INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

MÉTODOS DE ANÁLISIS
5QM1
GUÍA DE ESTUDIO DE CROMATOGRAFÍA
Primera parte
Alumna: Diana Nataly Meza Estrada

A. GENERALIDADES DE LA CROMATOGRAFÍA
1. Defina los siguientes conceptos
a) Cromatografía:
Técnica de separación en la cual, los componentes de la muestra se distribuyen
entre dos fases de diferente naturaleza, como consecuencia de la variación de velocidad
que se establece al ser arrastrados por una fase móvil, líquida o gaseosa, a través de una
fase estacionaria, sólida o líquida.
b) Elución:
Proceso por el cual todos los solutos terminan por abandonar la columna
c) Fase móvil
Es aquella que fluye a través de una fase estacionaria, arrastrando con ella a los
compuestos de la mezcla.
d) Fase estacionaria
Es aquella en la cual están retenidos los componentes de la muestra, y a través de
la cual fluye la fase móvil arrastrando a los mismos.
e) Constante de distribución
La constante de distribución es la concentración de un compuesto en o sobre la
fase estacionaria, dividida por su concentración en la fase móvil. Puesto que en
cromatografía un compuesto puede estar presente en más de una forma (por ejemplo,
formas asociadas y disociadas), las condiciones analíticas utilizadas aquí, se refieren a la
cantidad total presente, sin tener en cuenta la existencia de varias formas.
f) Factor de selectividad
Es una medida del tiempo que un compuesto permanece en la fase estacionaria,
en relación con el tiempo que permanece en la fase móvil.
g) Plato teórico
Se considera un sistema estático en equilibrio, en el cual el soluto recorre la
columna mediante una serie de equilibrios, cada uno de los cuales se alcanza, en toda su
extensión, en un segmento o porción de la columna, llamado plato teórico.
h) Tiempo de retención
Tiempo que tarda cada sustancia en abandonar el sistema cromatográfico.
Esta retención se ejerce en función de las características moleculares de cada compuesto.
i) Volumen de elución
Es el volumen entre el punto en el que se encuentran los eluyentes y la entrada de
la columna.
j) Volumen vacío
Es el volumen de fase móvil requerido para eluir un componente no retenido. Se
puede calcular a partir del tiempo muerto y la velocidad de flujo F, en ml/min:
Vm=tMxF
En la cromatografía de exclusión por tamaño, se usa el símbolo VO.
k) Tiempo muerto
Es el tiempo requerido para la elución de un componente no retenido.
l) Resolución
La resolución es la separación de dos componentes en una mezcla, calculada por:
Rs = 2(tR2 – tR1)/(W1 + W2)
Donde tR2 y tR1 son los tiempos de retención de los dos componentes; y W2 y W1 son los
anchos correspondientes en las bases de los picos obtenidos extrapolando los lados
relativamente rectos de los picos hasta la línea de base.
Cuando se usan integradores electrónicos, puede ser conveniente determinar la
resolución, mediante la ecuación:
Rs= 1,18(tR2 – tR1)/(W1,h/2 + W2,h/2)
2. ¿Cuáles son los criterios de clasificación de la cromatografía?
CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

Tipo Fase Estacionaria Fase móvil Interacción

Adsorción Sólido Liquido-gas Fuerzas de V.W
Cambio iónico Resina Liquido Fuerza eléctrica
Tamaño de
Exclusión Gel Liquido
partícula
Interacciones
Afinidad Sólido Liquido
biológicas
Partición Liquido Liquido-gas Solubilidad

También se pueden clasificar en función de la forma en la que se lleve a cabo:

a) PLANA: La fase estacionaria se coloca sobre una superficie plana.
b) COLUMNA: se utiliza un tubo de vidrio cilíndrico como soporte de la fase estacionaria y
se hace pasar a través de ella la fase móvil.
3. Haga un diagrama de la clasificación de la cromatografía, considere todos los criterios.
El diagrama se anexó al final del documento
4. Explique los principios de separación de los siguientes tipos de cromatografía
a) Por reparto
La separación de las sustancias ocurre con una fase estacionaria líquida y una fase
móvil líquida. Es decir, una cromatografía líquido-líquido. También puede efectuarse con
una fase móvil gaseosa, siendo una cromatografía líquido-gas.
Dentro de las cromatografías de reparto encontramos las siguientes técnicas:

 Cromatografía en papel

 Cromatografía de gases

 HPLC o Cromatografía líquida de alta resolución

 Cromatografía líquida clásica

 Cromatografía líquida en fase inversa

b) Por adsorción
La separación se basa fundamentalmente en las distintas afinidades de adsorción
de los componentes de la muestra hacia la superficie de un sólido que conforma la fase
estacionaria. La fuerza con la que es adsorbido un componente dependerá de la polaridad
de los componentes, de la actividad del adsorbente que conforma la fase estacionaria y de
la polaridad de la fase móvil.
También se denomina cromatografía de adsorción líquido-sólido o cromatografía líquido-
sólido. Esto es debido a que la fase móvil es líquida y la fase estacionaria es sólida. La fase
estacionaria está formada por partículas finamente divididas de sílice o de alúmina. En
algunas fuentes catalogan -desconozco si erroneamente- la fase móvil como sólida o
gaseosa.
El máximo exponente de este tipo de cromatografía es la cromatografía en capa fina. La
fase estacionaria de esta técnica es un gel, que puede ser de celulosa, sílica, óxido de
aluminio… etc. La siguiente entrada tratará específicamente de una práctica usando esta
técnica cromatográfica.

c) Por intercambio iónico

Este tipo de cromatografía se basa en la afinidad de los iones de la muestra,
disuelta en la fase móvil, por los iones de la fase estacionaria. La fuerza de interacción que
ocurre entre los iones de la muestra y la fase estacionaria es la fuerza electrostática.
El eluyente que conforma la fase móvil suele ser una solución acuosa tamponada. La carga
eléctrica de muestra y fase móvil debe ser la misma, y opuesta a la carga de la fase
estacionaria. Esta fase generalmente es una resina. Los iones de la muestra compiten con
los iones de la fase móvil por los sitios iónicos de la fase estacionaria. Los que tengan una
atracción electrostática más fuerte estarán más retenidos en la resina y la atravesarán con
mayor lentitud.
Según la disposición de las cargas de la muestra y las fases, podemos encontrar dos tipos
de técnicas de cromatografía de intercambio iónico:

 Cromatografía de intercambio aniónico.

 Cromatografía de intercambio catiónico.

d) Por exclusión molecular

También llamada cromatografía de tamizado molecular, de filtración por gel o de
penetrabilidad. Separa los componentes de una muestra en función de su peso molecular.
La fase móvil es un disolvente, que puede ser acuoso u orgánico en función de la
solubilidad de la muestra.
La fase estacionaria es químicamente inerte, pero si la fase móvil es acuosa el gel deberá
ser hidrófilo e hincharse en contacto con el agua destilada. En cambio, si la fase móvil es
orgánica, la fase estacionaria será un gel hidrófobo que se hinchará absorbiendo el
disolvente orgánico.
Debido al tamaño del poro, las moléculas pequeñas quedarán retenidas. En cambio, las
moléculas grandes no entrarán en los poros y atravesarán el gel con mayor rapidez.

Los usos de este tipo de cromatografía son varios. Determinación de masas moleculares,
separación de proteínas marcadas, y la eliminación de sustancias que interfieren en
determinadas mezclas, son algunos de ellos.

e) Por afinidad biológica

Esta técnica, realizada en columna, se usa para separar subclases celulares y
obtenerlas en estado puro. Un claro ejemplo sería obtener linfocitos B o linfocitos T a
partir de una muestra de sangre periférica.
La fase estacionaria es un adsorbente conocido como ligando. Este adsorbente es capaz
de interaccionar de manera bioespecífica con la superficie de las células que se pretenden
separar. El eluyente de la fase móvil, por su parte, debe ser un disolvente apropiado para
las células que se pretenden separar.
En ocasiones es necesario un tratamiento previo en las células que se pretenden separar.
Esto es debido a que el nexo de unión de las células con el ligando está ocupado por otro
componente químico. Estos componentes se deben retirar mediante el tratamiento.
Si un determinado antígeno se encuentra ocupado por un anticuerpo, el ligando específico
para interaccionar con células que presenten dicho antígeno no podrá retener las células
en el interior de la columna. En ese caso sería necesario el tratamiento mencionado en el
párrafo anterior.
Cuando la muestra atraviesa la fase estacionaria, el ligando retiene las células buscadas. El
resto atravesarán la columna junto con el eluyente. Finalmente, para recoger las células
retenidas, hay que forzar su salida con un flujo de eluyente a una concentración mayor.
De este modo atravesarán la fase estacionaria permitiendo su obtención.

f) De líquidos supercríticos
La cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) es una forma de cromatografía de fase
normal que se utiliza para el análisis y purificación de moléculas de bajo a moderado peso
molecular. Los principios son similares a los de HPLC sin embargo SFC típicamente utiliza
CO2 como la fase móvil.

B. CROMATOGRAFÍA EN CAMA PLANA

a) ¿Cuáles son los soportes empleados en la cromatografía en cama plana?
Papel poroso o soportes de cromatografía: vidrio, Plástico ó Metálicos (ej:
Aluminio).
b) Describa las formas de desarrollo en la cromatografía en cama plana.
Para realizar una cromatografía en capa plana se marca el soporte con una línea
que estará marcada con los puntos iniciales de las sustancias problema.
Se rellena el recipiente de cromatografía (de base rectangular y unos 25 cm de altura) con
un par de centímetros de altura de eluyente (suele ser agua, acetona, alcohol etílico u otro
compuesto orgánico, pero depende del analito).
Se introduce la placa cromatográfica en el recipiente y se controla el tiempo del proceso.
Cuando se ha conseguido una buena
separación, se extrae la placa
cromatográfica del recipiente y se seca,
atendiendo a los factores que
permitirán la obtención de resultados
analíticos: longitud de cada recorrido
para cada componente, grosor de cada
línea (un pequeño punto de muestra
muy concentrada es mejor que un
punto muy grueso), tiempo de
cromatografía, si hay o no patrón,
resultados con diferentes tipos de
eluyentes.
c) ¿Qué características deben tener los disolventes empleados cómo fase móvil en las
cromatografías por adsorción y por reparto? Emplee una tabla para especificar en cada
una, e indique ejemplos en cada caso.
Tipo de Cromatografía Característica de fase móvil Ejemplo
 La fase móvil es menos
polar que la fase
estacionaria.
 Disolvente o mezcla de
disolventes, seleccionado Éter de petróleo < tetracloruro
en base a su polaridad de carbono < ciclohexano < éter
 Eluyentes polares: etílico < acetona < benceno <
Adsorción
Arrastran más eficazmente acetato de etilo < cloroformo <
los compuestos más etanol < metanol < agua <
retenidos en la fase piridina < ácido acético
estacionaria.
 Eluyentes menos polares:
Arrastran muy lentamente
a los compuestos.
 La fase móvil puede ser un
líquido (cromatografía de
partición líquido-líquido) o
un gas (cromatografía de
Formalina, etanol, ácido acético,
partición gas-líquido, GLC)
etanol, isopropanol, acetona, n
Se puede llevar a cabo en la fase
Reparto propanol, terbutanol, n butanol,
normal cuando la fase móvil es no
alcohol n amílico, acetato de
polar y la fase estacionaria es
etílo.
fuertemente polar, o en las fases
invertidas (fase móvil polar y la
fase estacionaria disolvente no
polar)

REFERENCIAS:

 UNAM; Cromatografía;
04/06/2017
 http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/5.3CromatografiadeGasesInstrumentacion_
2759.pdf
 CUN; Cromatografía de partición; 05/06/2017 http://www.cun.es/diccionario-
medico/terminos/cromatografia-particion UNAM
 Técnicas Cromatográficas; 05/06/2017;
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf OMS
 file:///C:/Users/HP/Downloads/separaciones_por_cromatografia_1%20(1).pdf
 http://biomodel.uah.es/tecnicas/crom/inicio.htm