Práctica # 2: Control Microbiológico de agua para la industria

farmacéutica.
Profesor : Viviana Ramos Rueda
Correo electrónico : viviana.ramos@salesiana.edu.co

I. Introducción
Agua tipo II: Agua de uso general de laboratorio: -Preparación de soluciones tampón, medios microbiológicos,
reactivos -Limpieza de material (lavavajillas), Autoclaves, Invernaderos - Absorción atómica (dependiendo de
la resolución) -Cultivos hidropónicos -Industria Química (agua purificada) -Industria Farmacéutica y cosmética
(agua purificada según USP) - Laboratorios Veterinarios (agua purificada según USP) - Análisis Clínicos -
Cámaras de Niebla salina -CámarasClimáticas

Método de filtración por membrana: Este método se basa en determinar el número y tipo de microorganismos
en una muestra de agua por medio de la filtración a través de una membrana de esteres de nitrocelulosa con
tamaño de poro de 0,45 µm, la consiguiente retención de los microorganismos sobre la membrana y el cultivo
en medios de acuerdo para la identificación de cada microorganismo.

El grupo de coliformes se define como aquellos microorganismos facultativos anaerobios, Gram-negativas, no

formadoras de esporas, en el medio EMB se desarrollan colonias de color rojo conun brillo metálico dentro de
las 24 y 48 horas a una temperatura de 35°C cuando hay presencia de E. coli. Algunos miembros del total
obtenido del grupo coliforme pueden producir rojo oscuro,mucoide o colonias nucleadas sin brillo metálico no
fermentadoras de lactosa.

El medio se utiliza aún en microbiología clínica y la industria farmacéutica para el aislamiento y la diferenciación
de la familia Enterobacteriaceae. La selectividad del agar Endo se debe a la combinación del sulfito de sodio
con fucsina básica, lo cual ocasiona la supresión parcial de los microorganismos gram-positivos. Los coliformes
fermentan la lactosa, produciendo colonias color rosa oscuro a rojizo con un brillo metálico verdoso iridiscente
y una coloración similar en el medio. Las colonias de microorganismos que no fermentan la lactosa son incoloras
o de color rosa pálido en contraste con el fondo rosa claro del medio.

Recuento en placa o vertido en placa: Estas pruebas se basan en la capacidad de determinarla presencia
de microorganismos a través del uso de medios de cultivo: nutritivos, de enriquecimiento, selectivos y/o
diferenciales, capaces de permitir su recuperación a partir aguas.Los medios de cultivo que se utilizan para el
recuento pueden ser de altos o de bajos nutrientes.Entre los medios de altos nutrientes, el Plate Count Agar
(PCA) es el más ampliamente utilizado y recomendado por la USP. Sin embargo, recuentos más altos se
obtienen cuando se utilizan medios de bajos nutrientes como el R2A, aunque debe tenerse en cuenta que este
medio requieremayor tiempo de incubación.
Método número más probable (NMP): La precisión del método depende del número de tubos empleado, y el
recuento se obtiene empleando tablas que se establecieron considerando una distribución de Poisson. Como
método presuntivo para la detección de coliformes totales puede emplearse Caldo Lauril Triptosa, distribuido
en tubos en los cuales se coloca campanitas de Durham o pequeños tubos invertidos para detectar
producción de gas a partir de la lactosa contenida en el medio.

El medio puede contener Púrpura de Bromocresol (0.001g/l) como indicador para detectar la producción de
ácido. Como método confirmatorio, el medio de los tubospositivos se repica en otros tubos conteniendo Caldo
Lactosa Bilis Verde Brillante, también con tubos de fermentación invertidos e incubando durante 18 hs a 35ºC.
Para la determinación del NMP de coliformes fecales, puede utilizarse el Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante
conteniendo MUG (4-methylumbelliferyl-beta-D- glucuronide) para detección de E. coli a 44.5º±0,2º C. [Manual
Microbiología Aplicada a las Industrias Farmacéutica, cosmética y de productos médicos 2013]
 1. DEFINICIONES Y ABREVIATURAS

Agua Potable: Es aquella que, por cumplir las características físicas, químicas y microbiológicas, en las
condiciones señaladas, es apta para consumo humano. Se utiliza en bebida directa, en la preparación de
alimentos o en la higiene personal. [Decreto 1575 de 2007 Articulo 2]

Agua Purificada: Se emplea como excipiente en la producción de preparaciones no parenteralesy en otras

aplicaciones farmacéuticas, debe cumplir con los requisitos de pureza química, iónica y orgánica y debe
protegerse de la contaminación microbiana. Este tipo de agua de suministro puede purificarse usando
operaciones de destilación, tratamiento de intercambio iónico, ósmosisinversa, y cumple los requerimientos
fisicoquímicos y microbiológicos definidos. [ USP 43.
<1231>]

Agua para Inyección USP: Agua generada por procesos de purificación fisicoquímica, que cumple con las
condiciones microbiológicas, fisicoquímicas y de ausencia de endotoxinasbacterianas, aceptadas por la USP
39. Se emplea como excipiente en la producción de preparaciones parenterales y en otras preparaciones donde
se debe controlar el contenido de endotoxinas. Debe cumplir con todos los requisitos químicos para el Agua
Purificada, así como con una especificación adicional de endotoxinas bacterianas. [ USP 43. <1231>]

Agua tipo reactivo: Están definidos los diferentes niveles de pureza del agua en función de los parámetros
físicos químicos, tales como conductividad eléctrica, resistividad, contenido decarbono, oxígeno o sílice [ASTM
1193: 2001]

Agua purificada tipo II: Agua de uso general de laboratorio: -Preparación de soluciones tampón, medios
microbiológicos, reactivos -Limpieza de material (lavavajillas), Autoclaves, Invernaderos
-Absorción atómica (dependiendo de la resolución) -Cultivos hidropónicos -Industria Química (agua purificada)
-Industria Farmacéutica y cosmética (agua purificada según USP).

Agua Tipo I (Ultrapura): Agua para aplicaciones especiales. - Absorción atómica / ICP - HPLC -Cromatografía
Iónica - GC-MS - Biología molecular - PCR - Cultivos celulares - Secuenciación deADN.
Bacterias Coliformes: Bacterias Gram Negativas en forma bacilar que fermentan la lactosa a temperatura de
35 a 37ºC, produciendo ácido y gas (CO2 ) en un plazo de 24 a 48 horas. Se clasifican como aerobias o
anaerobias facultativas, son oxidasa negativa, no forman esporas y presentan actividad enzimática de la β-
galactosidasa. Es un indicador de contaminación microbiológica del agua para consumo humano. [Resolución
2115 de 2007 Articulo 1].

Bacterias aerobias mesófilos: Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre
15 y 43 ºC. [Manual Microbiología Aplicada a las Industrias Farmacéutica, cosmética y de productos médicos
2013].

II. Resultados de aprendizaje esperados

• Establecer conocimientos del procedimiento para realizar el control de calidad microbiológico al agua utilizada
en la fabricación de un medicamento o cosmético.

• Conocer y aplicar la norma que rige el control microbiológico del agua utilizados en la industria farmacéutica.
 III. Materiales, equipos y reactivos por grupo de trabajo

Materiales Reactivos

• Agar Plate Count (PCA)

• Puntas azules (caja) • Agua Peptonada (Tubo de 9 mL
• Asas curvas • Cepas de referencia.
• Gradillas • Muestras para analizar
• Porta filtros y filtros o vaso graduado estéril. • Tubos con 9 ml de agua peptonada
• Erlenmeyer con desprendimiento lateral de 1000 mL • Agar MacConkey
estéril. • Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante
• Agar ENDO
• Agares coliformes
• Tiosulfato de sodio al 10%

Equipos Consumibles
• Incubadoras 32,5 ºC ±2°C • Papel de arroz
• Micropipetas 100-1000 ul • Membrana de nitrocelulosa con tamaño de
• Bomba de vacío poro 0,45 µm estériles
• Cabina de Flujo Laminar Tipo II
• Vortex
Cuenta colonias
 IV. Procedimiento

Método filtración por membrana. (Agua Inyección, Tipo I)

• Marcar los medios de cultivo con la fecha y la identificación de la muestra del agua que seestá
procesando.
• Armar el equipo de filtración.
• Con las pinzas estériles, colocar la membrana estéril, con la cuadrícula hacia arriba sobre labase del
portafiltros, que se ha desmontado parcialmente.
• Cuidadosamente colocar el filtro sobre la membrana y el portafiltros, asegurándose de unbuen
acople.
• Homogenizar la muestra en su propio recipiente antes de verterla en el filtro.
• Dispensar un volumen igual a 100 mL de la muestra de agua para aerobios mesófilos, parael
recuento de coliformes totales el tamaño de la muestra debe ser igual.
• Encender la bomba de vacío y filtrar la muestra.
• Una vez se haya filtrado toda la muestra, apagar la bomba de vacío y retirar el filtro del
portafiltros.
• Tomar la membrana con ayuda de unas pinzas estériles y colocarla en la caja de petri quecontiene el
medio de cultivo respectivo.
• Cerrar cuidadosamente la caja y llevarla a incubar invertida, para evitar condensación.
• Incubar a 30 -35°C +/- 0,5.

Método NMP ((Agua potable, Tipo III y tipo IV)

• Tomar 1 mL de agua homogenizada en un tubo de ensayo que contenga 9 ml de Agua peptonada 0,1%
agitar moderadamente por 1 minutos en un vortex.
• Diluciones en serie: diluir la muestra seriadamente transfiriendo 1 ml a un tubo con 9 ml de agua
peptonada. Cada transferencia corresponde a una dilución de 1 en 10. Repita en serie el procedimiento
de dilución hasta alcanzar la dilución 10-5.
• Inoculación: Transfiera 1ml de la dilución a cada tubo de Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante
• Repita esta operación 5 veces por cada dilución y Un tubo como control positivo (Ver imagen1).

Imagen 1. Inoculación del medio de cultivo

• Incubar a 37°C durante 24 Horas

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• Evaluación de crecimiento: Para cada dilución evalué el crecimiento o no crecimiento sobre cada réplica
inocula.
• Realizar la lectura según la tabla del NMP.

Método de vertido en placa (Tipo I, Tipo II y tipo III)

• Transferir 1 mL de la muestra de agua y añadirlos a un tubo que contiene 9 mL de agua peptonada. agitar
el tubo en vortex. Rotular 10-1.
• Transferir con una pipeta estéril, 1 mL de la dilución 10-1 a un tubo con 9 mL de Agua peptonada. Agitar.
Rotular 10-2.
• Transferir con una pipeta estéril, 1 mL de la dilución 10-2 a un tubo con 9 mL de Agua peptonada. Agitar.
Rotular 10-3.
• Con una pipeta estéril, transferir porciones de 1 mL de la dilución 10 -1 a cada una de 2 placas de Petri
estériles.
• Con una pipeta estéril, transferir porciones de 1 mL de la dilución 10 -2 a cada una de 2 placas de Petri
estériles.
• Con una pipeta estéril, transferir porciones de 1 mL de la dilución 10-3 a cada una de 2 placas de Petri
estériles
• Verter en cada una de las placas, 15 mL de Agar fundido, mezclando cuidadosamente lasmuestras con el
agar. Dejar solidificar e incubar en posición invertida a 32,5 ± 2,5º C por 3 a 5 días.

ANÁLISIS DE DATOS Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

Los resultados se expresan en unidades formadoras de colonias (UFC), según especificaciones USP.

Filtración por membrana: Para el recuento, examinar la membrana y contar el número total decolonias que se
presenten en la superficie, densidad de las colonias por filtro óptimo es de 20 a 200 UFC, para el recuento tener
en cuenta lo siguiente:

• Contar todas las colonias en la membrana cuando hay ≤ 2 colonias por cuadrado.
• Para 3 a 10 colonias por cuadrado contar 10 cuadrados y obtener recuento promedio.
• Para 10 a 20 colonias por cuadrado contar 5 cuadrados y obtener un recuento promedio.
• Luego multiplicar por 100 que corresponde al total de cuadrados y dividir por el volumende la muestra,
para obtener un resultado por mililitro cuando aplica.
• Los recuentos se pueden realizar solo cuando hay colonias separadas

Vertido en placa: El recuento más preciso es aquel en el que en cada placa se pueden contar entre 25 - 250
colonias, se debe realizar un promedio y multiplicar por el inverso de la dilución que se eligió.

NMP: Los datos se observan en la tabla del NMP.

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ESPECIFICACIONES DE LOS TIPOS DE AGUA.

MO Agua para Tipo I* Tipo II* Tipo Tipo Agua potable***

inyección** III* IV*
Bacterias 10 UFC/100ml 10 1000UFC/mL NA NA 100
UFC/mL (UFC/100mL)
Coliformes 10 0 UFC/100mL o
10 UFC/100ml 1000(UFC/mL) NA NA
totales/E. /ausente UFC/mL /ausente Ausente
coli /ausente

*Comité Nacional para Normas de Laboratorios Clínicos (NCCLS)

** USP 43. Capítulo 1231.
*** Resolución No. 2115 de 2007

Materiales que necesitan para la práctica por grupo: Marcador (Sharpie), todos los elementos de bioseguridad
(Bata, Guantes, Cofia y tapabocas), toallas de papel, papel transparente para envolver lo medios de cultivo,
alcohol, cuaderno (solo para hacer uso en el laboratorio) y agua para Inyección 1000 ml por todo el grupo.

PREGUNTAS ORIENTADORAS

1. Cuál es el fundamento de los medios de cultivo que se van a utilizar para realizar el control y según el
microorganismo a identificar como es el crecimiento de los microorganismos de interés.

2. ¿Por qué se utiliza tiosulfato de sodio para tomar la muestra de agua potable?

3. ¿Cuál es la importancia de realizar el control microbiológico a las aguas que se utilizan para la
fabricación de productos farmacéuticos?

V. Condiciones de seguridad

• En el laboratorio está prohibido beber, comer, masticar chicle o fumar en el laboratorio y se debe evitar
llevarse a la boca ningún objeto (bolígrafos...) o tocarse los ojos y nariz. En la superficie de trabajo
no deben depositarse en ningún momento ropa u objetos personales.
• Se deben respetar las normas establecidas desde el primer día de clase.

• Lavarse las manos al ingreso y finalización del laboratorio.

• Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la sesión práctica.

• Llevar un calzado apropiado, preferiblemente cerrado y de suela antideslizante en las áreas de laboratorio.

• Evitar llevar en el laboratorio accesorios que podrían ser fuente de contaminación (por ejemplo, joyas).

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• Mantener el área de trabajo ordenada, libre de libros, cuadernos u objetos personales, exceptuando
aquellos equipos y materiales necesarios para la realización del trabajo práctico.
• Colocar los materiales de vidrio contaminados en los recipientes dispuestos para tal fin, por ejemplo: las
pipetas, tubos y placas de Petri en las canastas de desecho, etc.

I. Referencias Bibliográficas

1. Pharmacopea USP 43 capitulo 1231. Agua para Uso Farmacéutico.

2. Ministerio de la protección social. Sistema para la Protección y Control de la Calidad del Aguapara Consumo
Humano. Decreto 1575 de 2007
3. Manual Microbiología Aplicada a las Industrias Farmacéutica, cosmética y de productosmédicos.
Buenos aires, 2013.

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