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Anónimo
Biología molecular y citogenética
1º Anatomía Patológica y Citodiagnóstico
ORGANIZACION PROFESIONAL ESPAÑOLA, OPESA
Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
TEMA 1: INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................... 4
ESTRUCTURA DEL ADN Y ARN ........................................................................................................................ 4
Bases nitrogenadas .............................................................................................................................. 4
Grupo fosfato (P) ................................................................................................................................. 4
Formación de nucleótidos .................................................................................................................... 4
Nucleótidos de ADN (dNTP) ................................................................................................................. 5
Unión de nucleótidos ........................................................................................................................... 5
ESTRUCTURA Y COMPOSICIÓN DEL ARN ............................................................................................................ 6
REPLICACIÓN DEL ADN .................................................................................................................................. 7
EXPRESIÓN GENÉTICA ..................................................................................................................................... 9
Transcripción del ADN.......................................................................................................................... 9
Traducción de ARNm ........................................................................................................................... 9
PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS .................................................................................. 11
ENZIMAS EMPLEADAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR ................................................................................................ 13
Nucleasas ........................................................................................................................................... 13

Endonucleasas de restricción ............................................................................................................. 13
MUTACIONES Y POLIMORFISMOS.................................................................................................................... 15
Mutaciones génicas ........................................................................................................................... 15
Mutaciones cromosómicas ................................................................................................................ 15
POLIMORFISMOS......................................................................................................................................... 16
Polimorfismos de secuencia ............................................................................................................... 17
Polimorfismos de longitud ................................................................................................................. 17
TEMA 2: EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS ........................................................... 18
FASES ....................................................................................................................................................... 18
PRETRATAMIENTO ....................................................................................................................................... 18
Sangre ................................................................................................................................................ 18
Cultivos celulares ............................................................................................................................... 19
Tejidos en fresco ................................................................................................................................ 19
Tejidos fijados en formol e incluidos en parafina .............................................................................. 20
Otras muestras (cultivos de bacterias y levaduras) ........................................................................... 20
EXTRACCIÓN .............................................................................................................................................. 21
Ruptura de paredes celulares ............................................................................................................ 21
Desintegración de membranas celulares ........................................................................................... 21
Inactivación de nucleasas .................................................................................................................. 21
Extracción final .................................................................................................................................. 21
PURIFICACIÓN ............................................................................................................................................ 22
Purificación con solventes orgánicos ................................................................................................. 22
Precipitación por salting-out.............................................................................................................. 22
Cromatografía de intercambio iónico ................................................................................................ 23
Cromatografía de adsorción .............................................................................................................. 23
Purificación mediante esferas magnéticas ........................................................................................ 24
Purificación de plásmidos por lisis alcalina ........................................................................................ 25
EXTRACCIÓN DE ARN .................................................................................................................................. 25
CALIDAD DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS PURIFICADOS ............................................................................................. 25
Integridad .......................................................................................................................................... 25
Pureza ................................................................................................................................................ 26
Concentración .................................................................................................................................... 28
TEMA 3: PCR ........................................................................................................................................ 29
INTRODUCCIÓN........................................................................................................................................... 29
PCR ESTÁNDAR .......................................................................................................................................... 29
1
a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-5869978
Ciclo básico ........................................................................................................................................ 29
Elementos para una PCR estándar..................................................................................................... 30
Preparación de las muestras .............................................................................................................. 31
Análisis de los productos de la PCR: electroforesis ............................................................................ 32
PCR ANIDADA ............................................................................................................................................ 33
PCR MÚLTIPLE ........................................................................................................................................... 33
RT-PCR .................................................................................................................................................... 33
PCR A TIEMPO REAL .................................................................................................................................... 33
Sistemas independientes de secuencia .............................................................................................. 33
Sistemas específicos de secuencia ..................................................................................................... 33
Resumen de sondas ........................................................................................................................... 35
TEMA 4: CLONACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS ....................................................................................... 36
INTRODUCCIÓN........................................................................................................................................... 36
SELECCIÓN DEL INSERTO ............................................................................................................................... 36
VECTORES DE CLONACIÓN ............................................................................................................................. 36
Plásmidos ........................................................................................................................................... 36
Bacteriófagos/fagos .......................................................................................................................... 37
Cósmidos, fagémidos y cromosomas artificiales ............................................................................... 37
CÉLULAS HOSPEDADORAS ............................................................................................................................. 37
Procariotas ......................................................................................................................................... 37
Eucariotas .......................................................................................................................................... 37

FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN ................................................................................................................ 38
1. Creación del vector recombinante ................................................................................................. 38
2. Introducción del vector en la célula hospedadora (transformación) ............................................. 38
3. Selección e identificación de clones recombinantes ...................................................................... 39
TEMA 5: APLICACIONES EN GENÉTICA FORENSE .................................................................................. 42
INTRODUCCIÓN........................................................................................................................................... 42
ANÁLISIS DE STR MEDIANTE PCR ................................................................................................................... 42
Electroferograma ............................................................................................................................... 42
Análisis estadístico de los datos ......................................................................................................... 43
ANÁLISIS DE ADN MITOCONDRIAL .................................................................................................................. 43
ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS DEL CROMOSOMA Y ............................................................................................. 43
TEMA 6: TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN .................................................................................................... 44
INTRODUCCIÓN........................................................................................................................................... 44
HIBRIDACIÓN EN SOPORTE SÓLIDO .................................................................................................................. 44
Dot blot .............................................................................................................................................. 44
Southern blot ..................................................................................................................................... 45
Northern blot ..................................................................................................................................... 46
Microarrays........................................................................................................................................ 46
HIBRIDACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO ................................................................................................................... 47
Técnica de captura de híbrido ............................................................................................................ 47
Técnica de ADN ramificado (ADNb) ................................................................................................... 47
HIBRIDACIÓN IN SITU (ISH) ........................................................................................................................... 48
Hibridación in situ con fluorescencia (FISH) ....................................................................................... 48
Hibridación in situ cromogénica (CISH) .............................................................................................. 51
TEMA 7: SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS ................................................................................ 52
INTRODUCCIÓN........................................................................................................................................... 52
MÉTODO DE SANGER ................................................................................................................................... 52
SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA (1ª GENERACIÓN)............................................................................................... 53
si lees esto me debes un besito

SECUENCIACIÓN MASIVA (2ª GENERACIÓN/NGS).............................................................................................. 53
SECUENCIACIÓN DE 3ª GENERACIÓN ............................................................................................................... 54
Secuenciación Ion Torrent .................................................................................................................. 54
Secuenciación por nanoporos ............................................................................................................ 54
TEMA 8: CITOGENÉTICA ....................................................................................................................... 55
INTRODUCCIÓN........................................................................................................................................... 55
OBSERVACIÓN DE CROMOSOMAS ................................................................................................................... 55
OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DEL CARIOTIPO ............................................................................................................ 57
1. Cultivo de linfocitos ........................................................................................................................ 57
2. Obtención de extensiones en metafase ......................................................................................... 57
3. Bandeo de cromosomas ................................................................................................................. 57
4. Análisis de cromosomas ................................................................................................................. 57
CRITERIOS DE ORDENAMIENTO DEL CARIOTIPO HUMANO ..................................................................................... 58
FÓRMULA CROMOSÓMICA ............................................................................................................................ 58
TEMA 9: CULTIVOS CELULARES (RESUMEN) ......................................................................................... 59
INTRODUCCIÓN........................................................................................................................................... 59
CURVA DE CRECIMIENTO ............................................................................................................................... 59
TIPOS DE CULTIVO Y MEDIO ........................................................................................................................... 59

Tema 1: Introducción
ESTRUCTURA DEL ADN Y ARN
ADN
Ácidos nucléicos ⟨ } Unión de NUCLEÓTIDOS: pentosa, base nitrogenada y P (fosfato)
ARN
Las pentosas pertenecen al grupo de los glúcidos. Contiene 5 moléculas de monosacáridos.
Hay dos tipos: desoxirribosa y ribosa.
Desoxirribosa Ribosa
Bases nitrogenadas

Son también moléculas cíclicas:
- Adenina (A).
- Guanina (G).
- Citosina (C).
- Timina (T).
- Uracilo (U).
Grupo fosfato (P)

Es una estructura que contiene fosfato y se une a través del carbono 5.
Formación de nucleótidos

Nucleótidos de ADN (dNTP)
Para nombrar cada nucleótido diferenciando su base nitrogenada, se utilizan las siguientes
abreviaturas: dATP, dGTP, dCTP y dTTP. En el caso de ARN, serían rNTP: rATP, rGTP, rCTP y rUTP.
Ejemplo:

Unión de nucleótidos
Los nucleótidos se unen a través de un enlace fosfodiéster entre el oxígeno del carbono 3 y el
grupo fosfato del siguiente, por lo que se libera H2O en esta reacción.
5
El ADN puede ser monocatenario (una cadena) y bicatenario (dos cadenas), aunque existen
muchas otras formas.
Las cadenas que se unen son antiparalelas (el extremo 5’ de una coincide con el 3’ de la otra),
complementarias (la adenina se une con la timina y la guanina con la citosina) y helicoidales
(forman hélices).
Las bases nitrogenadas se unen mediante puentes de hidrógeno: la actina y la timina con dos
enlaces y la guanina y citosina con tres enlaces.
En cada giro completo de la hélice se encuentran 10 pares de bases nitrogenadas.
Abreviaturas:
pb = pares de bases.
mc = monocatenario (ss en inglés).
bc = bicatenario (ds en inglés).
ESTRUCTURA Y COMPOSICIÓN DEL ARN

Componentes:
- Pentosa (ribosa).
- Bases nitrogenadas (A, G, C, U).

- Grupo fosfato (P).
El ARN es siempre monocatenario.
Tipos de ARN:
- ARNm (mensajero).
- ARNr (ribosómico).
- ARNt (transferente).
- ARNn (nucleolar).
Todos tienen una estructura lineal, excepto el transferente:
El ARNm saca la información del ADN y la transforma en información del ARNm.
El ARNr sirve para formación estructural (ribosomas).
El ARNt transporta los aminoácidos necesarios para formar proteínas tras leer la información del
ARNm.
El ARNn se encuentra en el nucleolo.

Procesos:
REPLICACIÓN DEL ADN
Enzimas involucradas:
- Helicasas → abren la hebra de ADN para poder replicar ese fragmento.

- SSBP → se encargan de mantener abierta la hebra.
- Topoisomerasas/girasas → eliminan los nudos para reducir la tensión y ayudar a las
helicasas.
- Ori (origen) → supone el origen de replicación.
- Pol (polimerasas) → sintetizan ácidos nucleicos (ARNpol o ADNpol) y los une mediante
el enlace fosfodiéster. Necesitan la hebra de otro ácido nucleico para poder hacer la
replicación.
PROCESO:
En el ADN se encuentra un triplete de bases que indica el origen de la replicación: ORI.
Es necesario que para que comience la replicación se abra una “burbuja de replicación”. Para
ello, las helicasas rompen los puentes de hidrógeno de las bases nitrogenadas. A su vez, las SSBP
(Single-stranded binding protein) estabilizan las cadenas para evitar que vuelvan a unirse. Las
girasas o topoisomerasas eliminan los nudos que van encontrando y reducen la tensión para
ayudar a las helicasas.
Para que el ADNpol III pueda sintetizar la hebra, es necesario que el ARNpol sintetice el “primer”
(en este caso, al ARNpol también se le llama “primasa” por su función). Este primer es una corta
cadena de ARN complementaria a la hebra molde, y a ella se le une una ADNpol III para
continuar con la replicación. Esta replicación se realiza leyendo la hebra molde en sentido 3’→5’,
pero se sintetiza en sentido 5’→3’, ya que las cadenas complementarias siempre van en sentido
contrario.

La hebra que inició en el ORI continua todo seguido y va añadiendo los nucleótidos con la
ADNpol III a medida que las helicasas abren la burbuja: se denomina “hebra continua”. Por el
lado contrario, al ser el sentido de lectura 3’→5’, no se puede hacer todo seguido, por lo que se
van colocando varios primer y creando hebras a medida que las helicasas de ese lado abren la
burbuja: se denominan “fragmentos Okazaki”, y su conjunto forma la “hebra discontinua” o
“hebra retardada”.
Este proceso ocurre en ambas cadenas a la vez y a lo largo de todo el ADN.
Cuando se forman tanto las hebras retardadas como la continua, el ADNpol I sustituye los
fragmentos de ARN creados por la primasa por fragmentos de ADN (ya que toda la cadena
creada debe ser de ADN).
Cuando las cadenas son completamente de ADN, las ligasas unen cada fragmento y cada hebra
en una, formando así la cadena completa de ADN, complementaria a su hebra molde, y
finalizando el proceso de replicación.

EXPRESIÓN GENÉTICA
En la expresión NO hay replicación de ADN: son dos procesos diferentes que ocurren en
diferentes momentos del ciclo celular.
El ADN no puede salir al citoplasma debido a unas enzimas protectoras que lo destruirían (las
nucleasas), por lo que de ello se encarga el ARNm, que surge de la transcripción del ADN y sale
al núcleo para unirse a los ribosomas y realizar la traducción y síntesis proteica.
Transcripción del ADN

De este proceso se encarga la ARNpol.
En la cadena del ADN existen “genes codificantes”, que son los que contienen la información
necesaria para la síntesis de una proteína. Cada gen codificante tiene un “promotor” (también
llamado “caja TATA” o “caja CAAT”), que indica el inicio de la transcripción; y una secuencia de
terminación.

La ARNpol reconoce el promotor, lee y replica la hebra complementaria a la hebra molde. En
este caso, no necesita de otras enzimas (como las helicasas): es una reina y se sirve por sí
sola.
Todo este proceso se realiza DENTRO del núcleo.
MADURACIÓN:
Definición: proceso por el que las cadenas de ARN se convierten en los diferentes tipos de ARN.
Cuando se ha sintetizado la hebra de ARN, esta pasa a llamarse “ARNhn” (heterogéneo nuclear)
o Pre-ARNm, ya que contiene “intrones” (partes no codificantes) y “exones” (partes
codificantes). Para poder realizar más adelante la traducción, es necesario que solo haya exones,
es decir, que el ARNm solo contenga datos codificantes.
En un proceso denominado “splicing”, el ARNhn elimina los intrones. Luego, se agrega una
“caperuza” en el extremo 5’ (formada por una guanosina trifosfato metilada) y una “cola de poli-
A” (conjunto de muchas bases nitrogenadas de adenina seguidas). Esto es necesario para que al
salir del núcleo las nucleasas no lo destruyan y permitan su estancia durante algo más de tiempo.
Una vez realizado esto, se convierte en ARNm y sale al citoplasma para realizar la traducción.
Traducción de ARNm
Definición: proceso por el que, a partir de una secuencia de ARNm, se sintetiza una secuencia
proteica.
El ARNt contiene el “anticodón”, un triplete de bases que es complementario a los tripletes que
se encuentran en el ARNm (“codones”), y está unido a un aminoácido concreto codificado por
dicho codón.
Este proceso se realiza FUERA del núcleo (en el citoplasma) y se encargan de ello los ribosomas.
En este caso, el ARNm se lee en sentido 5’→3’ (única excepción en las lecturas).
9
El ARNm contiene un triplete de bases que inicia la traducción: es el AUG (codifica la metionina).
Los ribosomas comienzan a leer la cadena hasta que se encuentran con el codón de iniciación
AUG, y esperan a que un ARNt con el anticodón adecuado se una y traiga consigo el aminoácido
codificado por el codón complementario.
Los ribosomas van leyendo la cadena y los ARNt van colocando por orden los aminoácidos y
uniéndose por enlaces peptídicos, hasta que los ribosomas se encuentran con un codón de
terminación y finaliza la síntesis de la proteína.
El código genético indica qué triplete codifica cada aminoácido, y es universal para cualquier ser

vivo de La Tierra (los reptilianos no sé qué codificarán pero nada bueno te lo digo yo).
EJERCICIO: Dada la siguiente secuencia de ADN bicatenario, deduce la secuencia de bases del
correspondiente ARNm y la secuencia de aminoácidos de la secuencia polipeptídica, teniendo en
cuenta que la cadena molde es la que aparece en rojo.
5’ – ATGGAGTGTGCCGACTTCTACGAGGCGGAGCCGCGGCCCCCGATGAGCAGCTAG – 3’
3’ – TACCTCACACGGCTGAAGATGCTCCGCCTCGGCGCCGGGGGCTACTCGTCGATC – 5’
1. Transcripción a ARNm y maduración:

5’ – AUGGAGUGUGCCGACUUCUACGAGGCGGAGCCGCGGCCCCCGAUGAGCAGCUAG – 3’
2. Traducción:
Met - Glu - Cys - Ala - Gac - Phe - Tyr - Glu - Ala - Glu - Pro - Arg - Pro - Pro - Met - Ser -
Ser.
10

PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
- Carácter ácido: ácidos en solución acuosa. *Explicación del pH más abajo*
- Viscosidad.
- Absorbancia: es la capacidad de absorber la luz. Los A.N. tienen un pico de absorción
con una luz UV de 260 nm de longitud de onda. *Explicación de absorbancia más abajo*
- Desnaturalización del ADN: separación de las dos hebras al aumentar la temperatura o
el pH. Es reversible. *Explicación de desnaturalización más abajo*
- Renaturalización: recuperación de la estructura de doble hélice al disminuir la
temperatura o el pH. *Explicación de renaturalización más abajo*
- Hibridación: posibilidad de que una secuencia de bases nitrogenadas se una a la
secuencia complementaria del ADN, bajo determinadas condiciones. *Explicación de
hibridación más abajo*
Explicación del pH:

El pH depende de la concentración de protones (H+) en el medio. Una
mayor concentración hace que sea más ácido, y una menor concentración
hace que sea más básico o alcalino.
Por ejemplo, el ácido H2SO4, al disolverse en el agua, se divide y se separan

sus protones (los hidrógenos), haciendo que aumente dicha
concentración de protones en el medio y por tanto se reduzca el pH (más
ácido).
En el ADN y el ARN, el grupo fosfato es el que hace que tengan carácter

ácido.
11

Explicación de la absorbancia:
Los ácidos nucleicos (ADN y ARN) tienen un pico de absorbancia en los 260
nm de longitud de onda, es decir, que con un haz de luz de esta longitud
absorben la mayor cantidad posible.
Conociendo este pico, se puede realizar un análisis en una máquina

llamada espectrofotómetro para saber la concentración de esta sustancia.

Explicación de la desnaturalización y la renaturalización:
De forma artificial pueden separarse las hebras de una cadena bicatenaria

(desnaturalización) aumentando la temperatura o el pH; y volverlas a unir
de forma natural (renaturalización) disminuyendo la temperatura o el pH.
Esto se puede realizar, por ejemplo, en las PCR, en las cuales se utiliza una
máquina llamada termociclador que se encarga de variar la temperatura
para separar las hebras.
Explicación de la hibridación:
Es la unión de dos secuencias de ADN por complementariedad.
Un ejemplo de su uso es cuando se quiere localizar una mutación

específica. Se coloca una “sonda” (un fragmento de ADN artificial que
codifica esa mutación) en el medio donde se encuentra ese ADN, se
desnaturaliza y se renaturaliza para que esa sonda se una a la mutación
por complementariedad, y en cuyo caso y según el tipo que sea, puede
volverse fluorescente, emitir radiación, etc. para poder localizarla, y si no
existe dicha mutación, no se uniría.
Un ejemplo de hibridación natural es cuando el primer se une a la hebra

molde en la replicación del ADN.
12

ENZIMAS EMPLEADAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR
Nucleasas
Realizan la hidrólisis del enlace fosfodiéster (degradan ácidos nucleicos).
Clasificación:
Ribonicleasas (ARNasa).
Según el tipo de ácido nucleico {
Desoxirribonucleasas (ADNasa).
Bicatenarias.
Según el tipo de cadena {
Monocatenarias.
Exonucleasas → desde un extremo.
Según la localización del punto de corte {Endonucleasas → en puntos intermedios.
Aleatorias → por cualquier sitio.
Aleatoriamente.
Según la especificidad {
En secuencias específicas (de restricción).

Endonucleasas de restricción
Rompen cadenas de ADN bicatenario en secuencias específicas llamadas “dianas de restricción”.
También se les llama “tijeras moleculares”.
- Tipo I: cortes de hasta 1000 pb antes o después de la diana. Fragmentos diferentes.

- Tipo II: cortes específicos en la diana. Patrones específicos.
- Tipo III: cortes de 25-30 pb fuera de la diana. Reconocen secuencias invertidas
(palíndromos).
Mapa de restricción: conjunto de dianas que tiene una endonucleasa a lo largo de una
secuencia.
Patrón de restricción: fragmentos de ADN divididos por una endonucleasa y ordenados por
tamaño mediante electroforesis. Son iguales dentro de una misma especie.
13
TIPOS DE CORTE:
- Extremos romos: se corta por el mismo punto en ambas cadenas (la diana está en el
centro de la secuencia).
- Extremos cohesivos: se corta en puntos distintos de las cadenas. Quedan regiones

sueltas que pueden unirse fácilmente a secuencias complementarias.
NOMENCLATURA:
Se nombran por 3 letras y un número romano. La primera letra en mayúscula indica el género
de la bacteria, las dos siguientes en minúscula son las de la especie, y el número romano indica
el orden de descubrimiento. Adicionalmente, pueden tener una segunda letra mayúscula tras
las 3 letras que indica la cepa.

USOS:
- ADN recombinante: para clonación de ADN, terapia génica, transgénicos… Se usa una
nucleasa de restricción con extremos cohesivos para introducir un gen dentro de una
cadena de ADN.
- Patrones de restricción: para comprobar si dos organismos son de la misma especie.
- PCR: para amplificar el ADN (hacer muchas copias). Se necesita de ADN polimerasas para
sintetizarlo.
o Retrotranscriptasas: en el caso de tener ARN, para poder usar la PCR, se necesita
pasarlo antes a ADN. Para ello se usan las “retrotranscriptasas” o “transcriptasas
inversas”, que lo transforman en ADN copia (ADNc). La PCR usada con ADNc se
llama “RT-PCR”.
▪ Ejemplo 1: Se adquiere el ARN de un virus y se quiere copiar. Para ello
se pasa a ADNc y se realiza la RT-PCR.
▪ Ejemplo 2: Se quiere estudiar la expresión genética. Para ello no se
puede coger el ADN sin más porque hay genes que no se expresan, por
lo que se deben coger los fragmentos de ARNm que son los que sí
contienen los genes codificantes, y se pasan a ADNc. Nota: este ADNc
no es igual que el ADN, ya que NO contiene intrones.
o Ligasas y topoisomerasas: para unir fragmentos de ADN y evitar
superenrollamientos (respectivamente).
14

MUTACIONES Y POLIMORFISMOS
Mutación genética: cambio espontáneo y aleatorio de la secuencia o estructura del ADN.
Las mutaciones son heredables para las células procedentes de la que tiene la mutación, pero
NO son necesariamente heredables a los hijos (ya que para ello la mutación debe estar en un
gameto).
Mosaicismo: presencia de dos o más poblaciones celulares con diferente genotipo (cada grupo
de células expresa genes diferentes). No siempre son mutaciones.
➔ Ejemplo:
Mutaciones génicas
Definición: alteraciones que afectan a un solo gen.
Según el tipo de cambio:
- Deleción (se elimina una base).

- Adición (se añade una base).

- Inversión (las bases invierten su orden).
- Sustitución (se sustituye una base por otra).
Según el cambio que produce en la traducción:
- Mutación silenciosa → una base cambia, pero el aminoácido y la proteína siguen siendo
los mismos.
o Ejemplo: UAC por UAU (Tyr → Tyr).
- Mutación de sentido erróneo → se codifica un aminoácido diferente.
o Ejemplo: UAC por AAC (Tyr → Asn).
- Mutación sin sentido → un codón deja de traducirse como un aminoácido y se convierte
en codón de parada.
o Ejemplo: UAC → UAA (Tyr → STOP).
Mutaciones cromosómicas
Afectan al número de cromosomas o a su estructura.
NUMÉRICAS:
- Euploidías: afectan a todo el conjunto de cromosomas, añadiendo (poliploidía) o

quitando cromosomas. Por ejemplo, si en vez de ser 2n es 3n.
- Aneuploidías: afecta a un cromosoma. Por ejemplo, Síndrome de Down (trisomía del par
21, tiene 47 cromosomas en vez de 46) o Síndrome de Turner (monosomía de
cromosomas sexuales, tiene uno X y ninguno más: X0).
ESTRUCTURALES:
- Deleción: se pierde un fragmento del cromosoma.

- Duplicación: se gana un fragmento en el cromosoma.
- Inversión: se invierte un fragmento del cromosoma.
- Traslocación: se mueve un fragmento a otra parte.
15

POLIMORFISMOS
Definición: conjunto de posibles alelos para un mismo locus.
Alelo: cada forma diferente en la que se puede expresar un gen o caracter.
Locus: localización (en plural, loci).
Ejemplo:
Sistema ABO (caracter).
➔ Se trata de un polimorfismo porque tiene varias opciones disponibles (varios alelos en

un mismo locus).
A pesar de existir más de dos alelos diferentes, solo existirán 2 en dicho locus debido a que uno
proviene del padre y el otro de la madre.
TIPOS DE ALELOS Y COMBINACIONES (APLICACIÓN EN EL EJEMPLO):
Existen alelos dominantes y recesivos. En el caso del sistema ABO: IA, IB, i (en mayúscula
dominante y en minúscula recesivo).
IA > i → dominancia del A sobre el O.
IB > i → dominancia del B sobre el O.
IA = IB → codominancia (se expresa A y B a la vez).
Combinaciones posibles:
IA + IA → A.
IB + IB → B.
Genotipo
i + i → O. y
IA + i → A. fenotipo.
IB + i → B
IA + IB → AB.
Dentro del genotipo, puede haber dos tipos: homocigótico (los dos alelos son iguales) o
heterocigótico (los dos alelos son diferentes).
Respecto al fenotipo, se observa que existen cuatro tipos posibles: A, B, O y AB.
16

Polimorfismos de secuencia
Los alelos se diferencian por su secuencia de bases. Pueden ser genes codificantes o no
codificantes.
Ejemplo:
ACTAGGAAT
CCGAGGTTT } 3 alelos
GGGGGGGGG
Polimorfismos de longitud
Los alelos se diferencian por su longitud. Se encuentra una serie de bases que representa el gen
y, dependiendo del número de veces que se repita esa secuencia, se trata de un alelo u otro (es
decir, se distribuyen en tándem). Todos son genes NO codificantes.
Ejemplo:

CGTTCGTT (2)
CGTTCGTTCGTT (3)
} 4 alelos
CGTTCGTTCGTTCGTT (4)
CGTTCGTTCGTTCGTTCGTT (5)
HUELLA GENÉTICA O PERFIL GENÉTICO:
Los polimorfismos de longitud no son codificantes, es decir, no se expresan, pero son útiles para
la identificación de una persona (como cuando se le identifica por la huella dactilar).
Los “marcadores genéticos” identifican a una persona sin lugar a dudas.
17
Tema 2: Extracción y purificación de
ácidos nucleicos
FASES
Purificación y
Pretratamiento Extracción
resuspensión
• Se obtiene una • Para obtener el ADN, • Se purifica la muestra
suspensión de las hay que romper las (se aísla el ADN).
células de interés. membranas. • Se resuspende con un
• Se encuentran en un • Se obtiene un "lisado tampón.
líquido llamado celular".
"tampón".
PRETRATAMIENTO
Sangre
Se obtiene una muestra de sangre con EDTA (conservante para poder extraer glóbulos blancos).

Los glóbulos blancos son las únicas células de la sangre con ADN, por lo que hay que eliminar el
resto. Hay dos formas: lisis de hematíes o centrifugación en gradiente de densidad.
LISIS DE HEMATÍES:
Se introduce la sangre en una “solución hipoosmótica” para destruir los hematíes.
Se centrifuga para obtener un pellet de glóbulos blancos y se elimina el sobrenadante.
La solución hipoosmótica es una

Los glóbulos blancos se
disolución salina en la cual hay poca
extraen y se introducen
concentración de sales, por lo que el
en un tampón llamado
líquido entra en los hematíes y los
TE (Tris-EDTA).
hace explotar.
CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE DENSIDAD:
Se utiliza un tubo de centrífuga en el que se pone un medio de separación en el fondo (“ficoll”)

que hace que, al centrifugar la muestra, lo atraviesen todas las células excepto las
mononucleadas (linfocitos y monocitos).
Tras ello, se aspira el plasma y se cogen las células mononucleadas. Finalmente, se introducen
en un tampón.
18

Cultivos celulares
Definición: mantenimiento de células de organismos pluricelulares in vitro.
Dos tipos: en suspensión o en monocapa.
EN SUSPENSIÓN:
Se extrae todo el bote, se centrifuga para separar las células y se desecha el sobrenadante
(medio de cultivo). Las células se resuspenden en tampón TE.
EN MONOCAPA:
Existen dos formas.
En la primera, se elimina el medio de cultivo, se rasca y añade tripsina (para disgregar las células).
Se resuspende en tampón TE.

En la segunda, se rascan las células y se añade tripsina. Se centrifuga y se elimina el sobrenadante
(tripsina y medio de cultivo). Se resuspenden en tampón TE.
Tejidos en fresco
Definición: tejido sin tratar.
El tejido debe disgregarse mediante un proceso de homogeneización. Dos formas: mecánica o

química.
- Mecánica:
o Manual: con un mortero (previa congelación).
o Automatizada: con centrifugación y un abrasivo (como bolas metálicas).
- Química: con proteasas (tripsina) para degradar el tejido.
Normalmente se combinan ambas para mayor eficiencia.
Una vez obtenida la pasta, se quitan las esferas, se centrifuga para eliminar el sobrenadante y
se suspenden las células en un tampón.
19

Tejidos fijados en formol e incluidos en parafina
Tres pasos: desparafinado, rehidratación y homogeneización y resuspensión.
DESPARAFINADO:
Se cortan unos trozos en el microtomo y se introducen en un tubo Eppendorf junto con xilol.
Se centrifuga para que el xilol pueda mezclarse con la parafina y eliminarla del interior del tejido.
Se elimina el sobrenadante, se vuelve a echar xilol y se repite el proceso varias veces
dependiendo del protocolo.
Tras esto, solo quedará xilol.
REHIDRATACIÓN:
Para eliminar el xilol, no puede mezclarse con agua porque no es soluble.
Se mezcla con etanol 100% (ABS) y se centrifuga, añadiendo de nuevo etanol ABS y repitiendo
varias veces dependiendo del protocolo.
Tras esto, solo quedará etanol ABS.
Para rehidratar, se introduce progresivamente el tejido en diluciones de etanol en gradación

decreciente hasta tenerlo totalmente hidratado.

HOMOGENEIZACIÓN Y RESUSPENSIÓN:
Se centrifuga para eliminar el agua sobrante. Luego, se terminan de disgregar las células
(métodos mecánico y químico) y se vuelve a centrifugar para eliminar el sobrenadante.
Las células se resuspenden e introducen en tampón TE.
Otras muestras (cultivos de bacterias y levaduras)

Dos tipos: en medio líquido o en medio sólido (colonias).
MEDIO LÍQUIDO:
Se centrifuga, se elimina el sobrenadante y se añade el tampón TE.
MEDIO SÓLIDO (COLONIAS):
Se recogen con el asa de siembra y se resuspenden en tampón TE.
20

EXTRACCIÓN
Para poder extraer el ADN del interior, primero hay que romper las paredes y membranas de la
célula para poder exponerlo.
Ruptura de paredes celulares

Algunas células contienen paredes que las recubren. Para eliminarlas se realiza un tratamiento
enzimático.
- Lisozima o lisostafin: para bacterias Gram positivas.

- Liticasa o zimolasa: para células vegetales, levaduras y hongos.
Desintegración de membranas celulares

Las membranas plasmáticas y nucleares son bicapas lipídicas → se utilizan detergentes.
Dos tipos:
- Solución de lisis SDS.

- Solución de lisis CTAB.
Inactivación de nucleasas
Al romper las membranas, el ADN se ve expuesto a las nucleasas del citoplasma y estas lo
pueden degradar por completo. Para ello, hay que hacer que las nucleasas no ataquen al ADN.
EDTA (ÁCIDO ETILENDIAMINOACÉTICO):
Es un quelante (compuesto que retira iones) de calcio (Ca2+) y magnesio (Mg2+). Como las
nucleasas necesitan iones de magnesio para funcionar, el EDTA, al retirarlo, las mantiene en
estado inactivo.
PROTEASAS:
Son enzimas que degradan proteínas.
Se utiliza la proteinasa-K para degradar las nucleasas.
AGENTES CAOTRÓPICOS:
Son sales que se combinan con el agua y, por tanto, la retiran del medio.
Las enzimas necesitan agua para estar en disolución y poder actuar.
Los agentes caotrópicos retiran el agua del medio y evitan que las nucleasas funcionen.
Extracción final
Una vez se han realizado los tres pasos anteriores (aunque se realizan a la vez), se obtiene un
lisado celular, es decir, que los ácidos nucleicos están suspendidos junto a estructuras celulares.
21
PURIFICACIÓN
Para poder obtener los ácidos nucleicos, se necesitan aislar del resto de compuestos resultantes
del lisado celular.
Hay que tener en cuenta que las proteínas precipitan con sales y con etanol 70%, y que los ácidos
nucleicos precipitan con isopropanol y con etanol ABS.
Existen diferentes técnicas.
Purificación con solventes orgánicos
Se basa en la distinta solubilidad de los compuestos del lisado en solventes orgánicos.
Cuatro partes:
1. Eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos: se utilizan solventes

orgánicos (fenol, cloroformo e isoamílico) para mezclar diversos componentes con ello.
Se obtiene una fase acuosa que contiene el ADN/ARN y otros componentes.
2. Precipitación del ADN: se utiliza acetato sódico 3M para precipitar proteínas y luego
etanol ABS para precipitar el ADN/ARN.
3. Lavado del ADN: se utiliza etanol 70% para precipitar las proteínas que queden y
eliminarlas. Se añade etanol ABS para precipitar el ADN/ARN.
4. Resuspensión del ADN: se recoge el ADN/ARN y se resuspende en un tampón TE.
Precipitación por salting-out

Definición: precipitación de proteínas en presencia de una disolución salina de elevada
concentración.
Tres partes:
- Precipitación de proteínas: con NaCl 6M y acetato de amonio 10M.

- Precipitación de ADN: igual que con solventes orgánicos.
- Lavado y resuspensión del ADN: igual que con solventes orgánicos.
Es el mismo proceso que el anterior, lo único que cambia es que, en vez de usarse disolventes
orgánicos, se utilizan sales.
22

Cromatografía de intercambio iónico
Definición: unión de iones en solución a grupos cargados de una fase estacionaria.
Permite separar elementos según su carga. Si se quiere separar algo con carga positiva, el
compuesto que forma la fase estacionaria será negativa, y viceversa.
Los ácidos nucleicos tienen carga negativa, por lo que la fase estacionaria será de carga positiva.
Utilizando un microspín, se introduce el lisado celular en la fase estacionaria, se centrifuga y se

retiran los componentes con carga positiva. Después, se añaden tampones salinos en
concentración creciente para ir separando los diferentes compuestos (que irán saliendo por
tamaño). Los ácidos nucleicos, al ser los de mayor tamaño, saldrán en el último.
Por último, se utiliza etanol ABS para precipitar los AN y se resuspenden en tampón TE.

Cromatografía de adsorción
Definición: unión de ácidos nucleicos al vidrio y a la sílice en presencia de sales caotrópicas.
En este caso, en la fase estacionaria se coloca sílice, se introduce el lisado celular y se añaden
sales caotrópicas. Los AN quedarán adheridos a la sílice, y tras centrifugar, se eliminarán todos
los demás componentes.
Después, se echa agua para separarlos del sílice, se lavan y se resuspenden en tampón TE.
23

Purificación mediante esferas magnéticas
Definición: unión de ácidos nucleicos a microesferas magnéticas que pueden ser retenidas
mediante un imán.
Las esferas magnéticas tienen sílice en su superficie, por lo que se combina con la técnica de
cromatografía de adsorción.
Se introduce el lisado con sales caotrópicas en el microtitle. Los AN se adhieren a las esferas,
que son retenidas mediante el campo magnético, y se desecha el resto. Se disuelven en agua
para separarlos y se resuspenden en tampón TE.
OTRO USO DE LAS ESFERAS MAGNÉTICAS:
Se pueden utilizar para purificar ARNm. Al tener este una cadena poli-A al final, se pueden
colocar cadenas poli-T complementarias en las esferas. De esta manera, el ARNm hibrida y se
queda adherido a las esferas. El resto se elimina y, para separarlo, simplemente se desnaturaliza.
24

Purificación de plásmidos por lisis alcalina
Este método se utiliza para poder obtener los plásmidos de las bacterias (minúsculas cadenas
bicatenarias de ADN no genómico). Se puede realizar tanto la extracción como la purificación en
este método.
Para romper la célula, se utiliza una solución de lisis SDS. Se añade NaOH para aumentar el pH y
desnaturalizar tanto el ADN genómico como los plásmidos. Después, se disminuye el pH de
forma muy brusca, lo cual hace que el ADN genómico no se renaturalice correctamente (lo cual
lo hace insoluble), pero los plásmidos, al ser muy pequeños, sí se renaturalizan bien.
Al ser insoluble el ADN genómico, precipita y puede eliminarse. Se recogen los plásmidos y se
precipitan con etanol ABS. Finalmente, se resuspenden en tampón TE.

EXTRACCIÓN DE ARN
El ARN es más inestable que el ADN y es muy sensible a las ARNasas, las cuales son enzimas muy
resistentes que se encuentran en cualquier superficie y material, por lo que hay que tomar
precauciones previas a la extracción.
CALIDAD DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS PURIFICADOS

Se determina por tres parámetros: integridad, pureza y concentración.
Integridad
Definición: parámetro que determina si un ácido nucleico conserva su tamaño original o si se ha
fragmentado o degradado durante la purificación.
El método utilizado es la electroforesis en gel de agarosa (aunque también funciona con

poliacrilamida).
La agarosa polimeriza al ebullirla, y al enfriarse adquiere consistencia gelatinosa, dependiendo

de su concentración.
Una mayor concentración permite separar moléculas más pequeñas debido a una menor
porosidad, por la cual solo podrán pasar los ácidos nucleicos de menor tamaño.
Los ácidos nucleicos avanzan a través de los poros, tanto como su tamaño les permita (↑
tamaño = ↓ distancia recorrida). Se debe usar un marcador de tamaños para medir.
En muestras de tejido FFPE siempre habrá fragmentación por los procesos llevados a cabo.
25
Tiene que salir una única
banda del tamaño deseado.
Si salen de tamaños no
deseados, el ADN no está
íntegro.
Cuando hay una estela de fragmentos degradados se denomina “smear”.
En el ARNm es normal que haya smear, ya que son muchos fragmentos de diferentes tamaños
de forma natural.
Para poder ver los fragmentos, se añade bromuro de etidio a las muestras, a las cuales luego se
les hace incidir luz ultravioleta con el espectrofotómetro para hacerlos fluorescentes.
Si en un pocillo no aparece ninguna banda, quiere decir que no se ha introducido ningún ácido

nucleico.
Si el ADN se ha fragmentado pero hay parte íntegro, se puede recortar la banda íntegra y
purificarlo.
Pureza
Definición: ausencia de posibles contaminantes.
Para ello se realizan mediciones de la absorbancia con diferentes longitudes de onda.
A 260 nm de longitud de onda se consigue la absorbancia máxima en los ácidos nucleicos.
Se utiliza la Ley de Lambert-Beer: 𝐴 = 𝜀 × 𝐶 × 𝑙 A = absorbancia.

ε = coeficiente de extinción.
Esta ley tiene un límite, ya que a partir de cierta C = concentración.
L = grosor de la disolución.
concentración no funciona. Por ello, se debe diluir la
muestra.
Mediciones de absorbancia:
- 260 nm = ácidos nucleicos.

- 280 nm = proteínas y/o fenoles.
- 230 nm = glúcidos y/o sales.
- 320 nm = turbidez de la solución.
26

Los ácidos nucleicos tienen mayor absorbancia si son de cadena simple (ARN) que si son de doble
hélice (ADN). Esto significa que el ADN podría quedar enmascarado si hay mucho ARN.
Fórmulas para calcular la cantidad de contaminantes:
𝐴260 − 𝐴320
𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 𝑦 𝑓𝑒𝑛𝑜𝑙𝑒𝑠 →
𝐴280
𝐴260 − 𝐴320
𝐺𝑙ú𝑐𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑦 𝑠𝑎𝑙𝑒𝑠 →
𝐴230

Al ser el denominador la absorbancia de cada contaminante, el número resultante será MENOR
cuanto MAYOR sea el contaminante.
GRADOS DE PUREZA ADECUADOS:
Si se purifica ADN:
- Proteínas y/o fenoles → aceptable en 1,6-2,1.

o <1,6 → alta concentración de PyF → purificar.
o >2,1 → alta concentración de ARN → purificar.
- Glúcidos y/o sales → aceptable en 1,5-2,2.
o <1,5 → alta concentración de GyS → purificar.
o >2,2 → alta concentración de ARN → purificar.
Si se purifica ARN:
- Proteínas y/o fenoles → aceptable en 1,8-2,1.

o <1,8 → alta concentración de PyF → purificar.
o >2,1 → nada (no ocurre).
- Glúcidos y/o sales → aceptable en 1,5-2,2.
o <1,5 → alta concentración de GyS → purificar.
o >2,2 → nada (no ocurre).
Si la contaminación es por proteínas, deben eliminarse, por ejemplo, con proteinasa K; por
fenoles, con cloroformo, alcohol isoamílico y etanol; y con ARN, con ARNasas.
27

Concentración
Para calcular la concentración, se utiliza la siguiente fórmula:
[𝑨. 𝑵. ] = (𝑨𝟐𝟔𝟎 − 𝑨𝟑𝟐𝟎 ) × 𝑭𝒅 × 𝑭𝒄
El factor de dilución (Fd) es el que se aplica para diluir la muestra y poder aplicar la Ley de
Lambert-Beer.
El factor de conversión (Fc) es una constante que permite convertir las unidades ópticas de la
absorbancia en unidades de concentración.
- ADNds → Fc = 50 ng/μl O 50 μg/ml.
- ADNss → Fc = 33 ng/μl O 33 μg/ml.
- ARN → Fc = 40 ng/μl O 40 μg/ml.
DILUCIÓN:
Se realiza con fracciones. El numerador es la concentración inicial (Ci) y el denominador es el

1
factor de dilución (Fd): 𝐹𝑑
➔ Ejemplo: si tenemos un Fd de 2, sería una parte de agua y una parte de Ci; y si tenemos
un Fd de 4, serían 3 partes de agua y una parte de Ci.

EJERCICIO DE EJEMPLO:
Tenemos 50 μl de ADN genómico humano, de los cuales se cogen 5 μl y se diluyen con 245 μl
de tampón. Se obtienen los siguientes resultados en la espectrofotometría:
A230 = 0,182
A260 = 0,352
A280 = 0,265
A320 = 0,025
Calcular la concentración y el peso de los ácidos nucleicos.
El factor de dilución se calcula sumando los 5 μl con los 245 μl, eso nos da el denominador, y
5 1
en el numerador se colocan los 5 μl que se han cogido: 250 = 50. Fd = 50.
[A. N. ] = (A260 − A320 ) × Fd × Fc
[ADN] = (0,352 – 0,025) · 50 · 50
[ADN] = 817,5 ng/μl
Para saber el peso total, se utiliza una regla de 3:
1 μl – 817,5 ng
50 μl – X
X = 817 · 50
ADN = 40.875 ng
28

Tema 3: PCR
INTRODUCCIÓN
Definición: técnica in vitro de amplificación de ADN.
PCR = Polymerase Chain Reaction (reacción en cadena de la polimerasa).
Permite obtener millones de copias iguales de una secuencia concreta de ADN, mediante un
proceso enzimático catalizado por la ADNpol en un termociclador.
Para poder realizar la amplificación, se necesita diseñar un par de primers o cebadores (de ADN)
que se unirán a secuencias específicas del ADN para poder copiar la secuencia deseada.
PCR ESTÁNDAR
Es la forma más básica. Se amplifica un único fragmento, usando solo un par de cebadores y en

un único proceso de amplificación.
Ciclo básico
1. DESNATURALIZACIÓN:
Se desnaturaliza el ADN aumentando la temperatura. La temperatura varía dependiendo del

número de guaninas y citosinas y de la longitud del ADN.
94-95°C.
2. HIBRIDACIÓN:
Los cebadores hibridan en las secuencias específicas. La temperatura depende de la Tm

(temperatura de fusión) de los cebadores, en base al número de guaninas y citosinas y de su
longitud.
50-65°C.
3. ELONGACIÓN:
La ADNpol se une al extremo 3’ del cebador para duplicar la hebra molde, ya que la lee en
sentido 3’→5’ y la sintetiza al contrario.
Se suele utilizar la Taq polimerasa (una ADNpol de una bacteria capaz de soportar altas
temperaturas). La temperatura para la Taq pol es 72°C, pero para otras ADNpol será diferente.
Tras las tres fases se completa un ciclo. A partir del tercer ciclo, se empezarán a obtener los
amplicones (los fragmentos de la secuencia específica que se desea ampliar). También se
obtendrán algunas “cadenas de longitud variable”.
29
Elementos para una PCR estándar
- ADNpol.
- Cebadores F y R.
- dNTPs.
- Tampón TK (Tris
KCl).
- MgCl2.
- ADN molde.
POLIMERASAS:
Se utilizan enzimas aisladas de bacterias termófilas: Thermus aquaticus, capaces de mantener
su actividad por encima de los 95°C → Taq polimerasa.
Temperatura óptima: 70-75°C.
PRIMERS/CEBADORES:
Se deben diseñar por parejas: cada uno es complementario de una secuencia adyacente a la
región de interés, pero en extremos y hebras opuestas.
- Cebador F (forward) → hebra molde 3’ → 5’.

- Cebador R (reverse) → hebra molde 5’ → 3’.
Definen el amplicón y su secuencia debe ser única para que solo se amplifique la región deseada.

Requisitos para el diseño de primers:
- Longitud: 18-30 bases.

➔ ↓ longitud = hibridación más fácil = hibrida en demasiados sitios, poco
específico.
➔ ↑ longitud = hibridación más difícil = podría no hibridar bien, muy específico.
▪ Si solo hibrida el extremo 3’: se considera como un primer pequeño,
poco específico y que puede hibridar en muchos sitios.
▪ Si solo hibrida el extremo 5’: la ADNpol no puede replicar la hebra al no
poder unirse al otro extremo.
- Composición:
o 40-60% de guaninas y citosinas.
o Equilibrio entre dominios ricos en A-T y G-C.
o Extremo 3’ con menos de 3 G-C seguidas (para que hibride bien).
- Secuencia: se debe evitar que haya regiones complementarias entre sí, ya que podrían
hibridar, tanto dentro del mismo primer (intramolecular) como entre ambos primers
(intermolecular).
- Temperatura de fusión (Tm): es la temperatura a la que hibrida un primer. Depende de
la longitud y de la composición. Como hay dos primers, cada uno tiene su Tm: tiene que
haber una diferencia máxima de 5°C entre la Tm de uno y la de otro.
dNTPs:
Son los nucleótidos. Se debe añadir la suficiente cantidad de cada nucleótido para que se puedan
realizar todos los ciclos de la PCR.
Si no hay suficientes, no se podrán realizar todas las copias.
30

TAMPÓN TK:
Es el tampón Tris + KCl.
Tiene que estar en una dilución adecuada. Normalmente se nombra por el factor de dilución
seguido de una “x”. Por ejemplo, una dilución 2x sería en ½.
CLORURO DE MAGNESIO (MgCl2):
El magnesio es cofactor de las ADNpol, por lo que es necesario que esté presente para que las
polimerasas se encuentren en forma activa.
ADN MOLDE:
Es el ADN que contiene la secuencia que se desea amplificar.
Preparación de las muestras

VOLUMEN DE REACCIÓN:
El volumen final tiene que ser siempre 50 μl. Si no llega, se debe enrasar con tampón TK o con
agua estéril grado PCR.
MEZCLA MÁSTER (MASTER MIX):
No se pueden mezclar amplificaciones distintas en el termociclador, ya que podrían

contaminarse y, al necesitar temperaturas diferentes, no funcionaría bien.
Para ello, se utiliza una mezcla máster, que consiste en una mezcla de todos los elementos
MENOS el ADN molde. Esta mezcla sirve para introducirla en todos los tubos (ya que pueden
caber de 50 a 100), y en cada tubo solo cambiaría la muestra de ADN molde que se introduzca.
De esta manera, si se produce un error, se puede saber con mayor facilidad dónde se encuentra
dicho fallo (error sistemático).
CONTROLES:
Se deben realizar controles de calidad para evitar errores.
- Control positivo: secuencia de interés que se desea amplificar (amplicón).

- Control negativo: agua o tampón (no debe amplificarse nada).
- Control positivo interno: es un control que permite no tener que repetir todo si algún
otro control sale mal. Se añade A CADA TUBO una secuencia de DIFERENTE tamaño para
comprobar que las amplificaciones se realizaron bien (también deberá tener sus primers
específicos).
31

Análisis de los productos de la PCR: electroforesis
Tras terminar la PCR se realiza una electroforesis, que permite ver si se ha amplificado la
secuencia deseada.
RESULTADO POSITIVO:
Una única banda del tamaño de la secuencia deseada.
Si hay varios fragmentos de varios tamaños: productos de amplificación no deseados.
Si da positivo en el control negativo: contaminación de la muestra, es posible que haya falsos
positivos.
RESULTADO NEGATIVO:
Ausencia de banda en la muestra.
Si da negativo en el control positivo: es posible que haya falsos negativos.
EJEMPLO:
Se desea amplificar una muestra de un gen vírico del HPV = 500 pb.
Control positivo = gen vírico (500 pb).

Control negativo = agua.
Control positivo interno = secuencia de 750 pb.
Marcador (100-1000 pb).
3 muestras.
Resultado:
- Controles válidos (el positivo dio positivo, el negativo dio negativo, y el positivo interno
dio positivo en los pb que debía dar).
- Paciente 1: positivo.
- Paciente 2: negativo.
- Paciente 3: positivo.
32

PCR ANIDADA
Es una PCR acoplada al resultado de otra PCR, es decir, que el producto de amplificación de la
primera será el molde para la segunda.
Se utiliza cuando hay muy poca cantidad de muestra o está en mal estado, y sirve para aumentar
la sensibilidad y la especificidad.
La primera PCR es una PCR estándar. En la segunda PCR se utilizan las secuencias deseadas y se
utilizan primers que, en este caso, hibridan DENTRO del amplicón (cebadores internos).
PCR MÚLTIPLE
Se amplifican varias secuencias simultáneamente en el mismo tubo.
Debe tener los pares de cebadores específicos para cada secuencia y con una Tm similar.
Un ejemplo de PCR múltiple es cuando se realiza el control positivo interno.

RT-PCR
Son PCR en las que se permite amplificar secuencias de ADNc, obtenidas a partir de ARN.
Se utiliza la retrotranscriptasa para pasar de ARNm a ADNc, y poder realizar la PCR. Se puede
realizar tanto aparte como en el propio proceso.
PCR A TIEMPO REAL

Una rayada.
Se pueden detectar los amplicones en cada ciclo, y para ello se necesita un termociclador a
tiempo real.
Hay dos tipos de sistemas: independientes de la secuencia y específicos de la secuencia.
Sistemas independientes de secuencia

Cuantifican TODO lo que se copia, tanto el amplicón como otras secuencias no deseadas.
Funciona añadiendo un compuesto que se intercala en el ADN y produce fluorescencia, o

mediante nucleótidos fluorescentes. Al poder realizarlo en cualquier secuencia, no es específico.
Sistemas específicos de secuencia

Cuantifican SOLO los amplicones.
Para ello se utilizan sondas (secuencias de ADN complementarias a una región específica de la
secuencia de interés).
Para entender el funcionamiento hay que entender la transferencia de energía entre

fluorocromos (FRET).
Fluorocromos: sustancias que, al hacerles incidir un haz de luz de una determinada longitud de
onda (dentro del espectro UV), se “excitan” y liberan la energía en forma de fluorescencia.
Cada fluorocromo tiene una diferente longitud de onda a la que se excita y emite una
fluorescencia diferente.
Si hay dos fluorocromos distintos, el espectro de emisión de uno puede ser el espectro de
absorción del otro, es decir, que al hacer incidir una longitud de onda sobre el primero, excitarlo
y hacer que emita energía, esa energía la transmite directamente al siguiente, por lo que solo el
33
segundo emitiría la fluorescencia. Para ello, además, tienen que estar a una distancia cercana;
si no, el primero no transmitirá la energía al segundo y emitiría su propia fluorescencia.
En la imagen se observa cómo el verde y el amarillo tienen solapamiento de espectros. Si ambos
fluorocromos están suficientemente juntos físicamente, al excitar al verde con su longitud de
onda determinada, pasará su energía al amarillo, lo excitará y hará que emita fluorescencia.
Al fluorocromo que se le aplica el haz de luz se le denomina notificador, y al que recibe la energía
de este se le denomina quencher.
SONDAS TAQMAN:
La sonda consiste en una secuencia de ADN con un notificador en el extremo 5’ y un quencher

en el 3’. Solo el notificador será capaz de emitir fluorescencia. SOLO PARA TAQPOL.
Una parte del medio de la sonda es complementaria a la secuencia de interés, e hibrida con ella,
de forma que los extremos que no se han unido se acercan y hacen que notificador y quencher
queden juntos. Al llegar la Taq pol, destruye la sonda y hace que N y Q queden separados.
En la fase de elongación se mide la fluorescencia, de forma que los notificadores de las sondas
destruidas emitirán fluorescencia.
También se les denomina “sondas de hidrólisis”.
La fluorescencia será proporcional al número de copias generadas.
34

BALIZAS MOLECULARES:
En este caso, la sonda tiene extremos complementarios intracatenarios, por lo que forma un
bucle consigo misma. En la fase de hibridación, la sonda hibrida con la secuencia
complementaria. El Q tampoco produce fluorescencia.
En la fase de hibridación se mide la fluorescencia, ya que N y Q quedan separados.
La Taq pol, en este caso, no degrada la sonda, sino que simplemente la separa y hace que vuelva
a su forma de bucle.
FRET:
En este caso, son dos sondas: una con el N en el extremo 3’ y otra con el Q en el extremo 5’

(única excepción). En este caso, el Q sí que produce fluorescencia.
Cuando las sondas hibridan, N y Q quedan cerca (hibridan en secuencias adyacentes), y como el
Q produce fluorescencia, al excitar el N, el Q emitirá su energía. En cambio, si están separados,
será solo el N el que la emitirá.
En la fase de hibridación se mide la fluorescencia, concretamente la del Q.
Resumen de sondas
F. N F. Q Medición
Taqman SÍ NO Elongación.
Se mide el N.
Balizas SÍ NO Hibridación.
Se mide el N.
FRET SÍ SÍ Hibridación.
Se mide el Q.
Siempre se excita al N.
35

Tema 4: Clonación de ácidos nucleicos
INTRODUCCIÓN
Definición: proceso de amplificación in vivo de secuencias de ADN genómico o ADNc basado en
tecnología de ADN recombinante.
PCR CLONACIÓN
In vitro In vivo
Termociclador. Dura horas. Manual. Dura días.
Cantidad limitada a los ciclos (25-40). Cantidad casi ilimitada.
Fragmentos de hasta 3,5 kb. Fragmentos de hasta millones de pb.
Se introduce el gen de interés (inserto) en un vector. El vector recombinante se introduce en

una célula viva hospedadora, se seleccionan y multiplican las que portan el ADN recombinante
y se recupera el fragmento amplificado.
SELECCIÓN DEL INSERTO

Se amplifica el inserto deseado con una PCR y se utilizan enzimas de restricción (endonucleasas
de restricción tipo II con extremos cohesivos).

VECTORES DE CLONACIÓN
Definición: moléculas de ADN que pueden replicarse de forma autónoma en una célula huésped
y que permiten la inserción de ADN extraño sin perder la capacidad de replicación.
Dentro del vector se introduce el inserto.
Elementos necesarios en un vector:
- Origen de replicación (ORI).

- Sitios de inserción (delimitados por las dianas).
- Marcador de selección.
- Marcador de identificación.
Plásmidos
Definición: moléculas circulares de ADN bicatenario extra cromosómico de origen bacteriano.
Los plásmidos como vectores tienen definido su tamaño (en este caso, 2686 pb), se muestran
sus dianas de restricción, se muestran los “sitios de clonación múltiple” (MCS) o “polylinker”
(lugares en los que en muy poco espacio hay muchas dianas de restricción), genes de resistencia
36

a antibióticos (en este ejemplo, el ApR es de ampicilina), el ORI (representado como ORI o como
“rep” en este caso) y otro gen de resistencia a antibióticos (o un operón Lac en este caso, aunque
hay otros tipos) en donde se encontrará el sitio de inserción.
Bacteriófagos/fagos
Definición: virus que infectan bacterias.
El fago λ tiene una secuencia de ADN lineal. En su genoma tiene unas secuencias llamadas
secuencias COS, que son necesarias para su empaquetamiento en la cápside vírica. Además, son
complementarias entre sí, por lo que, al entrar en la cápside, se unen y forman una molécula de
ADN circular.
El fago λ introduce su ADN de forma natural en la bacteria, y esta, al ver una secuencia de ADN
circular, lo interpreta como si fuera un plásmido.
Aparte de los fagos hay otros tipos, como los adenovirus, que se utilizan en las células animales.

Cósmidos, fagémidos y cromosomas artificiales
CÓSMIDOS:
Vectores híbridos: parte del cromosoma de fago λ y parte de plásmido. Tiene secuencias COS, el
ORI del plásmido, un gen de resistencia a antibióticos y un polylinker.
Insertos: hasta 50 kb.
FAGÉMIDOS:
Vectores híbridos: plásmido con ORI de un fago M13, fd o F1. Son ORI monocatenarios: se
obtienen copias monocatenarias de secuencias bicatenarias.
CROMOSOMAS ARTIFICIALES:
Vectores de alta capacidad. Se hacen circulares, pero tienen telómeros.
- Cromosomas artificiales bacterianos (BAC): hasta 300 kb.

- Cromosomas artificiales de levaduras (YAC): más de 1 Mb.
CÉLULAS HOSPEDADORAS
Definición: células en las que se introduce el vector de clonación para su amplificación mediante
replicación.
Procariotas
Se clonan plásmidos, fagos, cósmidos, fagémidos y BAC.
Se usan cepas especiales que pueden carecer de algunas enzimas y suelen carecer de genes que
controlan la recombinación genética.
Eucariotas
- Levaduras: hongos unicelulares que hospedan plásmidos de levaduras y YAC.
- Vegetales y animales: principalmente para experimentos de clonación para organismos
transgénicos. Clonan plásmidos, virus vegetales (vegetales) y virus animales (animales).
37
FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN
1. Creación del vector recombinante
El vector recombinante es la molécula de ADN que se va a clonar y que contiene el inserto.
1.1. PREPARACIÓN DEL ADN:
Se trata con endonucleasas de restricción que generen extremos cohesivos.
Debe cortar tanto cerca (pero fuera) del gen que se desea insertar como en el sitio de inserción
del vector.
2.2. INSERCIÓN DEL ADN EN EL VECTOR DE CLONACIÓN:
Se mezclan el ADN y el vector, se deja que se unan por complementariedad y que una ADN ligasa
una los extremos.
2. Introducción del vector en la célula hospedadora (transformación)

TRANSFORMACIÓN BACTERIANA:
Células: bacterias competentes.
Se utiliza la capacidad de ciertas bacterias de captar el ADN que se encuentre en el medio.
No todas las bacterias pueden, solo las competentes (capaces de introducir ADN externo).

También pueden hacerse competentes de manera artificial (como con E. coli) mediante
temperatura y cloruro cálcico.
TRANSFECCIÓN:
Células: eucariotas.
Se introducen vectores recombinantes en células eucariotas no mediada por virus.
Se incluye el vector en liposomas, que entran en la célula por endocitosis y liberan el vector.
TRANSDUCCIÓN:
Células: todas (con el virus adecuado).
Se introducen vectores recombinantes por la acción de un virus.
Se empaqueta el vector en la cápside de un virus. Puede ser por fagos recombinantes o por
cósmidos empaquetados en fagos.
ELECTROPORACIÓN:
Células: todas.
Se realizan cortos pulsos eléctricos de alto voltaje que aumentan la permeabilidad de las
membranas y permiten la entrada de los vectores. Sirve para cualquier célula.
38

3. Selección e identificación de clones recombinantes
Cuando se intenta introducir el vector recombinante en la célula, no todas tendrán el
recombinante y no todas tendrán siquiera un vector.
− Células transformadas recombinantes.
− Células transformadas {
− Células transformadas no recombinantes.
− Células no transformadas.
Las transformadas tienen vector y las no transformadas no tienen vector.
Se utilizan marcadores: uno de selección (para diferenciar entre transformadas y no
transformadas) y otro de identificación (para diferenciar entre recombinantes y no
recombinantes). El marcador de selección siempre es un gen de resistencia a un antibiótico,
pero el de identificación cambia según el método empleado, y siempre se mete el inserto
dentro de él (ya que contiene un polylinker).

GENES DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS:
Se introduce en el vector un gen de resistencia a antibiótico en el marcador de selección (S) y

otro gen de resistencia a otro antibiótico en el marcador de identificación (I).
El inserto se introduce en medio del marcador de identificación, de forma que quedaría

inactivado al “partirse” en dos.
S → gen de resistencia a Amp.
I → gen de resistencia a Tet.
- Células no transformadas: sensible a Amp, sensible a Tet.

- Células transformadas no recombinantes: resistente a Amp, resistente a Tet.
- Células transformadas recombinantes: resistente a Amp, sensible a Tet.
39

ESTRATEGIA CROMOGÉNICA:
Se utiliza como marcador de identificación un operón Lac (conjunto de genes que permiten a la
bacteria procesar la galactosa como fuente de energía).
La galactosa utilizada está modificada (por ejemplo, “X-gal”), y hace que las bacterias que la
procesen se tiñan de color azul (Lac+), mientras que las que no la procesan se quedarán
blancas (Lac-).
I → Operón Lac.
- Células no transformadas: sensible a Amp, Lac-.

- Células transformadas no recombinantes: resistente a Amp, Lac+ (azul).
- Células transformadas recombinantes: resistente a Amp, Lac- (blanca).
40

PROTEÍNAS FLUORESCENTES:
Se utiliza como marcador de identificación un gen que codifica para una proteína fluorescente
(GFP: verde).
I → gen GFP.
- Células no transformadas: sensible a Amp, no F.

- Células transformadas no recombinantes: resistente a Amp, sí F.
- Células transformadas recombinantes: resistente a Amp, no F.

GENES LETALES:
El marcador de identificación es un gen que codifica para una proteína letal para la bacteria.
I → gen letal.
- Células no transformadas: sensible a Amp, sin gen letal.

- Células transformadas no recombinantes: resistente a Amp, gen letal ON.
- Células transformadas recombinantes: resistente a Amp, gen letal OFF.
41
Tema 5: Aplicaciones en genética
forense
INTRODUCCIÓN
La genética forense analiza la variabilidad genética humana para resolver problemas de
identificación.
Se basa en las repeticiones en tándem no codificantes del ADN, que se utilizan como
marcadores.
Las secuencias se localizan en sitios llamados satélites (telómeros y centrómeros):
- ADN satélite:
o Secuencias de 5-500 pb.
o Fragmentos de 100 kb a varias Mb.
- ADN minisatélite:
o Secuencias de 5-100 pb.
o Fragmentos de 100 pb a 200 kb.
o Son secuencias VNTR.

- ADN microsatélite:
o Secuencias de 1-5 pb en tándem.
o Fragmentos de 10-40 pb.
o Son secuencias STR.
Las secuencias STR son repeticiones en tándem cortas, y son polimorfismos de longitud que, en
humanos, tienen una gran variabilidad genética y son usados como marcadores genéticos.
ANÁLISIS DE STR MEDIANTE PCR

Se realiza una PCR múltiple para amplificar las secuencias STR, se hace una electroforesis y se
interpretan los resultados.
La diferencia en las secuencias de un marcador entre una persona y otra será el tamaño de los
alelos (es decir, el número de repeticiones de la secuencia). Cada persona tendrá dos alelos por
marcador, ya que se deriva uno de cada progenitor.
Pasos: extracción/purificación de ADN, PCR y electroforesis.
Electroferograma
La electroforesis utilizada se realiza en un capilar con gel de agarosa. La mezcla se mueve a través
del gel. A cada producto de amplificación se le marca con una señal fluorescente y una máquina
determina su tamaño (por la velocidad a la que pasa) y el marcador del que se trata. El resultado
es un electroferograma.
42

Análisis estadístico de los datos
Se debe calcular la probabilidad de que el ADN sea coincidente, por ejemplo, en una prueba de
paternidad o al cotejar una muestra de criminología.
Se considera positivo (es decir, que es el/la hijo/a o que el ADN se correlaciona) siempre que
coincidan todos los marcadores O que coincidan todos menos 1 (en este caso, se suele verificar
del todo con el análisis del ADNmt o con el haplotipo Y). Si hay 2 o más que no coinciden, se da
por negativo.
ANÁLISIS DE ADN MITOCONDRIAL
El ADNmt es una molécula circular que se encuentra dentro de las mitocondrias, y es más
resistente y estable que el ADN nuclear.
Las mitocondrias son heredadas únicamente de la madre, por lo que solo seguirán el linaje entre
hijas. Los hijos heredan también las mitocondrias de la madre, pero no las aportan a su

descendencia.
El ADNmt tiene regiones iguales, pero hay regiones, denominadas “regiones hipervariables”
(HV), que son polimorfismos de secuencia, y es lo que se cambia entre un linaje y otro.
Pasos: extracción/purificación de ADN y secuenciación.
ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS DEL CROMOSOMA Y

El cromosoma Y es un cromosoma acrocéntrico que prácticamente no sufre recombinación en
la meiosis, es decir, que gran parte de su genoma no se entrelaza con el del cromosoma X. La
zona que se mantiene fija se denomina “haplotipo”, ye en él se encuentran todos las STR.
Al estar las STR en una región no recombinante, se heredan siempre del padre y comparten su
totalidad (mismo haplotipo Y para linajes de hombres). A diferencia del ADNmt, este solo sigue
linajes masculinos y, al ser un cromosoma sexual, las hijas no lo tendrán.
Pasos: extracción/purificación de ADN, PCR y electroforesis.
43

Tema 6: Técnicas de hibridación
INTRODUCCIÓN
Definición: unión de dos moléculas monocatenarias de ácidos nucleicos (ADN o ARN) por
complementariedad, originando una molécula bicatenaria híbrida.
Las técnicas de hibridación permiten detectar secuencias concretas mediante el empleo de

sondas de ADN o ARN marcadas con isótopos radiactivos, fluorocromos, enzimas u otros.
HIBRIDACIÓN EN SOPORTE SÓLIDO
La secuencia diana o la sonda se inmovilizan sobre un soporte sólido.
Dot blot
Se transfieren los ácidos nucleicos a una membrana de nitrocelulosa o nailon.
Sobre la membrana se coloca la muestra y se adhieren los A.N. Permite el estudio simultáneo
de varias muestras.
Se pueden utilizar sondas radiactivas o sondas marcadas con haptenos.

PASOS:
1. Aplicación de la muestra a la membrana:

a. Humedecer la membrana de nailon: se sumerge en tampón o agua destilada y
se retira el exceso.
b. Ensamblar el sistema de vacío: se colocan todas las partes.
c. Aplicación de la muestra: desnaturalización con NaOH (en el caso de ADN) y
secar con estufa o luz UV.
2. Bloqueo/prehibridación: para evitar que la sonda también quede retenida, se hace un
bloqueo de uniones inespecíficas.
3. Hibridación: se incuba la solución con la sonda, a veces con movimiento.
4. Lavado: se hacen lavados de agitación para retirar moléculas no hibridadas.
5. Detección: se realiza un revelado (autorradiografía).
44

APLICACIONES:
Como técnica de rastreo o screening:
- Estudios de expresión genética.

- Detección de secuencias extrañas en muestras biológicas.
- Control de calidad de PCR.
- Control de calidad del marcaje de sondas.
- Determinación del sexo en especies sin diferencias fenotípicas.
ASO (Allele Specific Oligonucleotides) dot blot:
Para detector mutaciones asociadas a la enfermedad, siempre que el número de alelos sea
reducido. Permite identificar polimorfismos.
Se hace un dot blot del gen normal y otro del gen mutado, por ejemplo en la fibrosis quística,
que es la mutación de un gen recesivo.

Hibridación de colonias:
Para detectar bacterias con una secuencia genética concreta (vector recombinante). Es una
mezcla entre soporte sólido e in situ.
Se toma la impresión de las colonias de una placa con la membrana (transferencia de células).
Se añade la sonda y se hace que entre en las células e hibride.
Hibridación de placas virales:
Para detectar virus con la secuencia diana, útil para fagos recombinantes.
Southern blot
SOLO ADN. Permite identificar fragmentos de ADN separados por electroforesis y transferidos a
membrana.
45
PASOS:
1. Digestión enzimática: se fragmenta el ADN.

2. Electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida: se separan los fragmentos por tamaño.
3. Desnaturalización del ADN: se sumerge el gel en NaOH.
4. Transferencia a la membrana de nailon: colocando tampón y peso para que suba por
capilaridad.
5. Bloqueo de la membrana: para evitar la adherencia de las sondas.
6. Añadir la sonda e incubar.
7. Lavado.
8. Revelado: autorradiografía.
Northern blot

SOLO ARN. Permite identificar fragmentos de ARN separados por electroforesis y transferidos a
membrana.
Igual que el Southern Blot, pero con excepciones:
- No se necesita digestión previa → el ARN ya está fragmentado.

- Electroforesis en condiciones desnaturalizantes → no hay que desnaturalizar porque el
ARN es monocatenario, pero hay que añadir NaOH igualmente para evitar que hibride.
Microarrays
Son conjuntos de sondas de ADN fijados a una superficie sólida. Se pueden detectar
simultáneamente miles de secuencias distintas, cualitativa y cuantitativamente.
En el caso de ARN, se crea ADNc (monocatenario) con nucleótidos fluorescentes.
Se marca de fluorescencia verde el ADN de las células sanas y de rojo el ADN de las anormales.
Se echa sobre la placa, se incuba y luego se lava. Se mide la fluorescencia en dos fases: primero
la verde y luego la roja. El software coteja los datos y los superpone. A mayor cantidad, mayor
fluorescencia, y mayor intensidad de color.
RESULTADOS:
- NEGRO = no hibridó nada (gen OFF en ambas).

- VERDE = solo hibridan las sanas (sanas ON, anormales OFF).
- ROJO = solo hibridan las anormales (sanas OFF, anormales ON).
- AMARILLO = hibridan ambas (sanas ON, anormales ON).
- NARANJA = sobreexpresión: hibridan ambas, pero se expresa más en las anormales
(sanas ON, anormales ON++).
- AMARILLO-VERDOSO = infraexpresión: hibridan ambas, pero se expresa menos en las
anormales (sanas ON, anormales ON-).
46

HIBRIDACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO
Técnica de captura de híbrido
Se utiliza una placa de microtiter en la cual hay anticuerpos (Ac) fijados a sus paredes que son
específicos para los híbridos de ADN-ARN.
1. Se añade la muestra con las sondas (si la muestra es ADN, la sonda es ARN, y viceversa).
2. Hibridación → los híbridos son capturados por los Ac y quedan adheridos a las paredes.
3. Lavado → se elimina lo que no hibridó.
4. Adición de Ac marcados → se añaden unos segundos Ac marcados con enzimas cuyo
producto será quimioluminiscente.
5. Lavado → los Ac con enzimas no unidos a los híbridos se eliminan.
6. Revelado → se añade el sustrato de las enzimas. Las enzimas de los Ac que se unieron a

los híbridos generarán un producto quimioluminiscente. Se mide cuantitativamente en
un espectrofotómetro.
Técnica de ADN ramificado (ADNb)

Es una técnica para aumentar la señal de la hibridación: es más sensible (pocas cantidades se
detectan mejor).
Los oligonucleótidos de captura están unidos a la pared, y son complementarios a las sondas de
captura.
Las sondas de captura son complementarias a los o. de captura y al ácido nucleico (por zonas no
específicas).
Las sondas de extensión son complementarias a las zonas específicas para analizar y a los o.
preamplificadores.
Los oligonucleótidos preamplificadores son complementarios a las s. de extensión y a los o.

amplificadores.
Los oligonucleótidos amplificadores están marcados con enzimas cuyo producto es

quimioluminiscente.
47

1. Se añaden las sondas y los oligonucleótidos.
2. Se incuba para que hibriden.
3. Lavado → lo que no se haya unido se elimina.
4. Revelado → se añade el sustrato para que las enzimas produzcan la
quimioluminiscencia y se registra en un espectrofotómetro.
HIBRIDACIÓN IN SITU (ISH)
La secuencia diana se localiza en el sitio donde se encuentra fisiológicamente. Puede ser en
células en metafase o en interfase.
No requiere extracción y purificación previas.
Hibridación in situ con fluorescencia (FISH)

Se utilizan sondas marcadas con fluorocromos.
Puede ser metafásica (células en división), interfásica (se ven los núcleos) o sobre tejido
congelado (no se puede hacer con FFPE ni en formol porque producen fluorescencia natural).
Útil para detectar alteraciones cromosómicas numéricas y estructurales.
PROTOCOLO:
1) Hibridación: se añade la sonda, se desnaturaliza el ADN con calor y se incuba.

2) Lavado: para eliminar sondas sin hibridar.
3) Contratinción: se tiñe el resto del ADN para que se sepa a qué célula o cromosoma
corresponde cada sonda. Se realiza con DAPI: marca todo el ADN con fluorescencia azul.
4) Observación: en el microscopio de fluorescencia.
48

Dos tipos de sondas:
- Sondas CEP: centroméricas, específicas de cada cromosoma. Para anomalías numéricas.
- Sondas LSI: específicas de locus, regiones concretas de un cromosoma. Para anomalías
numéricas y estructurales.
Ambas pueden verse tanto en una FISH interfásica como en una metafásica.
SONDAS DE SEPARACIÓN:
Sirven para detectar traslocaciones no recíprocas (parte del cromosoma se cambia de sitio o
pasa a otro).
Se utilizan dos sondas LSI (rojo y verde) que hibridan a ambos lados del punto de rotura del
cromosoma.
- Normal: se superponen. Color amarillo o verde y rojo superpuestos.

- Anomalía: sondas separadas.
SONDAS DE FUSIÓN:
Sirven para detectar traslocaciones recíprocas (parte de un cromosoma se intercambia con parte
de otro diferente).
Se utilizan dos sondas LSI (rojo y verde) que hibridan a ambos lados del punto de rotura del
cromosoma.
- Normal: cuatro puntos (dos verdes y dos rojos) separados.

- Anomalía: al menos un punto amarillo o verde y rojo superpuestos.
49
SONDAS TELOMÉRICAS:
Sondas LSI que se unen a los extremos de los cromosomas (los telómeros).
Sirven para detectar alteraciones numéricas y estructurales (con limitaciones).
PINTADO DE CROMOSOMAS:
Se utilizan sondas LSI que marcan cromosomas enteros.
Sirven para detectar alteraciones numéricas. También estructurales (con limitaciones).

FISH MULTICOLOR (SONDAS BSP):
Es un tipo de pintado de cromosomas, pero con diferentes fluorocromos en cada sonda, de

forma que se marcan con diferente fluorescencia cada parte (se solapan algunas partes). Se
procesan con un software.
Sirven para detectar alteraciones estructurales.
Muestras en las que se utiliza cada técnica:
DOT BLOT: biopsia, suspensión.

SOUTHERN BLOT: biopsia, suspensión.
NORTHERN BLOT: biopsia, suspensión.
MICROARRAYS: biopsia, suspensión.
CAPTURA Y ADNb: biopsia, suspensión.
FISH: citología, suspensión, congelado.
CISH: citología, suspensión, congelado, FFPE.
50

CARIOTIPO ESPECTRAL:
Pintado de cromosomas de todos los cromosomas. Se obtiene el cariotipo. Se procesan con un

software.
Sirven para detectar alteraciones numéricas. También estructurales (con limitaciones).
Hibridación in situ cromogénica (CISH)
El híbrido se detecta por una reacción inmunohistoquímica mediada por una enzima.
Se realiza sobre todo en tejido FFPE para detectar secuencias de virus oncológicos y analizar la
expresión génica de oncogenes.

1. Desparafinado e hidratación: se elimina con xilol y se rehidrata.
2. Digestión enzimática: proteinasa K para degradar proteínas y pepsina para degradar
péptidos. Facilita la entrada de las sondas.
3. Prehibridación: bloqueo para las sondas.
4. Hibridación: incubación con la sonda + calor para desnaturalizar ADN.
5. Lavado: se retiran las sondas restantes.
6. Detección del híbrido: se añade el sustrato y se produce un producto con color que
precipita (no tiñe un líquido).
7. Contratinción: se tiñen los núcleos con hematoxilina de Mayer de color añil/violeta
claro.
8. Observación: al microscopio óptico.
→ EBV (en marrón las infectadas, en azul las sanas).
→ HPV (en marrón las infectadas, en azul las sanas).
51

Tema 7: Secuenciación de ácidos
nucleicos
INTRODUCCIÓN
Definición: proceso de determinación de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN
o ARN.
MÉTODO DE SANGER
Es un método enzimático de determinación de cadena.
1. Extracción/purificación de ADN + desnaturalización: se dividen las muestras en cuatro

alícuotas, cada una en un tubo. En cada tubo, se echa:
a. Hebra molde.
b. Primer: marcado con isótopo radiactivo 32p en extremo 5’.
c. ADNpol.
d. dNTPs: A, T, G, C.
e. ddNTPs: son nucleótidos especiales (didesoxinucleótidos), que cuando se unen
a una cadena, la ADNpol no puede continuar con la copia.
2. Reacciones incompletas de polimerización: al haber añadido en cada tubo un ddNTP

diferente, en cada uno terminará de copiarse cada fragmento en un determinado punto.
En los de adenina, se copiará hasta llegar a la primera adenina; en los demás, lo mismo.
3. Electroforesis en gel.
4. Autorradiografía: aparecerán bandas de diferentes tamaños. Cada banda, por orden,
representa una base de la cadena. La primera base aparece abajo del todo, ya que será
la última en añadirse (extremo 5’), por lo que se puede leer el orden 3’ a 5’ desde arriba
hacia abajo. Atención: la secuencia es de la complementaria al ADN molde.
ddTTP ddATP ddGTP ddCTP
5’ – C T G A C T T C G A – 3’
3’ – A C T G A A G C T – 5’
3’ – C T G A A G C T – 5’
3’ – T G A A G C T – 5’
3’ – G A A G C T – 5’
3’ – A A G C T – 5’
3’ – A G C T – 5’
3’ – G C T – 5’
3’ – C T – 5’
3’ – T – 5’
52

SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA (1ª GENERACIÓN)
Se basa en el método de Sanger. Utiliza cuatro fluorocromos como marcadores.
1. PCR de amplificación: para obtener más copias.

2. PCR de secuenciación: se añade en cada tubo un fluorocromo diferente que marca o los
primers o los ddNTPs de cada uno.
3. Electroforesis en capilar: análisis por software.

SECUENCIACIÓN MASIVA (2ª GENERACIÓN/NGS)
Secuenciación totalmente automatizada, con muchas muestras distintas a la vez.
1. Fragmentación: mediante nucleasas, frecuencias de sonido o nebulizador.

2. Marcaje: con adaptadores.
3. Soporte: Flowcell (clústeres) o microesferas.
4. Amplificación: PCRpuente (para Flowcell) o emPCR (emulsión; para microesferas).

5. Secuenciación:
a. Terminación reversible cíclica: se van uniendo los dNTPs con FC y, a medida que
se unen, el aparato los detecta.
b. Pirosecuenciación: se añade un dNTP concreto, se registran los datos y luego se
retiran. Se repite el proceso con diferentes dNTPs. Se registra por la generación
de bioluminiscencia.
53
SECUENCIACIÓN DE 3ª GENERACIÓN
Secuenciación Ion Torrent
Cuando un dNTP se incorpora a una hebra, libera un protón (H+), que produce una variación en
el pH. El Ion Torrent tiene un micro pH-metro que detecta dichas variaciones en cada clúster.
Se va detectando la secuencia generada mediante esos cambios.
Secuenciación por nanoporos
Secuenciación a tiempo real, sin PCR ni marcajes, basado en biosensores.
Se trata de una membrana llena de nanoporos. Por los nanoporos fluye una corriente iónica
continua, y un electrodo detecta cualquier molécula que provoque un cambio en la corriente
basal (cada nucleótido genera un cambio diferente). El ADN se divide en dos hebras y cada una
pasa individualmente por el poro, haciendo que se secuencie a tiempo real.
54

Tema 8: Citogenética
INTRODUCCIÓN
Los cromosomas se componen de dos brazos, uno largo y uno corto. La unión de ambas
cromátidas se denomina centrómero, y es el que divide los dos brazos.
Existen cuatro tipos de cromosomas en función de la ubicación de su centrómero: metacéntrico,
submetacéntrico, acrocéntrico y telocéntrico.

OBSERVACIÓN DE CROMOSOMAS
Cariotipo: conjunto de cromosomas de una especie, individuo o célula ordenados de acuerdo a
su tamaño y morfología.
El cariotipo sirve para diagnosticar enfermedades con base genética.
Tres tipos de cariotipo:
- De especie: es el que comparte toda la especie.

- Constitucional: es el que tiene un individuo. Se espera que sea igual al de especie.
- Celular: es el que tiene un conjunto determinado de células cultivadas. Si no hay
anomalías, sería igual que los otros. Sería diferente si son, por ejemplo, células
cancerosas (mosaicismo).
Para realizar el cariotipo, primero se obtiene una extensión de cromosomas. Gracias a la tinción,
se pueden diferenciar bandas claras y oscuras y saber de qué cromosoma se trata cada uno. Es
necesario que las células estén en metafase (mayor condensación).
55

Técnicas de tinción:
- Giemsa (rojo/magenta).
- Orceína (rojo/marrón).
Técnicas de bandeo:
- Bandas G: se tiñen con tripsina + Giemsa. La tripsina rompe algunas histonas y hace que
ciertas regiones se descondensen. Al usar Giemsa, se tiñen más unas zonas que otras y
surgen bandas oscuras (G+) y bandas claras (G-).
- Bandas R: patrón negativo (inverso) de las bandas G.

- Bandas Q: con fluorescencia (G+) o sin fluorescencia (G-).
- Bandas C: regiones ricas en heterocromatina (zonas más condensadas de la cromatina
que no son codificantes, normalmente en centrómeros).
- Bandas NOR (Región Organizadora Nuclear): marca oscuras las regiones nucleolares.
Idiograma: representación gráfica simplificada de cromosoma teñido con técnicas de bandeo.
En un idiograma se representa el centrómero, las regiones, las bandas, las subbandas y las
subsubbandas. El brazo corto se representa por “p”, y el brazo largo por “q”.
Cromosoma – brazo – región – banda – subbanda – subsubbanda
Locus 2q24 → Cromosoma 2, brazo largo, región 2, banda 4.

Locus 2q24.2 → Cromosoma 2, brazo largo, región 2, banda 4,
subbanda 2.
Locus 14q32.13 → Cromosoma 14, brazo largo, región 3, banda 2,
subbanda 1, subsubbanda 3.
Las regiones, bandas, subbandas y subsubbandas se numeran de forma que la primera estará
más cerca del centrómero y la última más cerca del telómero.
56

OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DEL CARIOTIPO
Se realiza generalmente a partir de sangre periférica.
1. Cultivo de linfocitos
Se obtiene un tubo de sangre con heparina. Se centrifuga en gradiente de densidad y se
obtienen los linfocitos.
Los linfocitos son células maduras que no se dividen, así que se rejuvenecen (desdiferenciación)
con fitohemaglutinina → linfoblastos.
Las células se dividen y deben detenerse en la metafase. Se utiliza colchicina, que afecta a la
formación de los microtúbulos (no se puede producir la anafase).
2. Obtención de extensiones en metafase

Se sacrifica el cultivo. Se realiza un choque hipotónico: se añade KCl 0,075M para que las células
se “inflen” y se extiendan los cromosomas.

Se fijan y lavan con líquido de Carnoy y se extiende la muestra en un porta por goteo (se deja
hacer una gota que se extiende por sí sola).
3. Bandeo de cromosomas
Se realiza un conteo en varios campos con el microscopio óptico para saber que hay suficiente
muestra.
Se tiñen con Giemsa y tripsina y se organizan los cromosomas para sacar el cariotipo.
4. Análisis de cromosomas
Se detectan las alteraciones cromosómicas numéricas y estructurales.
En un bandeo estándar, el límite de detección de las alteraciones estructurales es de 10 Mb. En

un bandeo de alta resolución, el límite se reduce a 5 Mb.
Se redacta la fórmula cromosómica.
57
CRITERIOS DE ORDENAMIENTO DEL CARIOTIPO HUMANO
Se basan en tres características:
1. Tamaño.
2. Posición del centrómero.
3. Constricciones secundarias (satélites).
GRUPO A:
Los más grandes. 1 y 3 metacéntricos,
2 submetacéntrico.
GRUPO B:
Grandes y submetacéntricos.
GRUPO C:
Medianos y submetacéntricos.
GRUPO D:
Grandes y acrocéntricos.
Constricción secundaria y satélite.

GRUPO E:
Pequeños y submetacéntricos.
GRUPO F: GRUPO G:
Pequeños y metacéntricos. Pequeños y acrocéntricos.
Constricción secundaria y satélite.
FÓRMULA CROMOSÓMICA
Definición: descripción detallada y abreviada del cariotipo de un individuo.
Cariotipo sin anomalías:
- 46, XX
- 46, XY
Anomalías numéricas: Anomalías estructurales: Mosaicismo:

45, X0 46, XY, del(2) (q21q23) mos 47, XYY [15]/46 XY [30]
47, XXY 46, XY, inv(4) (p22p28)
47, XX, +21 46, XX, ins(10;3) (q22;p13p23)
46, Y, t(X;17) (q23;q21)
Importante: en las inserciones (ins) se

coloca primero el cromosoma en el
que se inserta y luego el cromosoma
del que proviene (destino;origen).
58

Tema 9: Cultivos celulares (resumen)
INTRODUCCIÓN
Los cultivos celulares se realizan principalmente porque es necesario que las células estén en
división para poder observar los cromosomas: se detiene en la metafase por ser el punto de
mayor condensación.
Tipos:
- Primario: a partir de células de un tejido.
- Secundario: a partir de otro cultivo. Trasplante de las células a otro sitio (subcultivo).
CURVA DE CRECIMIENTO

Línea celular primaria: las células se dividen y se van pasando de un cultivo a otro, pero tienen
un tiempo finito (20-100 pases). Luego, mueren por apoptosis (estado de senescencia).
Línea celular continua: las células no entran en senescencia, el tiempo es ilimitado. Por ejemplo,
con las células tumorales.
TIPOS DE CULTIVO Y MEDIO

TIPOS:
- Monocapa: sobre una superficie plana.

- En suspensión: en un líquido.
COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO:
- Electrolitos/iones.
- Glucosa.
- Aminoácidos.
- Vitaminas.
- Hormonas y factores de crecimiento.
- Antibióticos y antifúngicos.
- Tampón.
- Otros elementos (ácidos grasos, etc.).
- Indicador de pH → el color cambia según el pH, relacionado con el metabolismo celular.
➔ 𝐶𝑂2 + 𝐻2 𝑂 ↔ 𝐻2 𝐶𝑂3 ↔ 𝐻𝐶𝑂3− + 𝐻 +
Se utilizan cámaras de Neubauer para contar las células y realizar una tinción vital (ver número
de células vivas) con azul triptán → las vivas serán blancas y las muertas serán azules.
La conservación se realiza por ultracongelación.
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Biología molecular y citogenética

1º Anatomía Patológica y Citodiagnóstico

ORGANIZACION PROFESIONAL ESPAÑOLA, OPESA

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Hay dos tipos: desoxirribosa y ribosa.

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Grupo fosfato (P)

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ESTRUCTURA Y COMPOSICIÓN DEL ARN

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El ARN es siempre monocatenario.

Todos tienen una estructura lineal, excepto el transferente:

El ARNm saca la información del ADN y la transforma en información del ARNm.

El ARNr sirve para formación estructural (ribosomas).

El ARNn se encuentra en el nucleolo.

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- Helicasas → abren la hebra de ADN para poder replicar ese fragmento.

En el ADN se encuentra un triplete de bases que indica el origen de la replicación: ORI.

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Este proceso ocurre en ambas cadenas a la vez y a lo largo de todo el ADN.

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Transcripción del ADN

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Todo este proceso se realiza DENTRO del núcleo.

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1. Transcripción a ARNm y maduración:

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Explicación del pH:

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Por ejemplo, el ácido H2SO4, al disolverse en el agua, se divide y se separan

En el ADN y el ARN, el grupo fosfato es el que hace que tengan carácter

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Conociendo este pico, se puede realizar un análisis en una máquina

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De forma artificial pueden separarse las hebras de una cadena bicatenaria

Es la unión de dos secuencias de ADN por complementariedad.

Un ejemplo de su uso es cuando se quiere localizar una mutación

Un ejemplo de hibridación natural es cuando el primer se une a la hebra

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También se les llama “tijeras moleculares”.

- Tipo I: cortes de hasta 1000 pb antes o después de la diana. Fragmentos diferentes.

- Extremos cohesivos: se corta en puntos distintos de las cadenas. Quedan regiones

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Según el tipo de cambio:

- Deleción (se elimina una base).

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Según el cambio que produce en la traducción:

- Euploidías: afectan a todo el conjunto de cromosomas, añadiendo (poliploidía) o

- Deleción: se pierde un fragmento del cromosoma.

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Alelo: cada forma diferente en la que se puede expresar un gen o caracter.

Locus: localización (en plural, loci).

Sistema ABO (caracter).

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