Análisis de Mesófilos y Coliformes en Alimentos

C. Vergara, L.D. Gutiérrez, M. Díaz, Y.D. Ruiz

Microbiología Industrial, Ingeniería Agroindustrial, Facultad de Ingeniería, Universidad de

Antioquia, Sede Tulenapa – Carepa Antioquia

(Mayo 30 de 2018)

RESUMEN

El recuento consiste en cuantificar la cantidad de bacterias aerobios vivas o de unidades

formadoras de colonias que se encuentran (gr o ml) en muestras de alimentos. El objetivo es
realizar un análisis microbiològico a un alimento donde se determinen coliformes totales y
fecales y verificar si el alimento analizado cumple con la norma sanitaria. La práctica de
análisis microbiológico en alimentos, inicia con la toma de la muestra de un alimento
posiblemente contaminado, se realizan las diferentes disoluciones en agua peptonada, luego
se siembra para cada disolución en profundidad en Agar Plate Count para el recuento de
mesófilos aerobios. Por otro lado la determinación de coliformes totales por NMP, se realiza
en tubos de caldo brilla con campana durham tres disoluciones; después de la incubación se
observa los tubos positivos y negativos, para comparar según las tablas de NMP. y para
determinar si son fecales se debe confirmar la prueba para los tubos positivos.

Palabras claves: Recuento, Mesófilos aerobios, Termófilos, caldo brilla con campana
durham, Tablas NMP, Normas Sanitarias, Agar Plate Count, Coliformes Totales y Fecales

INTRODUCCIÓN microorganismos indicadores de calidad

La aceptabilidad o no de un alimento está
definida por la calidad microbiológica que
este posee, lo cual depende del
cumplimiento de la normatividad sanitaria
vigente, de las condiciones y medidas que
se tengan durante la producción,
almacenamiento, distribución y los procesos de limpieza y desinfección.
preparación de los alimentos. Para emitir
este concepto de aceptabilidad en pro de
determinar si un alimento es seguro o no
para el consumo humano, es necesario
identificar la ausencia o presencia de
microorganismos patógenos tales como:
Listeria monocytogenes, Salmonella spp,
Escherichia coli , Vibrio cholerae, Bacillus
cereus, así como también es necesario
reconocer que la cantidad de
no superen los límites establecidos por
marco legal para cada tipo de alimento,
algunos de los microorganismos
indicadores más usados son:
Coliformes Totales: Indicadores de
condiciones de aseo deficientes, o fallas en
Coliformes Fecales: Indicadores de
contaminación fecal, por mal aseo,
incumplimiento de los procesos de
limpieza y desinfección o contaminación
cruzada.
Aerobios mesófilos: Indicadores de
contaminación ambiental.
Mohos y Levaduras: Indicadores de
contaminación ambiental.
Estos análisis microbiológicos tienen
diferentes propósitos, algunos de los más
comunes son: Liberar un lote de
producción; Validación de vida útil de un
alimento (Fecha de Vencimiento); Control
interno de calidad; Investigación de una
enfermedad transmitida por alimentos;
Comprobar la efectividad de un producto
antibacteriano; Validación de un Punto
Crítico de Control (PCC); Verificar si los
procesos de limpieza y desinfección se
realizaron correctamente.
(Calidadmicrobiologica.com.co, 2018)
Como objetivos de esta práctica están el
Realizar un análisis microbiológico a un
alimento donde se determinen coliformes
totales y fecales por NMP, mesófilos
aeróbios por siembra en profundidad;
Además verificar si el alimento analizado
cumple con la norma sanitaria que aplique
según el caso.
DETALLES EXPERIMENTALES
A. Toma de muestras de alimentos y sus
diluciones
Primero se elige una muestra de producto
procesado, o fresco. Se decide trabajar con
carne de res (Albóndiga) la cual es de
ventas comerciales ambulantes, donde se
sospechó presencia de microorganismos
aerobios patógenos, debido a la
manipulación del producto por personas
que no cumplen con las BPM. En el
laboratorio se pesaron 10 gr de muestra, y
se homogeneizó en una bolsa ziploc de
forma manual, con el objetivo es
disminuir el tamaño de la muestra. Luego
se inocula en 90 mL de agua peptonada
estéril, para realizar la dilución 10-1.
Después se tomó un 1 mL de la muestra
10-1 y se adicionaron a un tubo con 9 mL
de agua peptonada para hacer disolución
10-2. Seguidamente se hizo la disolución
10-3, tomando 1 mL de la muestra 10-2. En
ambos procesos se utilizaron la
micropipeta y puntas estériles.
B. Recuento de mesófilos aerobios por
siembra en profundidad
En este proceso, se marcaron tres cajas de
Petri con los datos del grupo y el número
de cada disolución. Luego se llevó cada
una de las cajas con el Agar Plate Count a
la plancha para fundirlo, se dio tiempo
para tibiar el agar sin dejar que el medio de
volviera sólido, cuando ya se encontró en
condiciones adecuadas, en presencia del
mechero, se adiciono un 1 ml de cada
disolución en cada una de las cajas de Petri
estériles, se realizan movimientos
circulares lentos para realizar una mezcla
homogeneizada, sin desbordar el agar de la
caja estando cerrada. Esto con el fin de
difundir correctamente la muestra en el
Agar. Se llevó a incubación a 37 °C
durante 24 horas.
Pasadas las 24 horas se realizó el conteo
de las UFC de las cajas. También se
determinó la concentración definitiva de
mesófilos aerobios presentes en la
muestra, luego se reportó el promedio,
para comprar con las normas de sanidad.
C. Determinación de coliformes totales
por NMP
Se marcaron nueve tubos de ensayo con
Caldo brilla con campana Durham y los
datos del grupo de trabajo, tres tubos por
cada dilución (10-1 10-2 10-3). Luego se
inoculó 1ml de cada dilución en el tubo
respectivo con una micropipeta. Se
llevaron a incubación 37°C durante 24
horas. Pasado el tiempo estipulado se Imagen 2. 10-2
observó y se determinó cuáles de los tubos
eran tubo es positivo (presenta coliformes
totales), se reportaron los datos en una
tabla donde se muestran los tubos + y -,
contando los tubos positivos de cada
dilución y se anotó en el registro.
Finalmente se compararon los resultados
experimentales con las tablas de NMP.

Continuando con el análisis, es decir, que

para determinar si son fecales, se debe
confirmar la prueba para los tubos que
dieron resultado positivo (uno para cada
disolución que haya arrojado positivo),
llamada la prueba confirmativa de
coliformes fecales: en esta prueba todos
los tubos que presentaron crecimiento, se Conteo UFC: 50
seleccionaron y se inocularon nuevamente
en un tubo con caldo brilla. Según la teoría Imagen 3. 10-3
si presenta gas y turbidez, indica que los
coliformes son fecales.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Siembra en Superficie para el conteo de

UFC

Imagen 1. 10-1

Conteo UFC: 10

Conteo UFC: 20
Recuento en Placa de Mesófilos Imagen 9. 10-3
Aerobios por Siembra en Profundidad

Tabla 1. Recuento Standar

RESULTADOS
Dilución Dilución Dilución 10-3
10-1 10-2

Recuento: 1 Recuento: 1 Recuento: 0

Determinación de Coliformes Totales

Prueba de Fluorescencia por Número Más Probable (NMP)

Imagen 7. 10-1 Imagen 10. 10-3, 10-2 y 10-1

(respectivamente)

Imagen 8. 10-2

El la primera dilución del caldo brilla,

permite observar que las tres muestras 10-2
y 10-1 arrojan positivo, caso contrario de
10-3
Prueba Confirmativa de Coliformes Imagen 13. 10-3
Fecales

Este sistema de recuento presenta un gran

margen de error, entonces para
minimizarlo se siembra un tubos por cada
una de las dilución y se calcula
nuevamente el número aproximado de
bacterias en la muestra original a partir de
unas tablas de probabilidad, por eso esta
técnica se conoce como cálculo del
número más probable (NMP).

Imagen 11. 10-1

Después de realizar la segunda prueba, el

resultado no varía se mantienen positivas
las dos primeras disoluciones más
concentradas, mientras que sigue arrojando
10-3 negativo para microorganismos
patógenos

Tabla 2. Determinación de coliformes

totales por NMP: Según NTC 4092

10-1 10-1 10-1 10-2 10-2 10-2 10-3 10-3 10-3

+ + + + + + - - -
Imagen 12. 10-2 3 3 0
Código
Positivos
200

NMP : 200

Norma Sanitaria -- NTC 1325 --

INDUSTRIAS ALIMENTARIAS.
PRODUCTOS CÁRNICOS
PROCESADOS NO ENLATADOS

Cárnicos Cocidos o Escaldados

Norma Aerobios Coliformes E. Mohos,
mesofilos Coli Levadura
s
NTC 20000 - 120 - 110 <3 -
1325 30000
 ● El establecimiento donde hacen la
preparación de la muestra utilizada
Cárnicos Crudos (albóndiga de carne) no se rigen
Norma Aerobios Coliforme E. Mohos, por las normas de buenas prácticas
mesofilos s Coli Levadura de manipulación de alimentos
s adecuadas, esto puede ser posible,
NTC - - 120- - porque el agua utilizada no es
1325 1100 potable, por no lavar los
condimentos para la preparación, el
lugar de trabajo no es adecuado o
Cárnicos Crudos - pollo no usan productos desinfectante
Norma Aerobios Coliforme E. Mohos, además, otros factores que hacen
mesofilos s Coli Levadura que el producto final no sea apto
s
par el consumo humano.
NTC - - 100- -
3644-2 1100 ● Se Aprendió a realizar pruebas con
método de recuento de número más
probable y qué aspectos nos
indican que hay presencia de
CONCLUSIONES
coliformes fecales y totales.
● Según la tabla #1 de la muestra de
● Se pudo determinar la
coliformes, el lugar en que se
contaminación del producto en lo
realiza la preparación de los
que se refiere a la norma, por lo
alimentos, no acatan los criterios
que se recomienda observar el
especificados de la Norma, pues los lugar y la procedencia de los
resultados de las tres unidades de alimentos consumidos vendidos de
muestra analizadas son mayores a forma ambulante.
los valores establecidos por la
norma sanitaria.

BIBLIOGRAFÍA
- Icontec. (2001). NTC 4939, Calidad del agua, Enumeración de coliformes y Escherichia
Coli. Técnica con tubos de fermentación y técnica de sustrato enzimático. Bogota D.C
- (2003). Norma sanitaria que establece los criterios microbiológicos de calidad sanitaria e
inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano.
- Calidadmicrobiologica.com.co. (2018). Análisis microbiológico de Alimentos. [online]
Available at: http://www.calidadmicrobiologica.com.co/analisis-microbiologico/analisis-
microbiologico-de-alimentos [Accessed 30 May 2018].