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BIOQUIMICA - Apuntes MatHonor David Pozo

1º Bioquímica y Biología Molecular

Grado en Odontología

Facultad de Odontología
Universidad de Sevilla

Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su
totalidad.
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BLOQUE 1: BASE MOLECULAR DE LA GENETICA (PARTE 1)

Dogma central de la biologia: ADNARNProteinas

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

· Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces
fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen.

· Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias

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que se leen igual en ambas direcciones).

· Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un mecanismo de defensa, para
degradar material genético extraño que entre en la célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA,
lo cual sirve para distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio. Las enzimas de restricción no pueden cortar
DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.

· Aplicaciones de las enzimas de restricción:

1. Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago.

2. Fragmentar DNA genómico para separación de electroforesis y “Southern Blot”.

3. Generación de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en “Southern”y “Northern” blotting.

4. Generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creación de DNA
recombinante.

· Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas, su nombre está dado
según el género y la especie de la bacteria de donde se aisló por primera vez esta enzima. La primera letra
representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un
número al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa. Ej:

Eco RI  E = género Escherichia

co = especie coli

R = cepa RV 13

I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

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· Las enzimas de restricción al cortar el DNA pueden producir 2 tipos de cortes:

1. Cohesivos: corta el enlace fosfodiester y si se conservan los fragmentos a una Tª normal los fragmentos se
vuelven a unir por pdH.

GAATTC GGATCC AAGCTT

CTTAAG CCTAGG AACGAA

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2. Romos: corta el enlace fosfodiester pero no se unen los fragmentos

AATATT CCCGGG

TTATAA GGGCCC

Mella: hueco que queda entre extremos cuyas bases se han alineado mediante pdH pero estos extremos no han
sido aun unidos mediante enlace fosfodiester gracias a las ligasas.(T4 ligasas muy usadas).

Reaccion de ligacion: reaccion en la cual se mezclan dos especies de ADN dando lugar al ADN recombinante o
quiremico. Para ellos primero los fragmentos han de ser cortados con la misma enzima de restriccion. Estas
reacciones se pueden favorecer en el laboratorio (que se unan frangmentos de dos ADN diferentes y no los del
mismo).

Celula huesped: celula que replica el ADN humano. En ella se introduce un vector (plasmido).

No podemos subclonar un ADN muy largo en vectores con capacidad de carga limitada. Si el fragmento de
ADN que queremos subclonar (introducir en el plasmido) es muy largo, este debe ser cortado e introducido en
muchos plasmidos de manera que la genoteca (conjunto de clones en los que está contenido el genoma de un
organismo) seria muy grande. Si queremos aumentar el tamaño de ADN que introducimos utilizamos un vector
como un cromosoma artificial (YAC) con mayor carga y para introducir aun mas informacion eliminamos del
cromosoma lo no importante, dejando lo necesario para que pueda replicarse (telomeros, puntos de replicacion
y centromeros) de manera que tenemos mucho sitio para meter el ADN humano que nos interesa.

Producir el gen de la insulina, por ejemplo, de esta manera, tiene muchas ventajas ya que se obtendra mucha
insulina facilmente (tiempo corto de reproduccion de las bacterias) y evitamos reacciones inmunologicas y
enfermedades que podrian darse al obtener esta proteina de otro animal como puede ser el cerdo.
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Estas tecnicas tienen limitaciones:

- la proteina puede formar cuerpos de inclusion (estructuras subcelulares anormales formadas como resultado
de la infección viral) que las hace insolubles

- la proteina puede ser perjudicial para la bacteria y esta no se reproducira

- la proteina puede necesitar ser modificada para funcionar (como glisificacion)

Una solucion es provocar que la bacteria expulse la proteina y por centrifugacion del tanque donde se
encuentren se separan las proteinas y las bacterias y posteriormente se recogen las proteinas.

Hay veces que la expresion de un gen que se introduce en un organismo puede encenderse a voluntad

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metiendo una molecula en el animal (en la comida o bebida por ejemplo) que provoque la transcripcion del gen,
es decir, la molecula actua como promotor

DEFINICIONES:

Plásmido: moléculas de ADN extracromosomico generalmente circular que se replica y transmite independiente
del ADN cromosomico.

Vector: agente que transfiere informacion genetica de un organismo a otro.

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El primer plásmido usado en ingeniería genética fue llamado pBR322.

Los huéspedes son organismos modificados previamente en el laboratorio de manera que sería imposible para
ellos vivir fuera de las condiciones dadas en este.

Los vectores usados en ingeniería genética en general suelen tener una única diana para una enzima de
restricción para que el ADN solo sea cortado en un lugar y que este no se rompa en varios trozos. Las dianas
están concentradas entre 100 y 200 nucleótidos en un lugar llamado sitio de clonaje múltiple (MCS) diseñado
previamente en el laboratorio de manera que en 150 nucleótidos pueden haber dianas para diferentes enzimas
que vayamos a utilizar pero no tienen por qué estar contiguas.

Se puede optimizar que el tipo de evento deseado se cumpla y que no se recirculen los plásmidos ni que el ADN
humano se vuelva circular (cosa que puede pasar ya que todos estos fragmentos han sido cortados con enzimas
de restricción dando lugar a extremos cohesivos).

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Procedimiento para identificar qué clase de ligación ha tenido lugar:

Intentamos conseguir bacterias con ADN humano en donde esta tenía el gen de resistencia a la ampicilina de
manera que la bacteria queda siendo no resistente a esta pero si resistente a la tetraciclina. Este evento deseado
podemos identificarlo ya que una bacteria solo admite un plásmido.

1. Sembramos las bacterias en una placa de petri a una concentración tal que estas crezcan aisladas unas de
otras para poder identificarlas macroscópicamente individualmente

2. Al día siguiente macroscópicamente se ven las películas de bacterias (clones de la primera)

3. Con la misma orientación, en otras dos placas de petri una con ampicilina y la otra con tetraciclina
situamos las bacterias anteriores en el mismo lugar que ocupaban.

4. Identificamos que bacterias crecen en ambas placas (contienen los dos genes bacterianos), las que no
crecen en ninguna de las dos (solo tienen ADN humano) y las que crecen en la placa con tetraciclina solo
(contienen ADN humano y el gen bacteriano que le proporciona resistencia a la tetraciclina)

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