Introducción

La cuantificación de proteínas de manera precisa es esencial para todos los

experimentos relacionados a proteínas en una multitud de temas de investigación. Se
han desarrollado diferentes métodos para cuantificar proteínas totales, o alguna en
particular en un ensayo dado. Los métodos de cuantificación de proteínas totales
incluyen métodos tradicionales tales como la medición de la absorbancia a 280 nm, los
ensayos de Bradford y ácido bicinconínico, así como métodos alternativos como el de
Lowry o ensayos novedosos desarrollados por los proveedores comerciales. Los
proveedores comerciales típicamente proveen un kit bien diseñado y conveniente para
cada tipo de ensayo. Los métodos para cuantificar proteínas individuales incluyen el
ELISA, el Western Blot y más recientemente, la espectrometría de masas, entre otros.
Aquí discutimos algunos de los métodos comúnmente utilizados para determinar la
concentración de proteínas en solución, resaltando sus utilidades y limitaciones. Es
importante notar que ninguno de estos ensayos para proteínas son, específicos para
proteínas, lo que significa que componentes no proteicos pueden interferir, ni
uniformemente precisos y compatibles con todas las proteínas. Más aún, las
modificaciones de las proteínas pueden interferir con la estimación de su concentración
en algunos de estos ensayos cuando se comparan con las proteínas no modificadas.

MÉTODOS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Absorbancia ultravioleta (UV) a 280 nm (rango: 0.1-100 ug/ml)

Los aminoácidos aromáticos tirosina y triptófano le dan a las proteínas su característico
espectro de absorción ultravioleta (UV) a 280 nm. Fenilalanina y puentes disulfuro
también pueden contribuir a la absorción en esa longitud de onda, aunque ligeramente.
Este método es simple y requiere de un volumen de muestra extremadamente pequeño
ya que los nuevos espectrofotómetros emplean un sistema de retención de muestra
durante la medición. Sin embargo, la muestra proteica debe encontrarse pura y no
contener componentes no proteicos con el mismo espectro de absorción, tales como
ácidos nucleicos contaminantes. Se debe conocer la secuencia exacta de aminoácidos
de la proteína analizada y se debe calcular el coeficiente de absorción específico de
esa proteína previa a la determinación de la concentración en solución. Este método es
el más rápido, pero propenso a errores.

Ácido bicinconínico (BCA) o ensayo basado en cobre (rango: 20-2000 ug/ml)

El ensayo de ácido bicinconínico (BCA) fue inventado por Paul K. Smith en 1985 en la
compañía Pierce Chemical Company, el mayor distribuidor de este ensayo. Tanto el
ensayo de BCA como el de Lowry se basan en la conversión del Cu 2+ a Cu1+ en
condiciones alcalinas. Esta conversión es definida como la reacción de Biuret. Esta
reacción es influenciada por cuatro aminoácidos (cisteína, cistina, tirosina y triptófano) y
también por la cadena peptídica.

Figura 1. Representación esquemática del ensayo de BCA.

BCA es un reactivo cromogénico específico para Cu1+ y en el segundo paso de la

reacción dos moléculas de BCA reaccionan con una de ion Cu1+. La cantidad de
Cu2+ reducido es una función de la concentración de proteínas y ser determinada
espectrofotométricamente por un cambio en el color de la solución a púrpura, el cual
absorbe a 562 nm. La absorbancia es directamente proporcional a la cantidad de
proteína presente en la solución y puede ser estimada por comparación con un
estándar de proteína conocido, tal como la albúmina sérica bovina (ASB).
El ensayo de BCA es más tolerante a un rango de detergentes iónicos y no iónicos tales
como el NP-40, Triton X-100 y agentes desnaturalizantes como la urea y el cloruro de
guanidinio, que tienden a interferir con otros ensayos proteicos colorimétricos tales
como el Lowry. Recientemente, Reichelt el (2016), propusieron ajustes simples al
método que pueden llevar a mejorías visibles en la exactitud de la medición,
especialmente para soluciones complejas de proteínas no purificadas, como medios de
cultivo. Utilizan un factor de corrección dado por la medición de ASB agregada a la
muestra. Basado en sus estudios la exactitud de la cuantificación de proteínas por BCA
podría ser mejorada 5 veces, “llevando la cuantificación de proteínas por BCA a niveles
de exactitud comparables a otros métodos más costosos”.
Comparado con otros métodos, el ensayo de BCA es uno de los más sensibles (puede
detectar proteínas en concentraciones tan bajas como 5 ug/mL). Tiene menos
variabilidad que otros (por ej., el ensayo de Bradford), y puede ser utilizado para medir
un amplio rango de concentraciones de proteínas.

Ensayo de Bradford o azul brillante de Coomassie (rango: 20-2000 ug/ml)

El ensayo de Bradford, originalmente descripto por la Dr. Marion Bradford en 1976, es
una de los métodos más populares para la determinación de la concentración de
proteínas. Se basa en la formación de un complejo entre el colorante azul brillante de
Coomassie G-250 y las proteínas en solución. El colorante libre existe en cuatro formas
iónicas. La forma azul más aniónica se une a proteínas y absorbe a 590 nm. La
concentración de proteínas puede ser evaluada determinando la cantidad de colorante
en su forma iónica azul y midiendo la absorbancia de la solución a 592 nm utilizando un
espectrofotómetro. El colorante se une principalmente a residuos de arginina, triptófano,
tirosina, histidina y fenilalanina.

Figura 2. Representación esquemática del ensayo de Bradford.

Entre las ventajas de este método se encuentran su compatibilidad con agentes

reductores utilizados para estabilizar las proteínas en solución, los cuales no son
compatibles con el ensayo de Lowry y en algún grado con el ensayo de BCA, y la
posibilidad de medir proteínas de alto peso molecular ya que el colorante no se une a
péptidos de bajo peso molecular.
La principal limitación del ensayo de Bradford es su incompatibilidad con detergentes,
los cuales se utilizan de rutina para solubilizar proteínas de membrana. Solo un nivel de
detergente no iónico muy bajo, tal como Triton X-100 a una concentración final de 0,008
% (v/v), puede mejorar la sensibilidad y variabilidad del ensayo de Bradford. Los
detergentes pueden ser removidos por cromatografía de exclusión molecular o por
diálisis, lo que lleva a la dilución de la muestra; o por precipitación con fosfato de calcio
o acetona, ambos métodos que permiten recuperar como mucho el 70 % de la cantidad
inicial de proteína. En una publicación reciente Cheng describen un método basado en
el ensayo de Bradford que permite la cuantificación de proteínas de manera rápida
incluso cuando la solución de proteínas contiene substancias que interfieren. El método
demuestra una tasa de recuperación de proteínas mejorada luego de tan solo 1 hora de
precipitación en acetona posterior a la adición de sacarosa, un componente que no
interfiere con el ensayo de Bradford.

Ensayo de Lowry para cuantificar proteínas (Rango: 10-1000 ug/ml)

El ensayo de Lowry, propuesto por Oliver H. Lowry en 1951, se basa en dos reacciones
químicas. La primera reacción es la reducción de los iones de cobre en condiciones
alcalinas, los cual forma un complejo con los enlaces peptídicos (reacción de Biuret). La
segunda es la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu por el complejo cobre-enlace
peptídico, el cual causa un cambio en el color de la solución a azulado con una
absorción en el rango de 650 a 750 nm. La cantidad de proteína en la muestra puede
ser estimada utilizando una curva de calibración con una solución de una proteína
estándar seleccionada, tal como la ASB.

Figura 3. Representación esquemática del ensayo de Lowry.

Las ventajas de este ensayo son su sensibilidad, y lo más importante, su exactitud. Sin
embargo, requiere de más tiempo que otros ensayos y muchos compuestos
comúnmente utilizados en búferes de preparación de proteínas (tales como
detergentes, carbohidratos, glicerol, tricina, EDTA, Tris) interfieren con el ensayo de
Lowry y forman precipitados. No obstante, el efecto de estas substancias puede ser
reducido diluyendo la muestra, pero solo si la concentración de proteínas es lo
suficientemente alta. Más aún, se ha demostrado que el tiempo para realizar este
ensayo puede ser disminuido aumentando la temperatura o utilizando un horno
microondas.

El ensayo de 3-(4-carboxibenzil)quinolina-2-carboxialdehído (CBQCA).

La 3-(4-carboxibenzil)quinolina-2-carboxialdehído (CBQCA) es un reactivo fluorogénico
sensible utilizado para la detección de aminas en las proteínas. Dado que solo puede
detectar aquellas aminas de la proteína en estudio que se encuentran accesibles, este
método tiene las mismas limitaciones que los métodos espectrofotométricos para los
cuales el resultado depende del número de ciertos aminoácidos en la proteína. Sin
embargo, la CBQCA es muy sensible y puede detectar entre 10 ng y 150 microgramos
de proteína en un volumen de 100 μl. También, en el lado positivo, el reactivo de
CBQCA funciona bien en presencia de substancias como lípidos que se sabe que
interfieren en muchos otros métodos de determinación de proteínas, o cuando se utiliza
para cuantificar péptidos o proteínas ligadas a una superficie o encapsuladas.

Ensayo de cuantificación de proteína blanco específica

Un paso crucial en muchos experimentos es la cuantificación de una proteína específica
en solución. Se han utilizado varias técnicas que logran tal cometido. Las más comunes
son ELISA, Western blot, y espectrometría de masas. El ELISA y el Western blot se
discuten en Aplicaciones de anticuerpos, la espectrometría de masas se discute
brevemente aquí, y se discute en el artículo de revisión de Labome Bioanálisis
cuantitativo de proteínas por espectrometría de masas.

Espectrometría de masas de proteínas

La espectrometría de masas de proteínas es un método de uso creciente para la
cuantificación de proteínas. Un paso importante en el análisis proteómico, además de la
caracterización proteica, es la posibilidad de cuantificar una proteína específica. Se han
introducido e implementado muchas técnicas para la cuantificación de proteínas por
espectrometría de masas. Normalmente, se añaden isótopos estables más pesados de
carbono (13C) o nitrógeno (15N) a una muestra (péptidos o proteínas) mientras que sus
isótopos livianos correspondientes (12C and 14N) se añaden a una segunda muestra
(estándar interno) que luego se mezclan en el análisis. Debido a la diferencia de masas
es posible analizar la relación entre las intensidad de los picos de las dos muestras por
un analizador de masas la cual se corresponde con la relación de sus abundancias
relativas.

Cuantificación de proteínas en células vivas individuales

Ligar la expresión de una proteína de interés a la de un reportero fluorescente a través
de una construcción de “reportero para cuantificación de proteína” (del inglés, PQR)
puede asegurar una expresión estequiométrica de la proteína y el reportero; por ende,
la cantidad de proteína puede ser inferida a partir de la intensidad de fluorescencia.
Este ligamiento puede hacerse ya sea por experimentos de transfección o por edición
genómica.

Figura 5. Representación esquemática de la tecnología de la “nariz química”.

Métodos basados en nanopartículas y nanoporos

Las ya mencionadas limitaciones de los métodos convencionales de cuantificación
conducen al desarrollo de nuevas estrategias para la determinación de proteínas en
soluciones simples y complejas. Una de las más populares se basa en el uso de
nanopartículas, debido a sus propiedades ópticas. Brevemente, una propiedad
importante es el cambio de la longitud de onda a la cual absorben luz cuando su
tamaño aumenta por la unión a otras moléculas o por agregación. Dado que el cambio
de absorción de luz es en el rango visible, el cambio se percibe como un cambio de
color. Hasta ahora se han utilizado en conjunto con partículas de unión a proteínas, por
ejemplo anticuerpos, péptidos o aptámeros.
Su sensor consiste de una mezcla de nanopartículas de oro con diferentes formas que
se pueden agregar de manera diferencial cuando interactúan con diferentes proteínas
(Figura 5). En base a su espectro de absorción lumínico, las partículas permiten la
detección y cuantificación de proteínas purificadas en soluciones acuosas o proteínas
no purificadas en soluciones complejas.
Un segundo método que ha sido desarrollado recientemente se basa en el uso de
nanoporos en estado sólido. Utilizaron moléculas largas de ADN como portadoras y
nanoporos de vidrio para medir la concentración de proteínas en solución en el rango
nanomolar. En este método, las moléculas de ADN, capaces de unir proteínas en sitios
específicos, translocan a través de los nanoporos con la ayuda de una corriente
eléctrica. Cuando transloca, el ADN causa una caída en la señal de la corriente. Una
segunda caída se registra cuando la proteína se une al ADN. Mientras más alta es la
concentración de proteínas, mas cargado se encuentra el portador. La frecuencia de los
picos de las caídas secundarias de corriente también incrementa con la concentración
de proteínas.

Ensayo de BCA
Prácticamente todos los ensayos para proteínas totales fueron provistos por Pierce,
compañía en donde uno de los científicos inventó el ensayo hace muchos años.
Thermo Fisher compró a Pierce hace unos años. Los ensayos de BCA de Thermo
Fisher Pierce se utilizaron para estudiar la carcinogénesis tiroidea, el rol de VLDLR en
la división celular, las modificaciones postraduccionales de S100A4, las proteínas
humanas RNP H y RNP F como silenciadoras del receptor 2 del factor de crecimiento
de fibroblastos, el mecanismo subyacente al incremento de la actividad, la regulación y
el rol de la expresión de NAG-1 en células PC-3 de cáncer de próstata humanos
tratadas con VES, el rol del receptor de IGF-1 en la función fotoreceptora, el rol de Dlx5
en el acoplamiento entre osteoblastos y osteoclastos, y en muchos otros. Sus kits de
micro ensayos de BCA fueron utilizados para estudiar la localización
inmunohistoquímica de osteopenia en la glándula de la cáscara del huevo, y en la
cáscara del huevo de aves, para estudiar la recuperación tras injuria por impacto
cortical controlado en ratas, y la localización en membrana de la nucleoproteína del
virus de la hepatitis C y la propagación del virus.

Ensayo de Bradford
Thermo Fisher Pierce también es uno de los principales proveedores de kits de ensayos
de Bradford. Los kits de ensayos de Coomassie/Bradford de Pierce fueron utilizados
para evaluar la expresión de la proteína chaperona ERp29, el rol de YKL-40 en la
modulación de la actividad biológica del factor de crecimiento de fibroblastos básico,
entre muchos otros tópicos de investigación.
Los reactivos de ensayos de Bradford de Bio-Rad fueron citados en numerosas
publicaciones.

Ensayo de Lowry
El ensayo de Lowry de Pierce fue utilizado para cuantificar la concentración de
proteínas y el de Bio-Rad Laboratories fue utilizado en el ensayo de proteínas totales
DC de Bio-Rad es una versión modificada del ensayo de Lowry. Es uno de los ensayos
más populares para proteínas dado que es compatible con detergentes. Este kit ha sido
utilizado para determinar la concentración de proteínas para estudiar la estructura y
función de la proteína humana de cuatro pasos transmembrana CD8, el efecto de la
ablación específica en músculo esquelético de actina (cito) gama en el fenotipo mdx,
entre otros.

Bibliografía

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quantitation assays for biopharmaceutical applications. Mol Biotechnol. 2007
 Brady P, Macnaughtan M. Evaluation of colorimetric assays for analyzing
reductively methylated proteins: Biases and mechanistic insights. Anal Biochem.
2015
 http://www.fagro.edu.uy/~nutrical/ensenanza/AVI%20WEB/cursoema/detdePC.