Universidad de los Andes

Facultad de Farmacia y Bioanálisis

Escuela de Bioanálisis
Cátedra de Fisiología
Asignatura Biología

Unidad 14
ADN RECOMBINANTE
LAS HERRAMIENTAS DEL OFICIO

Prof. María Gabriela Gutiérrez

 Es una Ciencia que trata de la Manipulación de los Genes
y de sus Productos.

TÉCNICAS BÁSICAS: del ADN recombinante.

Consisten en:
a) Tomar fragmentos de ADN de distintos organismos y
se unen 'in vitro' (proceso llamado ‘Recombinación
in vitro' ).
“El ADN que resulta se conoce como ADN
recombinante”.
b) El ADN recombinante se introduce en otras células,
en las cuales se logra la expresión de sus genes en
forma de proteínas.
c) Esas proteínas pueden tener valor por sí mismas si
es el caso, por ejemplo, de una Hormona con
aplicación Médica.
 TÉCNICA DE INGENIERÍA GENÉTICA DEL ADN RECOMBINANTE

 Obtención del ADN del organismo a estudiar (ADN genómico), aislado del
resto de las moléculas celulares. Característica viscosa. Cuando se realiza una
lisis celular en forma gradual, el contenido celular se dispersa en la solución de
incubación y el ADN puede ser "pescado" con una varilla de vidrio o bien
precipitado en presencia de alcohol.
 1) Obtención de Fragmentos específicos de ADN de tamaño tal que
pueden ser estudiados y manipulados.
Para ello se utilizan:
 Enzimas de restricción (se conocen más de 200- ADN genómico)
 Retrotranscriptasas (cADN)
 Oligonucleótidos Sintéticos

2) Clonación Génica para la obtención de gran cantidad de fragmentos

de ADN.
Se consigue por dos métodos:
 Clonación molecular.
 PCR (reacción en cadena de la polimerasa).

3) Determinación de la Secuencia de nucleótidos de

fragmentos de ADN.
 El ADN de cualquier organismo puede ser cortado en fragmentos
(fragmentos de restricción) lo suficientemente pequeños para ser
analizados y manipulados.
 Son endonucleasas que poseen muchas bacterias y que tienen la
propiedad de cortar el ADN extraño que penetra en la célula. Lo
cortan por sitios específicos llamados secuencias de
reconocimiento, formadas por cuatro u ocho pares de bases, que,
en la bacteria original, están protegidas para evitar que se destruya
su propio ADN.
 Estas enzimas ‘Tijeras Biológicas' cortan el ADN de forma que en
cada extremo queda un trozo de hebra monocatenaria formada por
las bases de la secuencia de reconocimiento.
 Estos extremos se llaman Adherentes o Cohesivos, ya que es por
ellos por donde se pueden unir a otros fragmentos de ADN cortados
por la misma enzima de restricción, al ser sus bases
complementarias.
 Los Fragmentos así obtenidos se pueden separar para su estudio.
 (Restrictasas - son endonucleasas).
Son enzimas que tienen la capacidad de escindir los
enlaces fosfodiester de la cadena polipeptídica de los
ácidos nucléicos, fueron aisladas de bacterias, la
característica fundamental es que escinden el ADN en
secuencias específicas de nucleótidos (Secuencias de
reconocimiento).

Nomenclatura:
 Tres letras tomadas de género y especie
 Una letra que indica el serotipo
 Número Romano
Ejemplo:
- Eco RI(GAATTC) - Hae III
-E. coli Cepa Ry13
- - Haemophilus aegyptius
ALGUNAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN DE TIPO II EMPLEADAS EN INGENIERÍA GENÉTICA
¿Cómo se defiende la Bacteria de sus
Enzimas de restricción?
 A través del proceso de Metilación .
 Que consiste en agregar un grupo CH3 a la secuencia de
nucleótido, esto lo hace a través de una enzima.

 Es cuando el ADN de cualquier organismo puede ser

cortado en fragmentos lo suficientemente pequeños para
ser analizados y manipulados, mediante las enzimas.
 RETROTRANSCRIPTASA INVERSA: cDNA
Transcriptasa inversa (cDNA)

 Es una enzima aislada de los Retrovirus

 Cataliza la síntesis de proteínas virales y sintetiza
moléculas de cadena doble de ADN, usando como molde
cualquier molécula de ARN obtenida de una célula.
 Produce fragmentos de DNA que contengan una porción
definida del genoma (ADN complementario o cDNA)
 OLIGONUCLEÓTIDOS SINTÉTICOS

 Son sintetizados químicamente por unión sucesiva de

nucleótidos (grupo fosfato de uno con el grupo OH de otro) en un
orden determinado siguiendo una secuencia establecida.
 CLONACIÓN MOLECULAR

Consiste en la Formación de Múltiples Copias de un determinado

Fragmento de ADN, mediante el poder replicativo de organismos
vivos (Bacterias).
Para ello es necesario:
 Unir el fragmento de ADN del que se quieren obtener copias,
obtenido por una restrictasa, a otro ADN, llamado Vector de
Clonación. Los vectores de clonación son pequeños elementos
genéticos, tales como: Plásmidos o Fagos.
 Introducir el ADN resultante (recombinante) en células
hospedadoras (por ejemplo, Bacterias) donde se replica formando
nuevas copias.
- Para realizar la unión del fragmento deseado al vector escogido,
éste también debe ser cortado por la misma restrictasa utilizada para
obtener el fragmento.
-De esta manera los segmentos cohesivos de uno y otro fragmento
están formados por bases complementarias y pueden unirse
(hibridación).
- La ADN-ligasa cataliza la unión de los extremos de los fragmentos.
 Se consigue así que el fragmento de ADN deseado se una al ADN del vector,
formando un ADN recombinante por la unión de ambos.
 Para unir el ADN recombinante en las células hospedadoras (bacterias) se
utilizan las Técnicas de Transformación, Transducción y Conjugación
bacterianas.
 En cualquier caso (úsese Plásmidos o Fagos), las copias del ADN
recombinante obtenidas en las células hospedadoras, se conocen como clones.

CLONACIÓN MOLECULAR
 Clonación de organismos: Plantas o animales completos
 Clonación de Células: aisladas o formando tejidos u órganos
 Clonación de moléculas: Genes o fragmentos de DNA

Clonación acelular: Clonación de moléculas sin intervención de células

(PCR).
Clonación celular: Es la amplificación de moléculas de ácido nucleíco,
mediante su introducción asistida por vectores, en células anfitrionas en
cultivo.
  Inserción de un gen en un
plásmido

 Enzima de restricción ha cortado el gen y el

plásmido, quedando unos bordes cohesivos o
pegajosos.

 La unión del ADN que contiene el gen que se

desea clonar con el vector de clonación, se
otras enzimas, realiza por medio de
denominadas ADN-ligasas, que unen ambos
trozos de ADN.

 El resultado es una molécula de ADN

recombinante, ya que contiene fragmentos de
ADN de distinta
 TÉCNICA DEL PCR
(Reacción en Cadena de la Polimerasa)
 Se replican pequeños fragmentos de ADN 'in vitro', a una velocidad mucho
mayor que mediante la clonación molecular.

Procedimiento
- Requiere conocer las secuencias de bases del fragmento de ADN que se
pretende replicar.
- Con estas secuencias se deben sintetizar pequeñas cadenas complementarias
de ADN (de unos 20 nucleótidos), que actuarán como Cebador o Primer para la
ADN-polimerasa.
Resumen de la Técnica
a) El fragmento de ADN a replicar se introduce en una disolución que contiene
ADN-pol.
b)Se añaden desoxirribonucleótidos en cantidad y las moléculas de cebador
sintetizadas.
c)Al calentar, se separan las hebras complementarias de los fragmentos de ADN.
d)Si se enfría, se unen los cebadores a las hebras simples de nucleótidos, lo cual
es reconocido por la ADN-pol que comienza a añadir nucleótidos formando la
hebra complementaria.
e)Calentando y enfriando alternativamente la solución, se pueden obtener
millones de copias de ADN en períodos de tiempo cortos.
TÉCNICA DEL PCR
Aplicaciones Prácticas de la
Ingeniería Genética
1- Producción de sustancias con efectos Terapéuticos
 Somatostanina (SS): segregada por el hipotálamo, inhibe
la síntesis de somatotropina (GH) u hormona del
crecimiento.
 Insulina: segregada por el páncreas, regula la
concentración de glucosa en sangre.
 Somatotropina (GH): segregada por la adenohipófisis
controla y regula el normal crecimiento (evitando enanismo).
 Interferones: son proteínas elaboradas por células
animales en respuesta a una infección vírica.
 Factor VIII antihemofílico (AHF): es una globulina que
estimula a las plaquetas (para la coagulación sanguínea).
 Renina: es una enzima que cuaja la leche, necesaria para la
elaboración de quesos.
 Celulasa: enzima hidrolítica de la celulosa, es utilizada en
algunos preparados digestivos.
 Vacunas recombinantes, como la de la hepatitis B.
2- El Diagnóstico de Enfermedades Hereditarias
 Se utilizan técnicas como la amniocentesis,
basadas en la extracción de células amnióticas del
feto.
 Se Diagnostica enfermedades como la hemofilia,
la anemia falciforme, la diastrofia muscular y otras,
que son debidas a mutaciones genéticas.

3- La Identificación de Genes Humanos Específicos

Se trata de localizar e identificar el gen
responsable de una enfermedad que se sabe que es
hereditaria. Aunque es un problema tan arduo como
el de 'encontrar una aguja en un pajar', se ha
logrado algún éxito como es el caso de la
identificación de la Fibrosis Quística (enfermedad,
sobre todo, pulmonar).
 4. Terapia Génica
 Reemplazar en las células un gen defectuoso,
causante de la enfermedad, por un gen normal.

 Realizar tal cambio en todas las células de una

persona es imposible, los ensayos se realizan
introduciendo genes sanos en células
seleccionadas.

Por ejemplo, si la enfermedad es debida al mal

funcionamiento de las células madre de la
sangre, en la médula ósea, es en esas células
donde se lleva a cabo la terapia.
 AGRICULTURA
Siempre se ha pretendido obtener plantas cultivables, cuyos
rendimientos sean óptimos.
 Se utilizan los conocimientos de la Genética, aunque muchas veces
de una forma inadvertida, y en este sentido deben entenderse los
procesos de selección génica realizados provocando cruces y
originando poliploidías, para luego seleccionar aquellas plantas de
buenos resultados y multiplicarlas asexualmente, formando clones con
ellas.
 La aplicación de técnicas de Ingeniería Genética están dando
resultados espectaculares en la obtención de Plantas Transgénicas, es
decir, plantas a las que se ha introducido ADN clonado (recombinante)
y que lo han incorporado a su genoma de forma estable.
Los principales caracteres conseguidos en las Plantas Transgénicas,
son:
a) Resistencia a herbicidas, a insectos y enfermedades microbianas.
b) Incremento del rendimiento fotosintético.
c) Mejora en la calidad de los productos agrícolas.
La aplicación de las técnicas de la Ingeniería
Genética persiguen los objetivos siguientes:

a) Favorecer la investigación biomédica para

estudiar la fisiología de los genes y la biología
del desarrollo.

b) Mejorar la productividad o la resistencia a las

enfermedades de animales útiles para los
hombres.

c)Producción de proteínas de valor

farmacológico.
 Es una ciencia que involucra varias disciplinas y ciencias (Biología,
Bioquímica, Genética, Virología, Agronomía, Ingeniería, Química,
Medicina y Veterinaria entre otras).

Es el uso de organismos vivos o de compuestos obtenidos de

organismos vivos para obtener productos de valor para el hombre.

 Ha sido utilizada por el hombre en actividades tales como la

preparación del pan y de bebidas alcohólicas o el mejoramiento de
cultivos y de animales domésticos.

 En la actualidad está compuesta por una variedad de técnicas

derivadas de la investigación en biología celular y molecular, las cuales
pueden ser utilizadas en cualquier industria que utilice
microorganismos o células vegetales y animales.

 Esta tecnología permite la transformación de la agricultura.

 Tiene importancia para otras industrias basadas en el carbono, como
energía, productos químicos y farmacéuticos y manejo de residuos o
desechos.

Tiene un enorme impacto potencial, porque la investigación en ciencias

biológicas está efectuando avances vertiginosos y los resultados no
solamente afectan una amplitud de sectores sino que también facilitan enlace
entre ellos.

Clasificación
- Biotecnología Animal

- Biotecnología Industrial

- Biotecnología Ambiental y Vegetal

- Biotecnología Humana
La combinación de técnicas de DNA
recombinante y biotecnología ha preparado
- Biotecnología Alimentaria el camino para cambiar la Industria Futura de
forma competitiva.
Luciferasa Luciérnagas

Luciferasa y ATP Bioluminiscencia

 INCONVENIENTES EN INGENERÍA GENÉTICA

 Proceder del mal uso de las técnicas, dados los riesgos e

implicaciones de diversa índole que pueden derivarse.
 A ello ha dado respuesta el Comité Internacional de Bioética de la
Unesco fijando unos objetivos que están centrados en evitar
aspectos del progreso que atenten contra la dignidad humana y en el
hecho de que las posibilidades científicas no generen peligrosidad
por falta de definiciones éticas.

En resumen, los criterios para evitar tales inconvenientes establecen

una serie de limitaciones por motivos ecológicos, sanitarios, sociales,
políticos, morales, etc.

 Salvaguardar la dignidad y los derechos del hombre.

 Imposibilitar la discriminación social e ideológica.
 Impedir desastres ecológicos.
 Evitar el desarrollo o aparición de enfermedades que pudieran ser
incontrolables.
Esquema de los alcances del uso de la tecnología del ADN recombinante.