UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN CAMPO 1

LIC. EN FARMACIA

Grupo: 1451

Reporte de la práctica No. 4 “Diálisis y electroforesis”

Equipo 3:

Asesores:
Q.F.B. Gabriela Escalante Reynoso

Q.F.B. Nydia B. González

Fecha de realización de la práctica: 9 de Septiembre del 2014

Fecha de entrega del reporte: 17 de Septiembre del 2014
 Introducción

DIALISIS. Este procedimiento se utiliza para eliminar compuestos de bajo peso molecular
presentes en la soluciones de proteínas o bien para cambiar el medio líquido en el que se
encuentran.

La diálisis se basa en la imposibilidad de que las proteínas atraviesen los poros de una
membrana semipermeable debido a su gran tamaño en tanto que las moléculas con un peso
molecular más bajo se distribuyen, hasta llegar a un equilibrio de concentraciones, entre ambos
lados de la membrana.

Si se modifica varias veces la solución externa las condiciones en el interior de una bolsa
o tubo de diálisis (por ejemplo: las concentraciones de las sales, el pH, etc.) serán iguales a las
de la solución circundante.

ELECTROFORESIS. Es un tipo de filtración y separación e identificación de moléculas, de

mezclas de compuestos biológicos, según la movilidad o desplazamiento de estas en un campo
eléctrico a través de una matriz porosa la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y
carga eléctrica.

Dependiendo de la carga eléctrica las moléculas y los compuestos se separan en distintos polos
en el procedimiento de la electroforesis sin embargo hay compuestos en los cuales su carga
neta es de cero y a esto se le denomina punto isoeléctrico el cual se calcula con la siguiente
formula:
p.I.= pka1+pKa22

En la práctica el compuesto que pretendemos obtener es la amilasa la cual obtendremos

a partir de la saliva. La amilasa es una enzima degradadora que ayuda a la pre digestión; sus
activan tés son cloruro, yoduro, bromuro, nitratos, aspagina-

Objetivo General

Llevar a cabo una diálisis con una muestra de saliva dializada y no dializada, para que así de esta
manera se pueda comparar la actividad de la amilasa salival, y las técnicas de purificación y separación,
por medio de pruebas cualitativas.

Dialisis: Analizar una diálisis de una muestra de saliva para observar la actividad del alfa amilasa
a través de una prueba cualitativa con lugol

Electroforesis: Separar una muestra de tres aminoácidos empleando una solución buffer
a través de une electroforesis (con las condiciones Ph = 8.6, 200 Volts a 60 minutos)
para su identificación, utilizando un revelador (ninhidrina)
 Objetivos particulares

Separar una mezcla de aminoácidos, mediante electroforesis en papel y revelarlos con

dihidrita para su identificación.

Separar una mezcla de aminoácidos, mediante electroforesis en papel y revelarlos con

dihidrita para su identificación.

Comprender el fundamento de las técnicas de separación y purificación (electroforesis

y diálisis)

Aprender a realizar correctamente la diálisis y una electroforesis

Identificar que aminoácidos contiene la muestra biológica (saliva)

Dializar una muestra de saliva y comparar la actividad de la enzima amilasa de

diferentes sujetos, mediante un método cualitativo colorimétrico en muestras directas y
dializadas

Metodología

La indicada en el manual de Bioquimica, correspondiente a la práctica 4 “Diálisis y

electroforesis”, páginas 43, 44 y 45.

Resultados y Observaciones

Tabla No.1 “Actividad de la enzima amilasa salival dializada y no dializada”.

TIEMPO DE TOMA DE MUESTRA AMILASA SALIVAL NO AMILASA SALIVAL DIALIZADA

DIALIZADA

30 seg GAMA DE COLORES GAMA DE COLORES

60 seg GAMA DE COLORES GAMA DE COLORES

90 seg GAMA DE COLORES GAMA DE COLORES

120 seg GAMA DE COLORES GAMA DE COLORES

150 seg GAMA DE COLORES GAMA DE COLORES

 180 seg GAMA DE COLORES GAMA DE COLORES

210 seg GAMA DE COLORES GAMA DE COLORES

240 seg GAMA DE COLORES GAMA DE COLORES

270 seg GAMA DE COLORES GAMA DE COLORES

300 seg GAMA DE COLORES GAMA DE COLORES

330 seg GAMA DE COLORES GAMA DE COLORES

360 seg GAMA DE COLORES GAMA DE COLORES

Tabla No.2 “Técnica de electroforesis en papel”

AMINOÁCIDO CARGA NETA MIGRACIÓN MIGRACIÓN OBSERVACION ES

A pH de 8.6 HIPOTÉTICA EXPERIMENTA L

Color morado
Ácido glutámico 3.22 Ánodo Ánodo
concentrado
Prolina 6.48 Neutro No se movio Color Amarillo y
un *ligero
desplazamiento
Hacia el catodo
Color morado
Lisina 9.74 Cátodo Cátodo
disperso
 Intro: esto es debido a que en la composición de la saliva además del agua, mucina, carbonatos y
lisosima esta presente la enzima a-amilasa que su principal función es degradar almidon,

Discusión de Resultados

DIÁLISIS

En el procedimiento para encontrar la dilución adecuada de la saliva, se presentó actividad

enzimática de la α-amilasa, ya que no esta dialisada por lo que la mas adecuada fue .2 y .8 para
prolongar el tiempo de reacción con el almidon y asi estar en el rango de 120-180 segundos.

Para la diálisis de la saliva se coloco el tubo para diálisis en un medio hipotónico para provocar
que los iones Na+ y Cl- traspasaran la membrana celulósica, las pequeñas moléculas abandonan el saco
hasta que su concentración es la misma a ambos lados de la membrana, es ventajosos reemplazar el
disolvente por nuevas cantidades de producto puro continuamente para no generar una saturación ya
que esto impide que lo iones atraviesen la membrana.

Para una eficiente hidrólisis enzimática del almidón por la amilasa conviene que esté
gelatinizado, por esta razón se realiza un calentamiento previo del almidón a 37° C antes de la adición de
dicha enzima:

[[[[[[[[[[{{Reacción de hidrólisis ( ) 2 C6H10O5 4 + nH2O → nC12H22O11]]]]

Para cuantificar el tiempo de reacción de hidrolisis se utilizo lugol, que consiste en 5 g de I2 y 10

g de KI diluidos con 85 mL de agua destilada, obteniéndose una disolución amarilla con una
concentración total de yodo de 150 mg/mL. El yoduro de potasio hace el yodo diatómico soluble en
agua, debido a la formación de iones triyoduro I3-. Y por ello también se utilizo esta disolución para
identificar polisacáridos como almidon, maltosa, dextrinas y glucosa formando un complejo de inclusión
termolábil que se caracteriza por presentar distintos colores según las ramificaciones que presente la
molécula.
La amilosa, el componente del almidón de cadena lineal, forma hélices donde se juntan las
moléculas de yodo, formando un color azul oscuro a negro. La amilopectina,1 el componente
del almidón de cadena ramificada, forma hélices mucho más cortas, y las moléculas de yodo son
incapaces de juntarse, obteniéndose un color entre naranja y amarillo. Al romperse o hidrolizarse el
almidón en unidades más pequeñas de carbohidrato, el color azul-negro desaparece. (cita)

1. "Química Orgánica". Morrison y Boyd 5º Edición

2. Volver arriba↑ "Química de los alimentos: Manual de laboratorio". Nuria Bolaños V., Giselle Lutz C.,
Carlos H. Herrera R. - 2003. pág 10

Por lo que en la cámara de porcelana se obtuvieron coloraciones de Azul a

Amarillo, hidrolizando por completo al almidón, ya que la actividad enzimática es rápida y alta en saliva
no dializada.
 la actividad enzimática que presentó la α-amilasa en saliva dializada fue menorr a la actividad
enzimática de la saliva diluida ya que el tiempo que se tardo en hidrolizar al almidon fue de 5 minutos 30
segundos debido a que no poseía los iones Cl-, que de acuerdo a la literatura la amilasa es una enzima
que requiere de la presencia de iones cloruro para llevar a cabo su actividad enzimática; ésta actúan a lo
largo de cualquier punto de la cadena de los carbohidratos, descomponiéndolos en dextrina desde la
amilopectina; por ello rompe los enlaces α 1-4 del almidón. (Cita)

ELECTROFORESIS
Algunos de los factores que afectan en el desarrollo de una electroforesis y que condicionan su
utilidad en el laboratorio, son básicamente:

-La carga neta de la sustancia en migración

-La fuerza iónica del medio
-La estructura y el tamaño de la sustancia
-El potencial del campo eléctrico aplicado durante el proceso
-La intensidad y características generales de la corriente eléctrica aplicada
-El soporte utilizado
-El revelado
-Carga neta de la sustancia en migración

La influencia del pH sobre la carga neta es especialmente importante ya que hay sustancias que,
dado su carácter anfótero (es el caso de las proteínas) pueden encontrarse cargadas positiva, o
negativamente.

Se define como punto isoeléctrico (pl) como, aquel valor de pH al cual el balance de

cargas positivas y negativas superficiales de una sustancia es cero (carga neta nula). Al pH de su punto
isoeléctrico, una sustancia no presenta carga neta alguna y por tanto, al ser sometida a un proceso
electroforético no migra (permanece inmóvil el punto de aplicación).
Cuando el pH es superior al pl, la sustancia se encuentra cargada negativamente (el número de
cargas negativas supera al de las positivas) y, sometida a una electroforesis migrara hacia el polo positivo
(ánodo). Cuando el pH del medio es inferior al de su punto isoeléctrico, la sustancia cargada
positivamente se dirigirá hacia el cátodo (polo negativo).

Fuerza iónica del medio

Al igual que el pH final, la fuerza iónica depende del tampón elegido para la electroforesis.
En un proceso electroforético, la corriente eléctrica es transportada por todos los iones
presentes, tanto los debidos a la muestra en solución, como los del tampón utilizado. Cuanto más
concentrado se encuentre el tampón, mayor es la proporción de corriente transportada por los iones del
tampón y menor la transportada por la muestra que se desea separar, de manera que esta última
migrará más despacio.
 En cualquier proceso electroforético, la concentración del tampón elegido en cada caso debe ser
suficiente para:

-Mantener el pH adecuado
-Proporcionar una fuerza iónica que permita el movimiento de cargas.
-Cuando la concentración del tampón es superior a la requerida, la migración de las sustancias
presentes en la muestra es más lenta y peor la separación conseguida.

Estructura y tamaño de la sustancia

Aunque estos factores no influyen por igual en todos los procesos electroforéticos, en ocasiones
son de gran importancia. Tal es el caso de aquellas electroforesis en las que el soporte elegido permite el
paso selectivo de las moléculas en función de su tamaño (retiene las partículas más grandes y deja pasar
las de menor tamaño).

Potencial del campo eléctrico aplicado

La movilidad electroforética de una sustancia es mayor cuanto mayor es el potencial eléctrico

aplicado. No obstante, recurrir a un gran aumento de voltaje para acelerar el proceso electroforético
presenta un gran inconveniente de que se produce un aumento en la temperatura, que, a su vez, es el
responsable de:

Alteraciones debidas al calor, de la muestra sometida a electroforesis (por ejemplo, cuando se

trata de proteínas plasmáticas se produce su desnaturalización por el calor).

Evaporación del tampón utilizado.

Como consecuencia de la evaporación, el tampón queda más concentrado, aumenta su

fuerza iónica y se dificulta el desarrollo electroforético.

Soporte

En general, una electroforesis puede realizarse directamente en una solución tamponada de la

sustancia que se desea separar (electroforesis libre), o puede hacerse sobre un soporte de manera que
una vezterminado el proceso, las fracciones queden permanentemente separadas y sea fácil proceder a
su cuantificación.

Revelado

Para el revelado de los trazados obtenidos, correspondientes a cada una de las fracciones
separadas de la muestra, puede recurrirse a diversos procedimientos, en función de la sustancia y de la
sensibilidad requerida en cada momento.
 La utilización de sustancias fluorescentes (como la fluoresceína) aumenta la sensibilidad hasta
un nanogramo, mientras que la tinción de plata, mejora en unas 100 veces la sensibilidad obtenida con
el colorante de coomasie.

ACIDO GLUTAMICO
Pertenece al grupo de los llamados aminoácidos ácidos, o con carga negativa a pH fisiológico,
debido a que presenta un segundo grupo carboxilo en su cadena secundaria. Sus pK son 1,9; 3,1; 10,5
para sus grupos alfa-carboxilo, delta-carboxilo y alfa-amino.

PROLINA

Tiene una carga neutra.

LISINA
Actúa químicamente como una base, al igual que la arginina y la histidina, ya que su cadena
lateral contiene un grupo amino protonable que a menudo participa en puentes de hidrógeno y como
base general en catálisis.

Este grupo amino, además de proveer de carga positiva a las proteínas, es acetilable por enzimas
específicas, conocidas como acetiltransferasas. Presenta carga positiva

Debido a que el acido glutamico presenta una carga negativa, al llevarse a cabo la electroforesis
este aminoacido migro hacia el catodo (cargas opuestas se atraen); de manera contraria la lisina (con
carga positiva) migro hacia el anodo; a diferencia de los aminoacidos mencionados la prolina
permanecio al centro del catodo y anodo ya que este aminoacido presenta una carga neutra

Calculos y graficos

PUNTO ISOELÉCTRICO

ACIDO GLUTAMICO
PI= (PK1 +PK2) /2
Pl= 2.1+9.52= 5.8

PROLINA
PL=2+10.62=6.3

LISINA
PL=2.2+9.22=5.7

Conclusiones

Por ende los resultados esperados y correctos son, que en la diálisis se pierdan los iones Cl- que
son un cofactor para la actividad enzimática de la amilasa, y así se esperaba que la hidrolisis del almidón
fuera nula, es decir que no se presentara actividad enzimática de la α-amilasa, obteniendo así el
complejo formado por almidón-yodo característico de un color azul morado; y experimentalmente
obtener en nuestra cámara de porcelana las coloraciones de Azul, debido a que el lugol identificaría el
polisacárido que es el almidón.

Referencias

KOOLMAN, Jan. et. al. (2004). “Bioquímica: texto y atlas”. 3a. ed. Madrid, España, Médica
Panamericana. p. 78 y 198.

“Actividad enzimática”, [En línea]

<http://www.aulavirtual-exactas.dyndns.org/claroline/backends/download.php?url=L1RQL
1RyYWJham9fcC0xMC0ucGRm&cidReset=true&cidReq=QUIMBIO>[Consulta 16 de septiembre
2014].

”Enzimas”, [En línea]

<http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidt
h02/parte07/01.html>[Consulta 16 de septiembre 2014].

Bonhinski, R.C. 1985 “Bioquímica”, 2da edición, Fondo Educativo Interamericano,

Boston.

Martin D.W, Mayes P.A. y Rodwell, W. 1982. “Bioquimica de Harper”. Octava edicion,
Editorial El Manual Moderno, Mexico.

MORALES, B., Illán. (2008) [En línea]

<<http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Exposicion_electroforesis_5087.pdf>>
[Consultado el 16 de Septiembre, 2014].