UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán Campo 1

L. Farmacia
Reporte de la practica 2:
“Extraccion, purificación de DNA e identificación de DNA por
electroforesis “

Genética
2001
Equipo 1
Fernández Hernández Jessica Nayely
Jordán Cárdenas Abdiel Josafat
Montes Duque Natalia Stacy
Polina Zuñiga Andres

Fecha de realización de la práctica: 13 de febrero 2018

Fecha de entrega del reporte: 20 de febrero 2018

RESUMEN

La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de DNA y se basa en las

características fisicoquímicas de la molécula. El DNA está constituido por dos cadenas de nucleótidos
unidas entre sí formando una doble hélice. Los nucleótidos están integrados por un azúcar
(desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina o citosina). La
unión de los nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, mediante enlaces fosfodiéster,
dando lugar al esqueleto de la molécula. Las bases de cadenas opuestas se unen mediante puentes
de hidrógeno y mantienen estable la estructura helicoidal. Los grupos fosfato están cargados
negativamente y son polares, lo que le confiere al DNA una carga neta negativa y lo hace altamente
polar, características que son aprovechadas para su extracción.

La electroforesis consiste en la separación de moléculas (proteínas, isoenzimas, ácidos nucleicos) a

través de una matriz tamponada (agarosa, acrilamida, almidón). La matriz funciona como un filtro,
separando las moléculas en un campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen.
En el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en
condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo)
durante la electroforesis.

ABSTRACT

The extraction involves the isolation and purification of DNA molecules and based on the
physicochemical characteristics of the molecule. DNA consists of two chains of nucleotides
joined together to form a double helix. Nucleotides are composed of a sugar (deoxyribose),
a group phosphate and a nitrogenous base (adenine, guanine, thymine or cytosine).
Nucleotide binding occurs between the phosphate group and sugar, by phosphodiester
bonds, resulting in the backbone of the molecule. Opposite strands bases are joined by
hydrogen bonding and maintain stable helical structure. The phosphate groups are negatively
charged and are polar, which gives the DNA a net negative charge and makes it highly polar,
characteristics that are exploited for removal.
Electrophoresis is the separation of molecules (proteins, isoenzymes, nucleic acids) through a
buffered matrix (agarose, acrylamide, starch). The matrix acts as a filter, separating molecules
in an electric field according to the size and net charge they possess. For nucleic acids, the
phosphate group is responsible for the strong negative charge at neutral pH conditions,
making fragments migrate towards the positive pole (anode) during electrophoresis.

Introducción.

Los Ácidos Nucleicos son las biomoléculas portadoras de la información genética. Son
biopolímeros, de elevado peso molecular, formados por otras subunidades estructurales o
monómeros, denominados Nucleótidos. Desde el punto de vista químico, los ácidos nucleicos
son macromoléculas formadas por polímeros lineales de nucleótidos, unidos por enlaces éster
de fosfato, sin periodicidad aparente. De acuerdo a la composición química, los ácidos
nucleicos se clasifican en Ácidos Desoxirribonucleicos (ADN) que se encuentran residiendo
en el núcleo celular y algunos organelos, y en Ácidos Ribonucleicos (ARN) que actúan en el
citoplasma. (Verónica Burriel)
EL ADN está presente en todos los organismos celulares y casi todos los virus, este lleva la
información necesaria para dirigir la síntesis de proteínas y la replicación en la cual se copia
a sí mismo cada vez que una célula se reproduce y transmite a la descendencia la
información que contiene.
Cada molécula de ADN está constituida por dos cadenas o bandas formadas por un
elevado número de compuestos químicos llamados nucleótidos. Estas cadenas forman una
especie de escalera retorcida que se llama doble hélice. Cada nucleótido está formado por
tres unidades: una molécula de azúcar llamada desoxirribosa, un grupo fosfato y uno de
cuatro posibles compuestos nitrogenados llamados bases: adenina (abreviada como A),
guanina (G), timina (T) y citosina (C). (ADN Estructura y funciones)
La investigación sobre el ADN tiene un impacto significativo, especialmente en el ámbito de
la medicina. A través de la tecnología del ADN recombinante los científicos pueden modificar
microorganismos que llegan a convertir en auténticas fábricas para producir grandes
cantidades de sustancias útiles.
Los estudios sobre el ADN humano también revelan la existencia de genes asociados con
enfermedades específicas como la fibrosis quística y determinados tipos de cáncer. Esta
información puede ser valiosa para el diagnóstico preventivo de varios tipos de
enfermedades.
Para la separación de estas moléculas de ADN la electroforesis es una buena opción puesto
que se basa en la migración de iones en un campo eléctrico. Es una de las técnicas analíticas
más importantes dentro de la Bioquímica. Las moléculas biológicas (proteínas, ácidos
nucleicos y polisacáridos) poseen determinada carga eléctrica con grupos aniónicos y
catiónicos capaces de disociarse. La carga neta de la partícula está dada por el pH del
medio y puede ser modificada por la interacción con pequeñas moléculas de iones u otras
macromoléculas por tanto poseen esta propiedad de movilidad en un campo eléctrico. La
movilidad dependerá de la carga que presentan al pH.

Observaciones y resultados
Tabla 1.- Cuantificación del DNA en relación 260/280

Equipo Concentración (ng/μL) 260/280

1 298.57 1.83

2 540.77 1.873

3 882.575 1.879

4 99.674 1.866

5 409.599 1.835
Imagen 1.- Electroforesis del DNA
Discusión de resultados

Al obtener la capa de leucocitos se le agrega buffer de lisis 1 que contiene sacarosa, Tris-HCl,
MgCl2 y tritón X, este buffer su función es lisar a los eritrocitos, en el cual la función de la
sacarosa es crear una medio hipotónico que hará que estallen los eritrocitos y liberen su
material, por el otro lado el Tris es un buffer cuya función principal es la de mantener el pH en
un punto estable, por lo general 8,0. Además, la solución Tris interactúa con el LPS
(lipopolisacárido) de la membrana, lo cual sirve para desestabilizar la membrana aún más.

El tritón X va a ser un detergente no iónico usando para desnaturalizar las membranas de las
células sin desnaturalizar la proteína. Este detergente rompe los conglomerados de proteínas
para promover la actividad enzimática.

Una vez hecho esto se adiciona el buffer de lisis 2, cuya conformación consiste en NaCl y
EDTA, en donde el NaCl rompe la envoltura nuclear de los leucocitos para liberar su material
genético y el EDTA, que protege los ácidos nucleicos de la acción de las enzimas, sustancia
inhibidora de la acción de las ADNasas.

Una vez liberado el contenido se adiciona el SDS que dispersa las lipoproteínas de las
membranas y despolariza complejos proteínicos y posterior mente se agrega el perclorato
que desnaturalizara proteínas basándose en la técnica de salting out que es el resultado de
la competencia por moléculas de solvatación entre los iones salinos agregados y los otros
solutos disueltos. Uno de los factores que explican este efecto es que la concentración
elevada de la sal puede eliminar el agua de hidratación de las moléculas de proteína,
reduciendo entonces su solubilidad.

Posteriormente se agrega NaCl que incrementan la solubilidad de la proteina, en el que los

contraiones adicionales recubren con mayor eficacia las numerosas cargas iónicas de las
moléculas proteicas, con lo que se incrementa la solubilidad de las proteínas.

Al centrifugar la solución se obtiene el sobrenada que tendrá el DNA disuelto, que para que
precipite se agrega isopropanol, que actua cambiando la constante dieléctrica del agua
haciendo que la biomolecula quede en interfase.

Una vez aislado el DNA procedió a realizarse la electroforesis la cual es el movimiento de

partículas cargadas eléctricamente a través de un tamiz molecular

Para esto se utilizó un soporte de agarosa el cual en función de la concentración de la

agarosa se pueden separar segmentos de DNA que contengan d 20 a 50 000 pares de bases

Como buffer de corrida se utilizó TAE este buffer posee una fuerza iónica baja al igual que
una pobre capacidad de amortiguación de pH. El TAE constituye la mejor alternativa (en
comparación al TBE) para el análisis electroforético de fragmentos grandes (> 20 kb) de DNA.
Una de las desventajas del TAE como buffer de electroforesis es que no permite reciclarlo por
más de tres corridas electroforéticas seguidas, a diferencia del TBE cuya efectividad
permanece inalterada durante 3 o 4 días, sin importar el número de corridas electroforéticas
realizadas
El buffer de carga le da peso a la muestra para que el DNA se precipite al fondo de los pozos
así como indicar el corrimiento de cada muestra debido al colorante el cual fue azul de
bromofenol que es un colorante que permite ver la corrida y corre como si fuera tuviera 500
pb de peso

Los ácidos nucleicos tienen un máximo de absorción a una longitud de onda de 260nm. A
esta longitud por lo tanto, la absorción es proporcional a la concentración.

Para determinar la concentración de DNA de Alto Peso Molecular, plásmidos o productos

de PCR, se realizan mediciones a 260 y 280 nm.

La relación de absorbancias a 260/280 se utilizan para evaluar la pureza de las muestras. La

relación a 260/280 es muy estable y se considera que un ADN de pureza óptima tiene un valor
entre 1.8-2.0. Un ADN de pureza aceptable debe tener al menos una relación a 260/280 > 1.6.
Un valor a 260/280 < 1.6 indica una posible contaminación por compuestos aromáticos como
fenoles y proteínas. Un radio a 260/280 > 2.1 podría deberse a la presencia de ARN en la
muestra. No obstante, esta relación resulta mucho más variable que la relación 260/280
dependiendo de factores como la concentración de ADN o de la composición del tampón
de resuspensión de la muestra.

Debido a otros contaminantes una muestra con una relación alta de A260 /A280 puede no
necesariamente producir buenos datos de secuencia. A veces también, una muestra con
una baja relación A260 /A280 puede secuenciarse bien.

Como se puede observar en la tabla No 1 la relación A260/280 para el equipo 1 se obtuvo

un valor de 1.83 el cual entra en el rango de pureza optima para la separación de DNA por
electroforesis aunque en la imagen No 1 se observa que en la primera columna
correspondiente al equipo uno se aprecia varias bandas definidas, y su demás
desplazamiento tiene un buen aspecto. Por lo contrario en las demas columnas de los otros
equipos se puede observar las bandas intensas por lo que tienen mucho DNA y el
desplazamiento se ve barrido. Esto pudo ocurrir por diversos factores como el tamaño del
fragmento la concentración de agarosa o la conformación del DNA otro motivo por el cual
se aprecia que está un poco impuro es porque no se asemeja en nada al marcador que
está a la derecha de la imagen 1 esto puede indicar que talvez el DNA que se aislo no tuvo
los suficientes pares de bases para poder dar un desplazamiento correcto.
Conclusiones

Con forme a los resultados experimentales se puede decir que la extracción de DNA por la
técnica de Salting Out fue eficiente ya que al elaborar la electroforesis se pudo separar una
buena parte de DNA esto se comprobó por la relación de A260/280 la cual nos sirvió para
ver que nuestra muestra de DNA se encuentra pura aunque a la hora de revelar la placa de
agarosa solo se aprecia bandas definidas en un equipo y lo demás degradado esto ocurrió
por diversos factores que no permitieron tener una similitud al marcador utilizado.
Referencias

 BANCO NACIONAL DE ADN CARLOS III (Universidad de Salamanca). Recuperado de:

http://www.bancoadn.org/docs/programa-control-calidad-muestras.pdf

 Extracción sencilla de ADN. (2018). Recuperado de:

http://formacionprofesionalquimica.com/index.php?option=com_k2&view=item&id=146:prot
ocolo-1&Itemid=120&lang=es

 Manual de experimentos para bioquímica. (2018). Recuperado de:

https://books.google.com.mx/books?id=8SAtkthrFEkC&pg=RA1-PA3&lpg=RA1-
PA3&dq=perclorato+de+sodio+en+el+ADN&source=bl&ots=oEphvkw03b&sig=WGMPiT0qyksP
pdewRm196hEsQOs&hl=es-419&sa=X&ved=0ahUKEwjftruL6ujOAhVR-
mMKHYYMA2IQ6AEIJjAC#v=onepage&q=perclorato%20de%20sodio%20en%20el%20ADN&f=f
alse

 Electroforesis en gel
https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-
electrophoresis/a/gel-electrophoresis

 Extracción y purificación de ADN. (2018). Recuperado de:

http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/extraccion.pdf

 Estructura y Propiedades de los Ácidos Nucleicos. (2018). Recuperado de:

http://www.uv.es/tunon/pdf_doc/AcidosNucleicos_veronica.pdf

 Salting Out. (2018). Recuperado de: http://ufq.unq.edu.ar/Docencia-Virtual/BQblog/Salting-in-

Salting-out-precipitacion-solventes.pdf

 Detergentes IBI. (2018). Recuperado de:

http://www.cientificasenna.com/index.php?modulo=catalogo&accion=articulo&id=952

 ¿Cuál es la funcion de un saloucion buffer de Tris en la extracción de ADN? (2018). Recuperado

de: http://www.ehowenespanol.com/funcion-solucion-buffer-tris-extraccion-adn-sobre_43396/