 ml
P5 1 ml 1 ml
PT = 104
0,1 ml

PT =101
1 ml
PT =102
P6 1 ml
1 ml
PT = 103
0,1 ml
PT =101
1 ml

P7 1 ml
PT = 102
PT =102
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PT =101