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Tecnologa en salud
Vol. 2, Nm. 2
Mayo-Agosto 2013
pp 70-78
Resumen
A tres dcadas de su aparicin, la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas
en ingls) es una de las herramientas tecnolgicas ms innovadoras para el estudio de los
cidos nucleicos. Se caracteriza por ser una tcnica de alta sensibilidad, reproducibilidad y
eficiencia, que genera resultados confiables en poco tiempo y fciles de analizar. Por ello,
se ha convertido en el mtodo de eleccin de muchos investigadores para los estudios genticos y de biologa molecular. En esta revisin nuestro objetivo es introducir al lector a los
fundamentos de la reaccin en cadena de la polimerasa, as como a la reaccin en cadena
de la polimerasa en tiempo real; dos tcnicas que parten de un principio similar, pero que
son metodolgicamente diferentes; la primera genera resultados cualitativos mientras la
segunda cuantitativos.
Abstract
After three decades of discovering utility of polymerase chain reaction, its methodology has become one of the most employed tools for the study of nucleic acids. This is a
top sensitive, highly reproductible, very efficient and short time consuming technology
that allows to obtain reliable and easy to evaluate results. Objectives of this paper deal
with fundamentals of both techniques standard polymerase chain reaction as well as the
polymerase chain reaction on real time. Results produced by standard polymerase chain
reaction are qualitative, while those produced by polymerase chain reaction on real time
are quantitative.
Introduccin
La gran complejidad de los procesos biolgicos en los
seres vivos ha sido por aos la razn por la que los
investigadores han centrado su atencin en descifrar
los mecanismos que se esconden detrs de esos procesos. Desde las primeras observaciones de Gregorio
Mendel hasta la actualidad, se tiene la nocin de que
parte de la explicacin de los diferentes fenmenos
biolgicos se encuentra escondida en lo ms recndito del genoma celular y que una de las claves para
entender dichos fenmenos es el estudio de los genes. Uno de los descubrimientos ms importantes de
la historia que marc el inicio de una nueva era en el
estudio y conocimiento de los cidos nucleicos fue el
de Watson y Crick, al descifrar la estructura del ADN1
(cido desoxirribonucleico). Desde entonces, varios
grupos han mostrado un gran inters por desarrollar
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70
Fundamentos
Qu es la PCR?
La reaccin en cadena de la polimerasa es una reaccin enzimtica in vitro que amplifica millones de veces
una secuencia especfica de ADN durante varios ciclos
repetidos en los que la secuencia blanco es copiada
fielmente. Para ello, la reaccin aprovecha la actividad
de la enzima ADN polimerasa que tiene la capacidad
de sintetizar naturalmente el ADN en las clulas. En
la reaccin, si usamos como sustrato ADN genmico,
entonces tpicamente hablamos de una PCR, pero si
usamos ADN complementario (ADNc) proveniente del
ARNm (cido ribonucleico mensajero) se le conoce
como RT-PCR (Reverse Transcription-PCR, por sus
siglas en ingls). Esta conversin se logra mediante
una reaccin conocida como transcripcin reversa y
controlada por la enzima transcriptasa reversa, capaz
de convertir el ARNm en una molcula de ADNc. Este
mtodo fue copiado de los retro virus que usan una
transcriptasa reversa para convertir su genoma de
ARN en ADN duplicarse en millones de partculas
virales.2 El ADNc se utiliza cuando analizamos la expresin del ARNm de algn gen de inters.
Los elementos importantes en la reaccin son el
templado o molde (ADN o ADNc), la enzima, los oligonucletidos o primers, los desoxirribonucletidos trifosfatados (dNTPs: adenina, timina, citosina y guanina),
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Azcar
Azcar
Azcar
Azcar
Azcar
Azcar
Azcar
Azcar
A
Base
nitrogenada
Figura 1.
Fosfato
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Fosfato
Fosfato
Investigacin en Discapacidad
5
Primers
Taq Polimerasa
ADN o ADNc
Desnaturalizacin
95 oC
Cadena
naciente
dNTPs
Mg+
Hibridacin
50-60 oC
5
o
5 Extensin 72 C
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Ciclos siguientes
Figura 2. Pasos de un ciclo de la PCR.
73
Marcador
conocido
Figura 3.
PB
500
400
300
200
100
Este
Es
te documento
doc
ocum
umen
ento eess el
eelaborado
lab
a or
o addo porr Medi
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Amplicn
Amplicn
Amplicn
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Investigacin en Discapacidad
3
ADN o ADNc
Primers
Cadena naciente
SYBR Green
5
Energa de excitacin
Energa
de emisin
SYBR Green
fluorescente
480
Hibridacin
3
ADN o ADNc
3
Primers
Cadena
naciente
5
R Q Sonda Taqman
Taq Polimerasa
Energa
de emisin
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520
Extensin
5 Hibridacin
3
R
Extensin
Figura 4. Mtodo no especfico. Cuando el SYBR Green
est unido al ADN de doble cadena, es excitado a una
longitud de onda de 480 nm, mientras que la longitud
de onda de emisin corresponde a 520 nm.
Volumen 2 Nmero 2 Mayo-Agosto 2013
Fluorescencia
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
Figura 6.
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www
w.meddigrapphic.org.mxx
5
76
10
15
20
Ciclos
25
30
35
Curva de amplificacin. En el
eje Y se muestra la cantidad
de fluorescencia y en el eje
X los ciclos de la reaccin.
La amplificacin se detecta
en cada ciclo de la reaccin,
midiendo el incremento de la
fluorescencia que es proporcional al aumento de ADN.
Investigacin en Discapacidad
Melting Peaks
1.384
1.284
1.184
1.084
0.984
0.884
0.784
0.684
0.584
0.484
0.384
0.284
0.184
0.084
-0.016
50
55
60
65
70
75
Temperatura (C)
80
85
90
95
Figura 7. Se puede observar un nico pico de amplificacin que corresponde a la curva de disociacin o curva melting que indica la especificidad de la reaccin, es decir, que los amplicones que se formaron son del tamao esperado. La lnea de abajo corresponde al control negativo, el cual no amplific.
gen blanco comparados con un gen de referencia
(gen housekeeping) que no cambia su expresin a
pesar de que los estados fisiolgicos se modifiquen
por diversas causas. Los datos son expresados
como relativos al gen de referencia y generalmente
son referidos como el nmero de veces en el que
aumentaron o decrementaron los niveles de ARNm
o en su caso, si no hubo cambios. Cualquiera que
sea el tipo de cuantificacin que se elija, casi todos
los software de los equipos estn posibilitados para
llevar a cabo los anlisis matemticos y estadsticos
que se requieren en cada tipo de cuantificacin.
Conclusiones
4.
Los retos que se presentan da a da en la investigacin biomdica nos abren la posibilidad de conocer
nuevas herramientas tecnolgicas para afrontarlos
experimentalmente. Es por eso que la PCR es una de
esas herramientas que se ha desarrollado para ofrecer
una alternativa para el estudio de los cidos nucleicos.
Tal fue su impacto en la comunidad cientfica que hoy
en da es una tcnica que se usa a diario en muchos
laboratorios y que se increment cuando apareci
la modalidad de PCR en tiempo real, permitiendo el
establecimiento y la aplicacin de nuevos protocolos
experimentales ms precisos que generan resultados
5.
Bibliografa
1.
2.
3.
www.medigraphic.org.mx
6.
7.
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Investigacin en Discapacidad