UNIVERSIDAD DE ALMERÍA

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

RESUMEN: EL FACTOR DE
TRANSCRIPCIÓN FvTCP9 PROMUEVE LA MADURACIÓN DE
LA FRUTA DE FRESA AL REGULAR LA BIOSÍNTESIS DE ÁCIDO
ABSCÍSICO Y ANTOCIANINAS.

JOSÉ LUIS PÉREZ MIRANDA

G35132363

CD. ALMERÍA, ESPAÑA MAYO 2020

Introducción
La fresa es un cultivo hortícola de naturaleza perenne y herbáceo, que se caracteriza por estar bajo
estudio por su alto valor nutricional y comercial, además se considera un fruto no climatérico, es
decir su maduración es insensible al etileno debido a que está controlada por ABA, auxina (IAA) y
azucares. ABA es un inductor que promueve la maduración en este fruto. La maduración del fruto es
un proceso fisiológico controlado por numerosas vías de señalización. Las antocianinas son un signo
fisiológico en la maduración de la fruta por tener una función crucial en la coloración y maduración
de la fruta. Se ha demostrado que varios factores de transcripción de la fresa se encuentran
involucrados en la regulación de la maduración de la fresa. Todos estos genes están involucrados en
la biosíntesis de antocianinas y se regulan a nivel transcripcional a través de un complejo de
proteínas reguladoras ternarias MYB-bHLH-WD40 'MBW' [ CITATION MRH18 \l 1033 ]. También la
sacarosa se describe como una señal importante en el proceso de maduración donde diversos
genes transportadores, como FaSUT es responsable de la acumulación de sacarosa durante el
desarrollo del fruto
Un ejemplo de este complejo ternario de proteínas es en la fresa, donde FaMYB1, 5 y 10 parecían
ser un regulador universal de los genes de la ruta de los flavonoides. En otro caso, un factor básico
de transcripción helix-loop-helix, FaMYC1, interactúa con FaTTG1 y FabHLH33 que regulan la
biosíntesis de proantocianidinas (PA) y antocianinas [ CITATION MRH18 \l 1033 ].También se ha
informado acerca de un factor de transcripción TCP de fresa, FaTCP11 que desempeña un papel en
la maduración y regulación de la síntesis de derivados de flavonoides.
Los factores de transcripción específicos de la planta TCP fueron nombrados por tres miembros de
la familia caracterizados: Teosinte Branched 1 ( TB1 ) en maíz ( Zea mays ), Cycloidea ( CYC ) en
snapdragon ( Antirrhinum majus ) y Proliferating Cell Factors 1 y 2 ( PCF1 y PCF2 ) en arroz ( Oryza
sativa ) [ CITATION MMa10 \l 1033 ]. También se caracterizan por tener una estructura conservada
de terminal hélice-bucle-hélice (bHLH) que se conoce como dominio TCP y posiblemente está
relacionada con la actividad de unión, la localización celular y la interacción de proteínas [ CITATION
JAL15 \l 1033 ]. Estudios demuestran que los TCP desempeñan funciones versátiles en el
crecimiento y desarrollo de las plantas, como respuestas al estrés, germinación de semillas,
desarrollo de hojas y flores, vías hormonales y respuestas al estrés abiótico.
Recientemente algunos TCP están involucrados en la regulación de la maduración de la fruta, en
este caso se descubrió que la familia TCP de fresa tiene 19 genes FvTCP y algunos de ellos
responden a las hormonas vegetales ABA, MeJA, ETH y SA. Además de que FvTCP9 también se
induce en el tratamiento de ABA. Estos resultados sugieren que FvTCP9 puede estar involucrado en
la maduración de la fruta [ CITATION WWe16 \l 1033 ]
En este estudio FvTCP9 se aisló y analizó para verificar las funciones del TCP de fresa en la
maduración de la fruta. Se realizó un ensayo, que incluyó sobreexpresión y VIGS (Virus-induced
gene silencing) en frutos de fresa. Además de un estudio adicional que reveló a FvTCP9 como
involucrado en las vías de señalización de ABA y antocianinas. El análisis de transcripción demostró
que los genes relacionados con ABA y antocianinas están regulados por FvTCP9 y un ensayo de
dos híbridos de levadura demostró que existe una interacción entre FvTCP9 y FvMYC1.
Resultados

Figure 1 Análisis filogenético

En la figura (1 A) se realizó un estudio de homología entre TCP y se encontró que los genes
AtTCP12 / 18 , SlTCP15 / 18 , OsTCP19 , MaTCP5 / 19/20 y FvTCP6 / 9/14, juegan un papel en el
crecimiento y desarrollo de las plantas, especialmente en la maduración de la fruta. Esto se encontró
porque se realizó una alineación de secuencia múltiple donde se abarca el dominio (60 aa, bHLH),
en donde estas proteínas estaban altamente conservadas en la región funcional. Por otro lado en el
árbol genético en la figura (1B) mostro que FvTCP9 es altamente homologo con estos genes. Esto
sugiere que FvTCP9 puede desempeñar funciones similares a los genes en el crecimiento y
desarrollo de las plantas. En la figura (1C) se analizó el ARN total de las raíces (R), tallos (S), hojas
(L), flores (F), grandes frutos verdes (BG), frutos blancos (Wt) y frutos completamente maduros (FR).
Donde se revelo que los niveles de transcripción de FvTCP9 fueron mas altos en frutas y más bajos
en raíces y tallos. También se encontró que FvTCP9 se expresó en frutos verdes y rojos. En el
primer caso de FvTCP9 se observó que las transcripciones se combinaron con el crecimiento y el
desverdecimiento del fruto, y alcanzaron su nivel máximo en frutos blancos. En este último caso, las
transcripciones de FvTCP9 disminuyeron junto con el aumento del color rojo y el agrandamiento de
la fruta, pero permanecieron más altas que en las raíces, tallos y hojas. 

Figura 2 Fenotipos de FvTCP9- ARN interferencia (RNAi) y FvTCP9 -sobreexpresión (OE) frutos de fresa.

Para investigar el papel de FvTCP9 en el desarrollo y maduración del fruto, se generaron frutos
VIGS y frutos de sobreexpresión OE y se realizó un ensayo de expresión transitoria inyectando en la
construcción de los frutos verdes. Se observo que la superficie de las frutas de control se volvió
completamente roja a los 7 días después de la inyección (ppp), en contraste, el sector inoculado en
la superficie de las frutas VIGS permaneció parcialmente blanco (figura 2  A), lo que fue acompañado
por una disminución en las transcripciones de FvTCP9 (Figura 3 A). Sin embargo, después de la
inyección de la construcción FvTCP9- OE mediada por Agrobacterium en las frutas BG, la expresión
de FvTCP9 fue aumentado en frutos OE (Figura 3 A). También se determinó que la regulación al
alza de la expresión de FvTCP9 en frutas OE aceleró la acumulación de color rojo de la ruta que
parecía mas roja que el control (figura 2 B). Estos resultados indican que silenciar FvTCP9 inhibe la
maduración de la fruta y la sobreexpresión de FvTCP9 promueve la maduración de la fruta.

Figura 3 condiciones fisiológicas y la transcripción del gen FvTCP9 en las frutas con interferencia de ARN FvTCP9 (RNAi) y
sobreexpresión de FvTCP9 (OE).

Para evaluar las funciones de FvTCP9 en la maduración se analizaron las condiciones fisiológicas.
En donde la firmeza del fruto aumento en frutos de ARNi pero se redujo en frutos OE (figura 3 C),
mientras que los contenidos de ABA (figura 3 B), antocianina (figura 3 D) y azúcar soluble (figura 3
E) se mantuvieron bajos en frutas RNAi y los en frutas OE en aumento en comparación con las
frutas control.
Para determinar si FvTCP9 está involucrado en la vía ABA, se analizaron varios genes ABA
relacionados por RT-qPCR en frutos inyectados.
En la figura 4 se muestra que después de silenciar o sobreexpresar FvTCP9 en las frutas, las
transcripciones de FaNCED1 , FaPYR1  y FaSnRK2 mostraron inicialmente diferencias significativas
en las frutas RNAi y OE en comparación con los controles a 3 ppp y un cambio en  FaABI5 se
detectó cambio de expresión a 5 ppp. Además, junto con la extensión de los días de infiltración, las
transcripciones de FaPYR1 , FaSnRK2 y FaABI5 en frutos OE se acumularon más de 3 veces que
en los controles a 5 o 7 ppp, mientras que FaNCED1 también se reguló significativamente. Mientras
tanto, el silenciamiento de FvTCP9 disminuyó significativamente esos mismos genes a 3, 5 y 7 ppp.
 Figura 4 La alteración de la expresión de FvTCP9 afecta a las transcripciones de un conjunto de genes relacionados con ABA.

También se evaluó el color que es el rasgo fenotípico más fácil de identificar en caso de que la fruta
este madurando y se determina por la antocianina. En la figura ( 5 A) se muestra una ruta de
biosíntesis de antocianina donde se incluye FaPAL (fenilalanina amoniaco liasa), Fa4CL (4-
Coumaroyl-CoA-ligasa), FaF3H (Flavanona 3 hidroxilasa), FaCHS (Chalcone sintasa), FaCHI
(Chalcone isomerasa), FaDFR( dihidroflavanol reductasa), FaANR (antocianidina reductasa)
y FaUFGT (UDP-glicol flavonoide 3-O-glicosiltransferasa).  En frutos OE, el análisis de transcripción
sugirió que la expresión de FaCHS , FaF3H , FaCHI y FaUFGT fue más de cinco veces mayor que
en el control, y FaDFR , FaANS , FaMYB1 y FaMYB10 también estaban
significativamente regulados En las frutas RNAi, la transcripción de FaDFR se reguló ligeramente
hacia abajo, y los niveles de FaANS , FaUFGT , FaMYB1 y FaMYB10 fueron significativamente
más bajos que en el control (figura 5 B). Sin embargo, el gen aguas arriba FaPAL mostró un nivel de
expresión significativamente menor que las frutas OE, pero aumentó en frutas RNAi (figura 5 B). 

Figura 5 La alteración de la expresión de FvTCP9 afecta las transcripciones de un conjunto de genes relacionados con antocianinas.

Una semana después de la inyección, se analizaron los genes relacionados con la maduración de
fresa por RT-qPCR. En la figura 6, la expresión transitoria de FvTCP9 (ARNi y OE) regulaba
notablemente la expresión de aquellos genes implicados en la biosíntesis del azúcar, ablandamiento
de la fruta, color, y metabolismo del aroma, incluyendo FaQR (quinina oxidorreductasa), FaSUT1
(sacarosa transportadores 1), FAOMT (O-metiltransferasa), FaCHI (Chalcone isomerase), FaC4H
( Cinnamate-4-hydrox),Fa4CL (4-coumaroyl-CoA ligase), FaGAL1 / 2/3 (Bgalactosidase1 / 2/3)
y FaEXP1 / 2/5 (Expansin1 / 2/5 ). En las frutas OE, los niveles de transcripción de casi todos los
genes de maduración, excepto FaEXP1 y FaEXP5 , aumentaron significativamente en comparación
con los controles y las frutas RNAi. 
Entre ellos, las transcripciones de FaC4H , FaGAL1 y FaQR aumentaron más de 10 veces (Figura
6). No hubo diferencias significativas en la expresión de FaEXP5 y el control ( Figura 6). En las rutas
RNAi, las transcripciones de FaEXP1 fueron dos veces mas que en el control, mientras que no se
detectaron diferencias significativas en las transcripciones de FaGAL1 y FaGAL2.

Figura 6 La alteración de la expresión de FvTCP9 afectó las transcripciones de un conjunto de genes relacionados con la maduración

Para evaluar si FvTCP9 promueve la maduración de la fruta a través de las vías de señalización
Aba, se inyecto ABA a 5 mM en frutas de 2 semanas de edad que todavía estaban unidas a plantas.
Se encontró que la mayoría de las frutas de tratamiento ABA (16-20) se volvieron rojas mientras que
las frutas de control todavía estaban verdes a 5ppp como se muestra en la figura (7 A). En el
contenido promedio de antocianinas en las frutas inyectadas fue significativamente mayor que en las
frutas de control, como se observa en la figura (7 B).

Figura 7 Efectos de ABA en el desarrollo de frutos de fresa.

Tras observar que la expresión transitoria de FvTCP9 puede afectar el contenido de antocianinas
(figura 3 D) y regula la expresión de genes relacionados con antocianinas (figura 5 B). Se realizo un
ensayo de dos híbridos de levadura, para confirmar que FVTCP9 esta involucrado en la vía de
señalización de antocianinas. Los resultados mostraron que el vector recombinante que
contiene FvTCP9 de longitud completa mostró una fuerte autoactivación en células de levadura. Sin
embargo, los vectores que contienen el dominio TCP y la secuencia de codificación del extremo N-
terminal de la proteína FvTCP9 (1–232 aminoácidos) no mostraron autoactivación, lo que significa
que las partes separadas de FvTCP9 (dominio TCP) eran adecuadas para la detección de Y2H
( Figura 8 A). Posteriormente se uso el dominio TCP para probar si FvTCP9 interactuaba con genes
relacionados con antocianinas, y se encontró que la única relación de interacción fue detectada entre
FvTCP9 y FaMYC1 como se muestra en la figura (8 B)
 Figura 8 FvTCP9 interactuó con FaMYC1 en el ensayo de dos híbridos de levadura.

Discusión
FvTCP9 como miembro de la familia TCP de fresa fue identificado y aislado para evaluar sus
funciones mediante silenciamiento y sobreexpresión de ARNi transitorio, análisis de transcripción y
análisis de interacción de proteínas. Desde la premisa que los factores de transcripción TCP están
involucrados en la integración de la proliferación celular, se somete el estudio hacia FvTCP9
indicando que contribuye a la regulación de la maduración de al fruta. Se demostró que FvTCP9
pertenece al conjunto CYC/ TB1 y estos están involucrados en el desarrollo de meritemos axilares
que dan lugar a flores o brotes. Otra premisa para el estudio es que TCP18 actúa aguas abajo de
auxina y estrigolactona para coordinar el crecimiento de los brotes axilares, y los mutantes
mostraron un mayor número de ramas de roseta [ CITATION JAA07 \l 1033 ]. Por
tanto FvTCP9 muestra alta homología con AtTCP18 y un nivel de transcripción significativamente
relativo en frutas, y FvTCP9 se expresó específicamente en frutas rojas. Por tanto se especula que
estaba involucrado en el crecimiento y desarrollo del fruto.
La expresión transitoria por infiltración de Agrobacterium fue útil para definir funciones genéticas en
el desarrollo y maduración del fruto y determinar los mecanismos moleculares o las vías de señal
involucradas. Mediante esta técnica de expresión transitoria, FaCHS , un gen de biosíntesis clave de
la antocianina, fue silenciado con éxito por el virus del sonajero del tabaco ( pTRV) en las frutas de
fresa [ CITATION HFJ11 \l 1033 ]. A raíz de esto se generó VIGS y vectores de sobreexpresión que
contienen fragmentos amplificados de FvTCP9 para silenciar y sobreexpresar este gen.
El desarrollo y la maduración del fruto es un proceso complejo que se controla por redes de
regulación transcripcional. En la fresa, ABA desempeña un papel crucial en la regulación de la
maduración. Además es una molécula señal que promueve la maduración de la fresa y los
supuestos receptores de ABA, como FaCHLH / ABAR y FaPYR, son reguladores de la maduración
de la fruta en respuesta a ABA . FaCHLH / ABAR y FaPYR están involucrados en dos vías de
señalización ABA centrales diferentes [ CITATION YMC11 \l 1033 ]. Por lo que en este estudio se
encontró que FvTCP9 regulaba la biosíntesis de ABA y que el contenido de ABA aumentaba junto
con la expresión de FvTCP9 y el análisis de transcripción sugiere que FvTCP9 modula un conjunto
de transcripciones de genes que responden a ABA. Como se muestra en la Figura 4 el análisis RT-
qPCR determinó transcripciones de FaNCED1 , FaPYR1 , FaSnRK2 y FaABI5 estaban
significativamente regulados negativamente en frutos de ARNi en comparación con los frutos de
control, pero regulados positivamente en frutos de sobreexpresión. Esto especula que FvTCP9 alteró
la expresión del gen de biosíntesis ABA FaNCED1 y es un gen aguas arriba en las vías de
señalización de ABA, que puede regular el proceso fisiológico de la biosíntesis de ABA.
Existe una red de señalización central que regula la actividad fisiológica de la maduración del fruto
de fresa, PYR1-PP2C-SnRK2. Los resultados del análisis de transcripción demuestran
que FvTCP9 puede estar involucrado en esta vía de señalización como se muestra en la figura 4. El
ensayo de tratamiento de ABA muestra que los fenotipos, las condiciones fisiológicas y los cambios
en la transcripción de los genes relacionados con ABA en las frutas inyectadas consisten en los
resultados de FvTCP9 en la figura 7. En la soja, GmTCP8, un gen altamente homólogo a FvTCP9 ,
interactuó con el receptor ABA GmPYL10 en respuesta al estrés abiótico y las señales hormonales
[ CITATION ZJF18 \l 1033 ]. Del mismo modo, OsTCP19 interactúa con OsABI4 en la modulación de
las vías del ácido abscísico y la estructura de la cromatina en el arroz [ CITATION PMu15 \l 1033 ].
Esto sugiere que las familias TCP son moléculas de señalización involucradas en la vía de
señalización de ABA. En fresa, FvTCP9 promueve la maduración de frutos al regular la biosíntesis
de ABA.
En el caso del color del fruto se plasma acerca de las antocianinas que en combinación con
carotenoides-clorofilas, contribuyen a dar coloración del fruto. Además los flavonoides, antocianinas
y proantocianidinas dan a las frutas su fenotipo rojo. En este rubro el contenido de antocianinas
aumentó /disminuyó en FvTCP9-OE / RNAi, y las frutas se volvieron rojas o permanecieron blancas
como se observa en la figura (2, 3) Este resultado indica que FvTCP9 también participa en la
biosíntesis de antocianinas y se regula a nivel transcripcional a través de genes estructurales como
FaPAL, FaCHS, FaCHI, FaANS y FaUFGT . Sin embargo, la expresión del gen aguas
arriba FaPAL mostró el resultado opuesto para otros genes como FaCHS , FaANS y FaUFGT. Con
esto se especula que FvTCP9 puede estar involucrado en una vía de MBW análoga al igual que
AtTTG1/2/8 y que FvTCP9 podría realizar la función opuesta, además de reducir las concentraciones
de PA y aumentar en antocianinas en la maduración de la fresa. Por último, se realizó un ensayo de
dos híbridos de levadura para detectar si FvTCP9 podía interactuar con dichos genes. Y se
determinó que FvTCP9 interactúa con FaMYC1 que es también una proteína básica Helix-Loop-
Helix y homóloga a FaBHLH33, y puede interactuar con FabHLH33 o FaTTG en condiciones
específicas y participar en la vía MBW [ CITATION AGa18 \l 1033 ]. Por lo tanto FvTCP9 está
claramente involucrado en la regulación de biosíntesis de antocianinas.
En una vía, FvTCP9 regula el gen FaNCED1 aguas arriba que produce cambios en el contenido de
ABA, y los genes aguas abajo responden a través de la ruta ' FvTCP9-ABA-FaPYR  ' figura (4,7). La
otra vía ayuda a regular la biosíntesis de antocianina, como lo demuestra la interacción entre
FvTCP9 y FaMYC1 (figura 8). La vía es ' FvTCP9-FaMYC1- antocianina'. Por lo
tanto, FvTCP9 puede desempeñar un papel en dos vías de señalización para regular la maduración
de la fruta en la fresa (figura 9). Por lo tanto este trabajo ofrece una referencia para estudiar otros
genes TCP e investigar la maduración de la fruta. Siendo este uno en el cual se identificó un posible
gen de maduración temprana, FvTCP9.
Conclusión
En este estudio se identifico y aisló un factor de transcripción de fresa FvTCP9 y se verifico la
función de la familia TCP en la maduración de frutas de fresa. Además de que el ARNi transitorio y la
sobreexpresión de FvTCP9 en frutos de fresa inhibieron/promovieron la maduración del fruto. El
análisis de transcripción sugirió que ABA y antocianina desempeñan papeles vitales en este proceso
fisiológico que se confirmo por un tratamiento de ABA y de dos híbridos de levadura. Todo esto
determina que FvTCP9 promueve la maduración de la fresa al regular la biosíntesis de ABA y
antocianinas.

Bibliografía

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ANEXO
Materiales y métodos
1. Materiales vegetales y condiciones de crecimiento.
En este estudio se utilizó la fresa diploide de bosques silvestres F. vesca accesión 'Heilongjiang-3' y
la fresa octaploide cultivada F. ananassa cv. 'Ningyu'. Se cultivaron en un invernadero (20 ° C −25 °
C, humedad relativa del 70% –85%, sin luz suplementaria) del College of Horticulture, Northwest
A&F University, Shaanxi, Yangling, China (34 ° 20ʹN108 ° 24ʹE ) durante las temporadas de
primavera de 2017 y 2018.
Órganos y tejidos de fresa 'Heilongjiang-3' (R: raíces, S: tallos, L: hojas, F: flores, flores maduras con
pétalos parcialmente marchitos, BG: grandes frutos verdes, receptáculos verdes maduros, Wt: frutos
blancos, receptáculos blancos con aquenios verdes y FR: frutos completamente maduros) para el
análisis de transcripción específico de tejido, y los frutos se cosecharon en diferentes etapas de
desarrollo para medir la expresión específica de FvTCP9 gene.

Los materiales de transformación transitorios fueron frutos 'Ningyu' (grandes frutos verdes), y se
etiquetaron alrededor de 200 flores en 50 plantas durante la antesis.  Se recogieron veinte frutos de
fresa de tamaño uniforme en cada etapa de desarrollo (BG: fruta verde grande, Wt: fruta blanca, FR:
frutas completamente rojas). Posteriormente se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a
80 ° C hasta su uso posterior.
2. Aislamiento y análisis de secuencia del gen FvTCP9
El ARN total se extrajo de las hojas 'Heilongjiang-3' usando kits de ARN de plantas EZNA (R6827-
01, Omega Bio-tek, EE. UU.) El ARN total se trató con DNasa I (libre de ARNasa; TaKaRa
Biotechnology, Dalian, China) para eliminar todo el ADN genómico contaminante residual, y 1,5 μg
de ARN total extraído de cada muestra se transcribió inversamente en ADNc de primera cadena.
utilizando PrimeScript ™ RTase (TaKaRa Biotechnology, Dalian, China)
La secuencia de codificación de ADN (CDS) de FvTCP9 se amplificó con polimerasa de arranque en
caliente de alta fidelidad (TaKaRa, Dalian, China) utilizando cebadores específicos de genes:
adelante, 5ʹ-ATGTTTCCTTATAGCTCAAAC G-3ʹ; reverso, 5ʹ-AAATCCATTATGAGTACTACTGTT-3ʹ.
Los productos de PCR amplificados se clonaron en el vector pMD-18T (TaKaRa, Dalian, China) y
AuGCT Biotech Co., Ltd (Beijing, China) verificó la secuencia del plásmido recombinante pMD-18T-
FvTCP9. BLAST-P identificó las secuencias de aminoácidos deducidas de FvTCP9 y sus
homólogos, utilizando la secuencia de aminoácidos completa de FvTCP9 como una consulta en
NCBI.
Para investigar la relación homóloga entre FvTCP9 y otros genes TCP que se ha estudiado en la
maduración de la fruta, las alineaciones de secuencias de aminoácidos correspondientes se
realizaron con el software ClustalX 2.0.12, y los resultados se editaron con el software Genedoc. El
análisis filogenético se realizó con el software MEGA 6.0 utilizando el método de unión de vecinos y
la prueba de arranque se repitió 1000 veces.
3. Construcción de plásmidos
Para producir vectores recombinantes de sobreexpresión, el CDS de FvTCP9 se amplificó a partir
del plásmido de fusión pMD-18T-FvTCP9 usando los siguientes cebadores específicos:
Adelante,5ʹ-TCTGATCAAGAGACA GGATCC ATGTTTCCTTATAGCTCAAACG-3ʹ Reverso 5ʹ
CCCTTGCTCACCATGGATCC AAATCCATTATGAGTACTACTGTT-3ʹ (ambos con un sitio de
restricción Bam HI). Posteriormente se realizó una PCR.
Los fragmentos amplificados se insertaron luego en el BamSitio de restricción HI del vector de
expresión binaria de planta C15 que contiene el promotor CaMV 35S para generar la construcción
de sobreexpresión de plásmido recombinante 35S: FvTCP9-YFP. Para silenciar FvTCP9 , se usó el
vector pTRV (virus del sonajero del tabaco), que incluye pTRV1 y pTRV2 para el silenciamiento
génico inducido por virus (VIGS). 
Se clonó un fragmento de 449 pb del plásmido pMD-18T-FvTCP9 mediante los siguientes
cebadores: adelante, 5ʹ-TGAGTAAGGTTACC GAATTC CCTCTTCATCGTC TTGCTAAC-3ʹ (con
un sitio de
restricción Eco RI); reverso,5ʹGTGAGCTCGGTACC GGATCC CAGAGAATGGAAAATGGAAGAGGA
GC-3ʹ (con un sitio de restricción Bam HI). Para eliminar la redundancia genética, seleccionamos
una secuencia conservada de 539 pb que era común en el clado CYC / TB1 de Clase II, incluidos
tres miembros FvTCP FvTCP9 , FvTCP14 y FvTCP6 para construir el vector pTRV2-FvTCP6 / 9/14 y
silenciar la subfamilia de FvTCP9 . Los fragmentos conservados se amplificaron usando los
siguientes cebadores: adelante, 5ʹ- TGAGTAAGGTTACC GAATTC CATTCCATCCTCCTTTGTC
TTTCGTCTA CTT-3ʹ; reverso, 5ʹ-GTGAGCTCGGTACC GGATCC GTGCCAGATA
CAACTTCACAATC AG-3ʹ.
4. Ensayo de expresión transitoria
La cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens que contiene el vector de fusión C15-FvTCP9, se
usó para el experimento de sobreexpresión. Para VIGS, los cultivos de A. tumefaciens cepa GV3101
que contienen pTRV1 y pTRV2- FvTCP9 en una proporción 1: 1 se infiltraron en frutos verdes
grandes (BG), y los frutos de control se infiltraron con los vectores vacíos pTRV1 y pTRV2 en una
proporción 1: 1 solo. La expresión del gen diana fue controlada por el promotor CaMV 35S. Para
evitar la redundancia génica, también generamos otro vector VIGS pTRV2-FvTCP6 / 9/14 que
contiene un fragmento de 539 pb que se conservó en el clado CYC / TB1 ( FvTCP6 / 9/14 ) de clase
II TCP. A. tumefaciens La cepa GV3101 se cultivó a 28 ° C en medio líquido Luria-Bertani (LB) que
contenía MES 10 mM y acetosiringona 20 mM con antibióticos apropiados durante aproximadamente
14 h. La infiltración de plásmido recombinante mediada por Agrobacterium se inyectó en veinte
grandes frutos verdes de fresa (BG) todavía unidos a la planta con una jeringa estéril de 1 ml
aproximadamente 14 días después de la polinización.
5. Análisis de transcripción génica
La extracción total de ARN y la síntesis de ADNc de primera cadena se realizaron utilizando kits de
ARN de plantas EZNA (R6827-01, Omega Bio-tek, EE. UU.) Y PrimeScript ™ RTase (TaKaRa
Biotechnology, Dalian, China) de acuerdo con los protocolos del fabricante. RT-qPCR se realizó en
reacciones de 20 l que contenía 10 l de SYBR Green Premezcla Ex Taq II (Takara Biotecnología),
0,8 l de 1,0 M de cada cebador, 1 l de moldes de cDNA y 7,4 l de agua destilada estéril H 2 O,
usando una Máquina de PCR en tiempo real IQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Se realizó un
amplificación y el análisis de la curva de fusión. Se analizaron tres réplicas biológicas con tres
réplicas técnicas para cada muestra.
6. Determinación de la firmeza de la fruta, azúcar soluble, antocianina y contenido de ABA
Se usaron cuatro frutas de fresa uniformes para detectar la firmeza, el azúcar soluble, el contenido
de antocianinas y el contenido de ABA. El método de detección del contenido de antocianinas se
utilizó mediante espectrofotometría. Se usó un refractómetro digital (TD-45, China) para medir el
contenido de azúcar soluble. El contenido de ABA se determinó por cromatografía de gases-
espectroscopía de masas. La firmeza se detectó en dos lados de cada fruta usando un penetrómetro
de fruta GY-4 (Digital Force Gauge, Shanghai, China). ABA se extrajo y se midió usando HPLC
(cromatografía líquida de alta resolución)
7. Tratamiento de ABA
Se inyectaron 100 μl de ABA exógeno 5 mM tres veces en días alternos con una jeringa de 1 ml en
20 frutos blancos uniformes aún unidos a las plantas. Se inyectaron cantidades equivalentes de
dimetilsulfóxido (DMSO, disolvente ABA) en frutas blancas como control. Los fenotipos de estas
frutas se observaron a 5 ppp. El experimento se realizó con tres repeticiones.
8. Análisis estadístico
La significación estadística se determinó mediante una prueba t de Student emparejada
( http://www.physics.csbsju.edu/stats/ ). Se presentan la media ± desviaciones estándar de la media
(DE) de al menos tres réplicas, y las diferencias significativas con respecto a los controles se indican
en * p <0.05 y ** p <0.01.