Mutagénesis por PCR

Notas
Este método utiliza una polimerasa de lectura de prueba para leer alrededor de un plásmido
y así incorporar el cebador como la nueva secuencia (mutante). Solo unos pocos (digamos
12) ciclos de PCR se realizan en una cantidad relativamente grande de plantilla plasmídica
para minimizar la posibilidad de expandir los errores de secuencia de PCR.

Diseñando los primers

Necesita dos cebadores, complementarios entre sí, que contengan la nueva secuencia
(mutante) flanqueada por 20 bases en cada lado. Por ejemplo, suponga que tiene la
siguiente secuencia en algún gen en algún plásmido:
CTA CTT CCA GAG ACA ACTO GAT CTC TAC TGT TAT GAG CAA TTA AAT
GAC AGC GGG

Y quieres cambiarlo a:
CTA CTT CCA GAG ACA ACTO GAT CTC TAC GGT TAT GAG CAA TTA AAT
GAC AGC GGG

Una cartilla será:

. . . . .5 '. . . CCA GAG ACA ACTA GAT CTC TAC GGT TAT GAG CAA TTA AAT
GAC AGC. . . . . 3 '

Y la otra cartilla será el complemento exacto:

. . . . .5 '. . . GCT GTC ATT TAA TTG CTC ATA ACC GTA GAG ATC AGT TGT CTC
TGG. . . . .3 '

En la reacción de PCR, la mayoría de estos cebadores se hibridarán entre sí (lo cual es una
de las razones para evitar el Taq normal, que extendería los extremos 5 'de estos dímeros de
cebadores), mientras que algunos se recocerán en la secuencia de destino con una pequeña
falta de coincidencia. en el medio. Los cebadores deben ser FPLC, HPSF o gel PAGE
purificado (para evitar los molestos cebadores n-menos-1). Contrariamente a la opinión
popular, no es necesario fosforilar los extremos 5 '

Protocolo Configure una reacción de PCR como esta, utilizando una polimerasa de lectura
de prueba como la polimerasa Pfu. 5 µl de 10 x tampón de polimerasa Pfu (incluido el Mg)
4 µl de dNTP 10 mM (es decir, una mezcla de los cuatro a 10 mM cada uno) 0.2 µl de
Primer 1 (los cebadores son ~ 42 mers a 100 pmol / µl) Primer de 0.2 µl 2 1 µl de plantilla
de plásmido (10 ng) 37.6 µl de H2O 2 µl de polimerasa Pfu La polimerasa Pfu contiene
una exonucleasa 3'-5 'y comenzará a masticar el ADN monocatenario (los cebadores) del
extremo 3', haciéndolos más cortos y menos específicos. Por lo tanto ensamblar la
reacción sobre hielo y solo agregar la última enzima. Manténgalo en hielo hasta que lo
ponga en la máquina de PCR, ya precalentado a 94 ° C. Programa de PCR Duración
Temperatura Ciclos 60 segundos 94 ° C 1 30 segundos 94 ° C 12 30 segundos 55 ° C 12
minutos 68 ° C La temperatura de extensión es de 68 ° C para minimizar la "respiración"
del extremo 5 'de la imprimación. Luego, cuando la polimerasa ha leído todo el camino
alrededor del plásmido, es menos probable que desplace el cebador e incorpore la
secuencia "antigua" del plásmido. El tiempo de extensión es de 2 minutos por kb de
plásmido. Enfriar la reacción de PCR a temperatura ambiente y agregar 1 µl de enzima de
restricción DpnI. Incubar a 37 ° C durante 1 hora. DpnI es un cortador de 4 que solo corta
el ADN metilado de la presa. El ADN plasmídico parental se cortará en pedazos mientras
el ADN de PCR naciente se deja intacto. Todas las cepas de E.coli de rutina tienen un
sistema de metilasa de dique intacto. Verifique en la parte posterior del catálogo de NEB
si no está seguro. Transformar 5 µl y 45 µl de la reacción en E. coli competente. No es
necesario realizar una ligadura antes de la transformación. El producto de la PCR es un
círculo "cortado" con las muescas en hebras opuestas desplazadas por 42 pb. Esto es
idéntico a un vector clásico desfosforilado más la transformación del inserto (con un
inserto de 42 pb)