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Prctica N. 1:
CULTIVO DE CLULAS Y TEJIDOS VEGETALES
INTRODUCCIN
El cultivo in vitro, micropropagacin o propagacin vegetal in vitro, es el cultivo de
clulas, tejidos u rganos de plantas en un medio asptico que le aporta los
nutrientes necesarios para su desarrollo. En este medio y con algunas condiciones
fsicas y qumicas apropiadas, las clulas tienen la habilidad de desarrollarse,
desdiferenciarse, producir metabolitos, multiplicarse y hasta regenerar un
organismo entero" (Dodds & Roberts, 1985), en cuyo caso, la nueva planta ser
genticamente idntica a la planta madre, y su desarrollo se dar en un periodo de
tiempo mucho mas corto. As pues, para lograr cualquiera de estos propsitos se
debe iniciar con la utilizacin de pequeas muestras de tejidos vegetales
(explante) que tras una adecuada desinfeccin superficial, son transferidos
aspticamente a medios nutritivos lquidos o semislidos y almacenados bajo
condiciones ideales de temperatura y fotoperodicidad que garanticen un rpido
desarrollo.
Los medios de cultivo, lquidos o semislidos, difieren bsicamente por la
presencia de un gelificante, contienen carbohidratos como fuente de carbono y
energa (generalmente sacarosa), sumado a minerales, vitaminas, aminocidos,
suplementos orgnicos y en muchos casos fitohormonas o compuestos sintticos
conocidos como reguladores de crecimiento, son mensajeros qumicos vegetales
secretados en un determinado tejido y que actan en el mismo tejido, o en otro
distinto de la planta y por ello, se les considera biocatalizadores junto con los
enzimas y las vitaminas. Las hormonas vegetales pertenecen a cinco grupos cada
uno de los cuales exhibe propiedades fuertes de regulacin del crecimiento en
plantas y pueden ser activos a muy bajas concentraciones dentro de la planta,
estos grupos son: Auxinas, Citoquininas, Giberelinas, Acido Abscsico y Etileno.
OBJETIVO GENERAL:
Esta prctica pretende que el estudiante conozca e implemente algunas tcnicas
bsicas del cultivo de tejidos vegetales.
OBJETIVOS ESPECFICOS:
Inducir desdiferenciacin tisular en explantos provenientes de diferentes tejidos
vegetales.
1. Revisar los cultivos de tejidos vegetales una vez por semana y anotar los
avances que estos presenten, incluyendo aparicin de callos, contaminaciones,
organognesis y aumento en longitud o tamao.
2. Realizar subcultivos rutinarios cada cuatro semanas y continuar la prctica
segn el desarrollo de cada uno de los grupos de trabajo
Tabla 1. COMPOSICIN Y PREPARACIN DEL MEDIO MURASHIGE Y SKOOG
(Medio MS) (MurashigeSkoog, 1962)
Concentracin de la
Volumen de la
Constituyente
solucin madre
solucin madre
(g/L)
por litro de medio
Macros
NH4NO3
16,5
KNO3
19
100 ml
CaCl2.2H2O
4,4
MgSO4.7H2O
3,7
KH2PO4
1,7
Micros
MnSO4.H2O
1,69
ZnSO4.7H2O
0,86
H3BO3
0,62
KI
0.083
Na2MoO4.2H20
0.025
10 ml
CuSO4.5H2O 10 ml de sol. 25
mg/100ml
CoCl2.6H2O 10 ml de sol. 25
mg/100ml
Fuente de hierro
FeSO4.7H2O
0.00556
10 ml
Na2EDTA.2H2O
0.00746
Vitaminas
Inositol
10
Nicotnico
0,05
HCl-Piridoxina
0,05
10 ml
Glicina
0,2
HCl-Tiamina
0,01
Adicionar al medio 3% de sacarosa y 0.7% de agar.
GLOSARIO
Prctica No. 2
CULTIVO DE LINFOCITOS Y OBTENCIN DE CROMOSOMAS
INTRODUCCIN
El cultivo de clulas animales permite la realizacin de diferentes actividades
docentes que tienen importancia en el mbito de la biotecnologa. Los diferentes
tipos celulares animales tienen dos opciones de crecimiento, en suspensin y
adheridas, el estudiante deber conocer los dos sistemas. Para ello deber
realizar cultivos a corto plazo mximo una semana y realizar dos experiencias, la
primera la obtencin de cromosomas y la segunda la criopreservacin.
OBJETIVO GENERAL
Dar al estudiante las bases del cultivo de clulas en suspensin (linfocitos) y de
clulas adheridas (lnea celular).
OBJETIVOS ESPECFICOS
Obtener cromosomas de un cultivo de linfocitos de sangre de diferentes
especies.de mamferos.
Cultivar clulas adheridas, para establecer cambios morfolgicos durante su
crecimiento.
Criopreservar clulas conservando las caractersticas morfolgicas iniciales
MATERIALES
Jeringa de 2,5cc, frasco de cultivo ( Boterito), pipeta de 5ml , pipeta de 1 ml,
incubadora a 37oC, tubos cnicos de centrfuga, centrfuga, pipetas pasteur,
lminas portaobjetos, lminas cubreobjetos, aceite de Inmersin, microscopio de
luz (100X), heparina, medio de cultivo RPMI, suero fetal bovino, extracto de frijol,
solucin hipotnica de KCL 0.075M, colchicina, metanol, cido actico, colorante
de Giemsa
PROCEDIMIENTO
La muestra que ser suministrada a los estudiantes, ser tomada en forma estril
de la vena yugular en una jeringa heparinizada (Liquemine, Roche). Estas
muestras han de ser identificadas.
La siembra debe hacerse en condiciones estriles y se sembrarn 10 gotas de
sangre en 5 ml de medio RPMI (Roswell Park memorial Institute) suplementado
con suero fetal bovino al 10% y 100ul de Fitohemaglutinina (50Ugrml). Se lleva el
cultivo a una incubadora de 37oC por 72 horas.
OBTENCIN DE CROMOSOMAS
Se adiciona al cultivo 0,1 ml de Colcemid (5ugr/ml)y se deja en incubacn por 30
minutos, luego se centrifugan 10 minutos a 1800 rpm. Se descarta el
Prctica No.3
CULTIVO Y CRIOPRESERVACIN DE CELULAS ANIMALES
INTRODUCCIN
Dentro del proceso de aprendizaje el estudiante conocer el comportamiento de
las clulas que crecen adheridas y sumado a esto realizara un ejercicio de cri
preservacin de las mismas.
Las clulas que crecen dependientes de anclaje son aquellas que necesitan un
soporte slido para su desarrollo in Vitro, usualmente son las clulas del cuerpo
que sirven de sostn, fibroblastos, tejido conectivo. Ellas crecen tomando formas
especificas que sirven para su identificacin y caracterizacin.
La cri preservacin naci hace aproximadamente 50 anos y puede definirse
como el procedimiento mediante el cual se conservan las clulas a temperaturas
inferiores 00C , esto se pudo dar gracias a dos desarrollos importantes, el primero
el descubrimiento de los crioprotectores y el desarrollo de sistemas de fri. Los
crioprotectores mas usados son el glicerol y el dimetil sulfoxido son molculas
pequeas, hasta 150 kd que entran a la clula desplazando el agua intracelular lo
que impide que a bajas temperaturas se formen cristales de hielo que rompen la
membrana. Posteriormente se realiza la curva de congelacin que en ocasiones
es muy rpida, caso fibroblastos o lenta caso espermatozoides.
Se pueden congelar cualquier tipo de clulas, pero lo ms importante es que al
descongelar se encuentre viabilidad y funcionalidad de las mismas, por eso
aunque se hable de congelacin es igual o ms importante la descongelacin,
esta se hace transfiriendo las clulas a 370C por 5 minutos.
Para que la preservacin de las clulas pueda hacerse por largo tiempo se
utilizan sistemas que producen o generan fri, en el primer caso la nevera de
hasta menos -800C, en el segundo gracias a someter a presin los gases estos se
licuan a temperaturas bajas, en el caso del nitrgeno -1960C y el helio -2100C.
Criopreservar es detener el tiempo, esto debe tenerse en cuenta, especialmente
cuando se congelan clulas germinales, espermatozoides y/o vulos, pues no se
puede asegurar que la respuesta de la informacin gentica a los efectos
medioambientales sea la misma que cuando fueron congeladas.
OBJETIVO GENERAL
Conocer el proceso de congelacin y descongelacin en un modelo de clulas
dependientes de anclaje.
OBJETIVOS ESPECFICOS
Conocer los cambios morfolgicos que ocurren en los cultivos de clulas
dependientes de anclaje.
Criopreservar clulas eucarioticas
Materiales
Clulas, pipetas de 5 ml, pipetas de 1ml, cajas de petri para cultivo, tubos cnicos
de centrfuga, crioviales, congelador de - 80 oC, microscopio, centrfuga, medio de
cultivo Ham F12, suero fetal bovino, solucin de Tripsina, glycerol o Dimetil
sulfxido, solucin Salina Bufferada
Procedimiento
Las clulas son recuperadas cuando la poblacin alcanza el mximo dentro del
frasco de cultivo, idealmente las culas se han de cosechar cuando estn en su
fase mayor de crecimiento (log phase). Las clulas se deben mantener a 37 oC,
con un ph entre 7.2 y 7.5, una osmolaridad de 220 mosm, alta humedad , con una
fase gaseosa en equilibrio (C02 con el bicarbonato del medio) y en lo posible
protegido de la luz.
CULTIVO Y CRIOPRESERVACION
A cada grupo se le entregara una suspensin de clulas, que deber lavar , contar
(al menos mirar la microscopio cuantas tiene por campo) y determinar su
viabilidad. Ellos sembraran en cajas de petri de 30 mm con medio RPMI
suplementado con suero al 10%, algn grupo puede usar otro medio como Hams
F12 o Dulbecco. All las dejarn observando los cambios morfolgicos hasta la
confluencia, una vez confluentes procedern a soltarlas y a criopreservarlas.
Tripsinizacin de clulas adherentes
Evalu la densidad celular de su cultivo (frasco, botella, etc), si tiene confluencia o
usted estima conveniente remover las clulas pase al paso No 2., remueva el
medio de cultivo (OPCIONAL: Lave una o dos veces con solucin salina bufferada
(PBS) su cultivo con el fin de remover las protenas, adicione 1 ml de Tripsina
0.25 % y djelo por 10 minutos a 37oC. A los 5 minutos observe si las clulas se
estn soltando. Cuando las clulas estn totalmente sueltas, adicione 5 ml de
medio sin suero fetal bovino, transfiera la suspensin celular a un tubo de ensayo
y centrifuge a 1800 rpm x 10 minutos.
Descarte el sobrenadante y resuspenda en 5 ml de medio con suero fetal bovino y
dependiendo de sus necesidades, determine la concentracin y la viabilidad
Ajuste con medio de cultivo de acuerdo con sus necesidades, si simplemente va a
duplicar un cultivo existente aada 10 ml de medio con suero y siembre de a 5 ml
en una cada frasco
Criopreservacin
7. Gngora, A, Villamil, L.C. Vera, V., Parra, JL., Ramrez, G., Lpez, G.
Aislamiento de un herpes virus bovino tipo-1 (HVB-1) de secrecin nasal y
esmegma prepucial en un toro reproductor. Revista de Medicina Veterinaria
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Revista de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Vol XLLL. No 1. Pp 29-45.
1994
Prctica No. 4
Produccin in vitro de embriones de ratn
INTRODUCCIN
Desde hace tiempo el hombre ha querido conocer los secretos ms ntimos de su
naturaleza, especialmente en lo relacionado con el desarrollo, esto es, el proceso
mediante el cual los gametos fusionados en el zigoto se convierten en un ser
humano. Para ello ha utilizado diferentes modelos algunos mas cercanos
evolutivamente que otros a si mismo. Se sabe mucho de la biologa del desarrollo
en especies como la Drosophila Melanogaster o el Xenopus laevis, estas especies
Prctica No. 5
ESTABILIZACIN DE LA MATERIA ORGNICA MEDIANTE
PROCESOS BIOXIDATIVOS AEROBIOS (COMPOSTAJE)
INTRODUCCION
La tierra se considera como un sistema termodinmico cerrado. En consecuencia,
la nica posibilidad de generacin de nueva biomasa es el reciclaje de la materia.
Los denominados biosistemas han evolucionado en consecuencia con esta
condicin termodinmica hasta generar una clasificacin, basada en la
transformacin de la materia, que determina la configuracin de tres tipos de
organismos: Productores, consumidores y descomponedores. Se denomina como
productores a los biosistemas que estn en capacidad de biotransformar la
energa lumnica procedente del sol en energa qumica almacenada en forma de
molculas reducidas. El segundo tipo de biosistemas que se denominan
consumidores se caracterizan por ser intermediarios de la energa qumica.
Finalmente, se denominan descomponedores a los organismos especializados
generar energa qumica a expensas de la biooxidacin de la biomasa generada
en los otros dos tipos de biosistemas.
Con la consolidacin del urbanismo en el siglo XX se estableci una doble
problemtica: En primera el deterioro paulatino de los suelos con vocacin
agrcola y en segunda instancia la contaminacin ambiental por acumulacin de
materia orgnica. Ante esta doble problemtica, se vienen buscando alternativas
cientficas y tecnolgicas que puedan dar respuesta en ambos sentidos: En el
sentido agronmico buscar formular sustratos que permitan recuperar la fraccin
orgnica del suelo y, en el sentido ambiental al minimizar el impacto de la
acumulacin de materia orgnica.
El compostaje se considera hoy como una de las alternativas ms plausibles a la
condicin anotada. El compostaje se puede entender como el proceso acelerado
e irreversible de la degradacin biooxidativa y catablica seguida de un proceso
de resntesis de un substrato orgnico slido, a travs de organismos
descomponedores endmicos (normalmente artrpodos y microorganismos), endo
y exoenzimas presentes en el medio, que actan sobre la matriz orgnica hasta la
obtencin de un producto heterogneo denominado compost, con apariencia
Sistema de
biofiltros
Termmetro
aire
METODOS
Definicin de materias primas. En funcin del origen, la humedad y la relacin
carbono/nitrgeno se estima la mezcla ms adecuada para iniciar el proceso.
Estudio cintico. Una vez definidas la mezcla inicial, con intervalos de dos
semanas, obtener una muestra para la realizacin de un estudio cintico. Para el
caso presente se realizar el estudio por 60 das.
Determinacin de punto final del proceso y calidad del producto final.
Carbono orgnico
Para determinar la cantidad de carbono orgnico, las molculas orgnicas deben
romperse en unidades de carbono simples y ser convertidas en una forma
molecular sencilla que pueda medirse de forma cuantitativa. Se sigue el protocolo
descrito a continuacin.
Transferir a un Matraz de Erlenmeyer 1.0 g (0.5 g o menos s es alto en materia orgnica el
material debe pasar una malla N 80)
Cenizas
Es un parmetro til en definiciones cinticas (dado que debe aumentar en funcin
del tiempo) e igualmente necesario para el reconocimiento de la calidad del
producto final. Debe tenerse en cuenta que realmente se determina tanto
contenido de cenizas como el carbono orgnico fijo.
Materiales y procedimiento
Crisol de porcelana, horno mufla, desecador y balanza analtica con sensibilidad
de 0.001 g. Para iniciar, se pesan 2 g de la muestra en un crisol de porcelana,
previamente tarado a la temperatura de trabajo, se lleva la muestra a un horno
mufla precalentado a 250 C y se calienta gradualmente, hasta alcanzar una
temperatura de 550 C. Se calcina la muestra durante cuatro horas, se enfra en
un desecador y se pesa.
CLCULOS
El contenido de cenizas, expresado como porcentaje, se calcula aplicando la
siguiente ecuacin:
% de Cenizas = (B - C)/(A - C) x 100
Donde: A: Peso de la cpsula ms muestra en gramos, B: Peso de la cpsula ms cenizas en gramos y C:
Peso de la cpsula vaca en gramos
Nitrgeno
Dado que es un macronutriente, es trascendental definir las cantidades presentes.
El nitrgeno calculado corresponde a nitrgeno total y el procedimiento empleado
para la determinacin de nitrgeno total es el mtodo de Kjeldhal, que consiste en
convertir el nitrgeno presente en sulfato de amonio por digestin con cido
sulfrico concentrado en presencia de un catalizador. El amonio formado se libera
por adicin de NaOH en exceso, luego se destila sobre una disolucin de H2SO4
HCl y se titula el exceso de cido con disolucin valorada de NaOH o KOH.
Reactivos:
Catalizador: Pesar 100 g de sulfato de potasio (K2SO4) y mezclarlos con 1.6 g de
sulfato de cobre (CuSO4)
NaOH al 50 %: Pesar 50 g de hidrxido de sodio en escamas y adicionar 50 mL de
agua destilada, Acido clorhdrico 0.1 N, Acido Sulfrico concentrado (98%) e
Indicador Tashiro
0.4 g
Baln Kjeldhal
Adicionar
10.0 mL de H2SO4
Concentrado
Adicionar
4.0 g de
catalizador
Digestin
Aprox. 1 hora
Adicionar
Reposo
Traspasar
Adicionar
Hasta temperatura
ambiente
Baln destilacin
realizando lavados
40.0 mL de NaOH al 50 %
Destilar
Recibir
Titular
PROCEDIMIENTO
Se toma un baln volumtrico de 2 mL , se tara en la balanza analtica, se deja
caer libremente la muestra (seca y cernida) hasta completar el volumen del
recipiente y se registra el peso.
RESULTADOS
La densidad aparente expresado como gramos/mililitros de muestra se calcula
aplicando la siguiente ecuacin:
D = W (g)
V
Donde:
Prctica No.6
OBTENCIN DE BIONSECTICIDAS
INTRODUCCIN
La actividad insecticida de contacto se basa en la determinacin de un modelo
estadstico matricial que considera el efecto (actividad biocida) como la variable
dependiente, en funcin de la concentracin (o dosis) y el tiempo de contacto
como las variables independientes. Para un modelo de regresin mltiple, la Dosis
Letal Media (DL50) (o Concentracin Letal Media, CL50) y el Tiempo Letal Medio
(TL50), se obtienen mediante dos anlisis: En el primero se hace constante el
tiempo y se genera la DL50. En el segundo la dosis se hace constante y se genera
el TL50.
Para cada evaluacin se realizan dos tipos de ensayos. Un exploratorio y uno
definitivo. En el ensayo exploratorio se utilizan al menos cinco concentraciones
diferentes del extracto, calculadas as: la recomendada por el fabricante como una
concentracin intermedia y a partir de ella se seleccionan dos concentraciones
superiores y dos inferiores, separadas entre si por un factor de 10. Con base en
los resultados, se calculan las nuevas concentraciones del extracto para los
ensayos definitivos, as: Para el nuevo intervalo de concentraciones, se toma
como valor mnimo la mxima concentracin donde no se observaron efectos y
como valor mximo, la mnima concentracin donde se observ el mximo efecto.
Entre estos dos valores extremos, se calculan al menos otras cuatro
C1
C2
C3
C4
C5
C6
MODELO
Valor p
CL50
Prctica No. 7
PRODUCCIN DE JARABES A PARTIR DE ALMIDN DE YUCA
En este informe se presentan los resultados obtenidos en la experimentacin de
cada una de las etapas, a saber: licuefaccin, sacarificacin e isomerizacin.
Tambin se presentan los resultados obtenidos en la puesta en marcha del
proceso de sacarificacin en continuo, as como, las posibles estrategias de
escalamiento, dado el caso de querer llevar los resultados a nivel piloto. Despus
se presenta la evaluacin de la economa del proceso en la que se determin a
partir de que volumen y en que tiempo se puede recuperar la inversin. Este
costeo se realiz utilizando el SuperPro Designer Versin 4.1.
Para la etapa de licuefaccin, se diseo y se construy un reactor por lotes en
acero inoxidable, con agitacin y control de temperatura de 10L. Se concluy que
la mejor conversin de almidn de yuca se obtiene al trabajar con una
concentracin de almidn del 40%; con una concentracin de enzima
(Termamyl 120L) de 1,33 mL/L; a las condiciones de: pH = 5,5, temperatura =
85C y agitacin = 200 rpm. En estas condiciones, al cabo de dos horas, se logra
una conversin del 50% (DE) trabajando en un reactor en acero inoxidable
enchaquetado y con un volumen efectivo de trabajo de 8L.
Las mejores condiciones operacionales para el proceso de sacarificacin por lotes
fueron: pH 4.5, temperatura 55C y tiempo de reaccin 6 horas, utilizando una
concentracin de enzima (AMG 300L) de 1 ml/L de sustrato, en estas
condiciones se obtiene una conversin del 98% de DE. Este proceso se trabaj
tambin en continuo, con un volumen de 3 L, y empleando una membrana de
Ultrafiltracin para recuperar la enzima. En este se logr un flujo de 20 ml/min. y
un tiempo de residencia de 2.2 h durante 6h. Se trabajo con una concentracin de
1.5 ml de enzima/L de sustrato Las conversiones alcanzadas en estas
condiciones fueron de solo el 75% DE.
METODOLOGA:
LICUEFACCIN:
Medicin colorimtrica de azcares reductores
Equivalente de dextrosa: Para la caracterizacin de los productos de la hidrlisis
del almidn se emplea el parmetro que mide el grado de hidrlisis: Equivalente
de dextrosa (DE) que se define como unidades de glucosa pura requeridas para
reducir la misma cantidad de reactivo cido dinitrosalicilico (DNS) que 100
unidades de masa de hidrolizado seco (Miller G.L, 1959).
Practica N. 8
FERMENTACIN ALCOHLICA CON LEVADURAS
INTRODUCCIN
La Fermentacin alcohlica de define como el proceso bioqumico por el cual las
levaduras transforman los azcares del mosto en Etanol y CO2. Para que la
fermentacin se realice de manera eficiente, el mosto ha de hallarse en
condiciones anaerobias. En condiciones aerobias las levaduras se multiplican
abundantemente con un rendimiento en biomasa muy alto ya que se consiguen
1g de levadura por cada 4g de azcar consumidos los productos obtenidos son
muy poco etanol, agua y CO2.
En condiciones anaerobias las levaduras realizan la fermentacin; es decir
degradan los azcares de forma incompleta generando Etanol, CO2 y energa.
En estas condiciones el rendimiento en biomasa es de tan solo 1g de levadura por
cada 100g de azcares consumidos.
Tanto levaduras como bacterias han sido utilizadas para la produccin de etanol.
Saccharomyces cerevisiae es la levadura ms comnmente utilizada. El Etanol
es inhibitorio a altas concentraciones y la tolerancia al alcohol de las levaduras es
crtica para obtener rendimientos altos.
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA FERMENTACIN ALCOHLICA
Existen factores tanto fsicos como qumicos que inciden positiva o negativamente
en el transcurso de la fermentacin alcohlica, ya sea actuando sobre el
desarrollo de las levaduras o incidiendo directamente sobre la propia
fermentacin. Los ms relevantes son los siguientes:
TEMPERATURA: A mayor temperatura la fermentacin transcurre mas
rpidamente, sin embargo es menos pura, es decir, se produce menos etanol y
mas cantidad de compuestos secundarios.
Las levaduras a 30C tienen su temperatura ptima de desarrollo. Por encima de
35C la actividad disminuye rpidamente y mueren a antes de 45C.
OXIGENO: Aunque la fermentacin es un proceso anaerbico, las levaduras
mantienen una leve respiracin utilizando para ello el oxigeno disuelto en el
mosto.
NUTRIENTES: Los azcares son fuente de energa para las levaduras.
OBJETIVO
Obtener un metabolito primario (alcohol) a partir de una fermentacin realizada
por la levadura de Saccharomyces cerevisiae .
MATERIALES Y EQUIPOS
Azcar, miel o panela, Levadura, Recipiente de vidrio, Manguera y tapn,
Licuadora, Colador, Antiespumante, Alcoholmetro, Agitador mecnico
pHmetro, Equipo de destilacin, Probeta, Esptulas, Balones de 4-6 L,
Refractmetro, Perlas de ebullicin
REACTIVOS
KMNO4, Bisulfito de Sodio, cido Cromotrpico, H2SO4
DATOS Y OBSERVACIONES
Consideraciones a tener en cuenta en la elaboracin del fermento:
Tabla 1: Cantidad de azcar del mosto para corregir los Brix
MATERIALES
QUE CONTIENEN
AZCAR
Azcar Blanca
Azcar Morena
Miel
Glucosa
CANTIDAD
(g)
AGUA (ml)
BRIX
10
10
10
10
100
100
100
100
1
1
0,6
1
NOTA:
No es recomendable utilizar para la prctica frutas tales como: Mango,
Papaya, Guanbana y Guayaba; ya que estas tienen mucho muclago y son
muy espesantes al trabajar con ellas, complicando la fermentacin
Se sugiere utilizar frutas tales como: Mora, Uva, Lulo, Maracay, Naranja.
%AZCAR
(g/1000ml)
25.4
10.1
23.4
20.8
16.6
13.0
6.3
18.2
12.0
11.9
11.6
6.9
11.9
6.8
13.0
9.6
14.9
6.0
8.6
5.8
7.2
5.7
12.4
10.1
15.0
14.8
13.6
14.5
5.6
10.4
8.5
13.0
61.3
7.0
9.2
19.6
14.0
15
9.6
17
17
75.0
12.4
AZCAR
(gramos/litro)
254
101
234
208
166
130
63
182
120
119
116
69
119
68
130
96
149
60
86
58
72
57
124
101
150
148
136
145
56
104
85
130
613
70
92
196
140
150
96
170
170
750
124
Brix
Alcohol 8%
Alcohol 10%
Alcohol 12%
1.0000
1.0050
1.0070
1.0100
1.0110
1.0150
1.0196
1.0200
1.0250
1.0300
1.0350
1.0399
1.0441
1.0483
1.0500
1.0525
1.0550
1.0567
1.0610
1.0653
1.0696
1.0740
1.0784
1.0828
1.0873
1.0918
1.0963
1.1009
0.0
1.5
2.0
2.7
3.0
4.0
5.0
5.2
6.4
7.6
8.8
10
11.0
12.0
12.4
13.0
13.5
14.0
15.0
16.0
17.0
18.0
19.0
20.0
21.0
22.0
23.0
24.0
144.0
129.0
124.1
116.7
114.2
104.4
94.0
92.1
80.0
67.9
55.9
44.0
34.0
24.0
20.3
14.0
8.6
4.0
0.0
180.0
165.0
160.1
152.7
150.2
140.4
130.0
128.1
116.0
103.9
91.9
80.0
70.0
60.0
56.3
50.0
44.6
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
216.0
201.0
196.1
188.7
186.2
176.4
166.0
164.1
152.0
139.9
127.9
116.0
106.0
96.0
92.3
86.0
80.6
76.0
66.0
56.0
46.0
36.0
26.0
16.0
6.0
0.0
Alcohol
14%
252.0
237.0
232.1
224.7
222.2
212.4
202.0
200.1
188.0
175.9
163.9
152.0
142.0
132.0
128.3
122.0
116.6
112.0
102.0
92.0
82.0
72.0
62.0
52.0
42.0
32.0
22.0
12.0
PROCEDIMIENTO
Se debe repicar la cepa de levadura para obtener un cultivo fresco, esto se realiza
preparando algunas cajas con agar Sabouraud 4 % de glucosa y sembrando el
ellas el microorganismo. Se deben incubar las cajas a 38 C durante 4 das.
Activacin de la levadura: Como el microorganismo se conserva en caja, para
transferirlo al medio de cultivo de produccin del etanol; es necesario activarlo,
para esto se utilizan tubos de ensayo tapa rosca con un volumen de 10 mL del
medio de cultivo para activacin. NOTA: La fuente de carbono utilizada es
sacarosa. Se toman colonias definidas y aisladas de una caja petri y se lleva a los
diferentes tubos con medio previamente preparados y esterilizados,
posteriormente se incuban a 38 C y 150 rpm durante 4 das. Pasado este
tiempo, se selecciona uno de los tubos dependiendo de la cantidad de biomasa
que presente y este se escala a un volumen final de 100 mL del mismo medio de
cultivo utilizado para la activacin de la cepa. Pasadas 24 horas, los 100 mL son
escalados nuevamente a un volumen de 250 mL del mismo medio de cultivo.
Finalmente se escala a 2 L. NOTA: Todos los volmenes escalados se incuban a
38 C y 150 rpm. Despus de 2 das se presentan un crecimiento representativo
de clulas que servirn como inculo. Se deshecha alrededor de 1 L de
sobrenadante, y el medio con clulas restante se divide en dos partes
aproximadamente iguales, 50 mL sern utilizados como inculo para el proceso
en batch y el resto para el proceso en continuo con clulas inmovilizadas.
Se preparan 2.5 L del medio de cultivo pero esta vez el sustrato ser jarabe
glucosado. Para preparar este medio es necesario conocer la concentracin de
azcares en el jarabe, puede utilizarse el mtodo de DNS o Antrona y
posteriormente hacer la dilucin correspondiente para que el jarabe quede a una
concentracin de 100.0 g/L.
FERMENTACIN EN BATCH
Para esta fermentacin se preparan 450 mL de medio de cultivo con jarabe
glucosado a este medio se le agregan los 50 mL del medio separado como
inculo para este proceso y se incuba durante 12 horas a 35 C y 150 rpm;
DETERMINACIN DE METANOL
Prueba cualitativa
Diluir la muestra a una concentracin alcohlica entre 5 y 6% (G.L), tomar 50 ml
de la muestra diluida y destilar recolectando 40 ml en el mismo baln donde se
midi la muestra (baln de 50 ml). Ajustar a volumen con agua destilada.
Adicionar 1 ml de solucin de KMNO4 a un erlenmeyer y enfriar en bao de hielo
por 15 minutos, agregar 0,5 ml del destilado. (Mantener en bao de hielo por 30
minutos), decolorar la solucin con una pequea cantidad de NaHSO3 (Bisulfito
de Sodio) seco (+/- 100 mg), aadir 0,5 ml de cido Cromotrpico y adicionar
lentamente y con agitacin 7,5 ml de H2SO4 concentrado. Posteriormente se
pone el erlenmeyer en un bao mara a 60C., durante 15 minutos (para
desarrollar color).
La aparicin de un color que va del violeta al morado intenso indica la presencia
de metanol.
Prueba cuantitativa
Muestra
Proceder igual que la prueba cualitativa, pero dejar enfriar despus del bao
mara. Llevar a volumen con etanol al 5.5 %, agitar y mantener siempre a
temperatura ambiente. Leer absorbancia a 575 nm.
Blanco
Tomar 1 ml de alcohol al 5.5 % llevarlo a un baln volumtrico de 50ml que
contiene 1 ml de KMnO4, colocar en bao de hielo y tratar igual que la muestra.
Solucin estndar de metanol
Medir exactamente 1 ml de metanol y llevar a un baln volumtrico de 100 ml,
ajustar volumen con alcohol al 5.5 % de concentracin = 1 % de metanol. Tomar
2.5 ml de la solucin anterior y llevar a un volumtrico de 100 ml, ajustar volumen
con alcohol al 5.5 % de concentracin = 0.025 % de metanol. Tomar 1 ml de esta
ltima solucin y llevar a un volumtrico de 50 ml que contiene 1 ml de KMnO4 y
tratar en igual forma que la muestra y el blanco.
Leer la absorbancia del estndar.
Determinar la cantidad de metanol en la muestra como sigue:
% v/v metanol = A X 0.025 X F
A*
Donde:
A: absorbancia de la muestra
A*: absorbancia del estndar de metanol
F: factor de dilucin de la muestra.
Preparacin de:
Alcohol del 5.5 %: A partir de etanol absoluto. Tomar 55.5 ml de etanol absoluto
y ajustar a 1 L con agua destilada.
GLOSARIO
GRADOS BRIX: Es el porcentaje de slidos solubles presentes en el jugo o
material fermentecible, los cuales relacionan la gravedad especfica de la solucin
con la concentracin equivalente de sacarosa pura.
PH: Medida de grado de acidez o basicidad de una solucin.
FERMENTACIN: Consiste en el que el azcar contenido en el mosto, su
mayor parte desaparece, ocupando su lugar el alcohol.
GRADO ALCOHOLIMTRICO: Porcentaje de alcohol etlico a 20C.
BILBLIOGRAFA
POTTER, Norman N. La ciencia de los alimentos. Ed. Harla, Mxico. (1978). Pg.
359-376.
JAGNOW, G. Y David W.Bioctenologa: induccin con experimentos modelos. Ed.
Acribia, Zaragoza-Espaa (1991).
RAMIREZ L., Gladys. Manual de laboratorio de Bromatologa. Medelln, Enero de
1999.
Prctica No. 9
CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO y OBTENCIN DE
PROTEASAS
INTRODUCCIN
El incremento poblacional que resulta de la multiplicacin celular, es un
componente esencial de la funcin microbiana, y con l se asocian, tanto el
crecimiento, como la generacin metablica; de hecho, las bacterias son
mquinas de duplicacin constante en las que se incluyen reacciones cuya
finalidad es la formacin de las macromolculas necesarias para el ensamblaje de
las nuevas estructuras celulares de sus descendientes. Como en la mayora de
los procariotes, el desarrollo de una clula individual es continuo hasta la divisin
en dos clulas nuevas (fisin binaria), el conocimiento de las caractersticas de
crecimiento de un microorganismo es muy importante, pues con ello se pueden
reproducir los procesos industriales y aumentar los rendimientos propios de los
procesos generadores de metabolitos.
Horas de cultivo
Prctica No. 10
OBTENCIN DE CIDO CTRICO CON HONGOS
INTRODUCCION:
El cido ctrico se obtiene por extraccin natural de los jugos de frutas ctricas o
artificialmente por la transformacin del azcar realizada con algunos
microorganismos entre los que se destacan ciertas especies de hongos
correspondientes al gnero Aspergillus. Estos trabajos de produccin metablica
con hongos se iniciaron en la dcada de los aos veinte con crecimientos
miceliares en superficie, continuaron algunos aos mas tarde con procesos
sumergidos en cubas profundas y actualmente se llevan a cabo tanto en
superficie como en fermentadores de hasta 220 metros cbicos de volumen. Lo
realmente valioso de este tipo de produccin biotecnolgica es que ha alcanzado
niveles muy importantes, pues por esta va microbiolgica se obtiene ms del
99% de la produccin mundial de este cido orgnico que comercializado como
monohidratado o como anhidro, es utilizado fundamentalmente en las industrias
de alimentos y bebidas en las que aumenta o preserva el sabor de los jugos, de
los extractos de jugo de fruta, de los caramelos, de los helados y de las
mermeladas. En la industria farmacutica (10% de la utilizacin total) se utiliza el
citrato de hierro y el cido ctrico como preservante de sangre, o, en la
elaboracin de tabletas, pomadas y en algunas preparaciones cosmticas. En la
industria qumica (25% del uso total) el cido ctrico se utiliza como reemplazo de
polifosfatos, como agente antiespumante, como reblandecedor y para el
tratamiento de textiles, mientras que en la industria metalrgica los metales puros
se producen como citratos metlicos.
OBJETIVO GENERAL.
Obtener cido ctrico por cultivo de esporas de Aspergillus niger en medio de
cultivo enriquecido con sales apropiadas para la generacin y crecimiento de la
biomasa.
MATERIALES Y REACTIVOS:
Aspergillus niger, jeringa desechable de 5 ml, agua estril para inyeccin, gasa,
asa metlica, papel indicador del pH (1-7), embudo de vidrio con filtro redondo,
mechero, erlenmeyer de 500ml y agitador orbital
Procedimiento:
Inicialmente y con ayuda de asa bacteriolgica, se siembra Aspergillus niger en
un tubo de ensayo que contenga agar sabouraud previamente esterilizado con
calor hmero (15 psi/ 121 C/ 20 minutos), y se deja crecer durante
aproximadamente 10 das a temperatura ambiente. Paralelamente y esterilizado
bajo las mismas condiciones, se preparar un medio de cultivo lquido que por su
composicin permita el crecimiento miceliar. Para lograr esto se utiliza un
erlenmeyer de 500 mililitros en el que se prepara un volumen final de 100 mililitros
(pH: 2) que incluye: sacarosa: 19.0g, nitrato amnico: 230 mg, dihidrogenofosfato
potsico: 100 mg, y sulfato magnsico: 0.03g
En la fermentacin ctrica la conversin del azcar es efectuada dentro de las
clulas vivas de los hongos, para lograr esto, el sustrato debe ingresar por
smosis y por lo tanto, en un recipiente profundo y de gran capacidad la
formacin de cido ser relativamente lenta, puesto que la superficie de la capa
de hongos ser pequea en comparacin con el volumen inversamente en el
empleo de recipientes de forma plana se consigue una gran superficie de micelio
y la conversin de azcar a cido ctrico se efecta con gran rapidez. Para faciltar
esto y una vez esporulado el microorganismo en el medio de cultivo inicial (agar
sabouraud), a este se le agregan 5ml de agua estril, se agita suavemente para
desprender las esporas (se ven a simple vista) y estas se transfieren al
erlenmeyer donde se encuentra el medio de cultivo. Finalmente se tapa el
erlenmeyer con algodn y se transfiere al agitador orbital (shaker, 150 r.p.m.) por
espacio de 14 a 20 das en los que se controla peridicamente el pH para facilitar
la obtencin del metabolito. Una vez terminado el proceso, el medio de cultivo
(microroganismo incluido), se macera y filtra, resultando un licuado cuyo pH se
debe neutralizar con hidrxido de calcio. Una vez neutralizado, se calienta y se
aade un exceso del hidrxido, con el que probablemente se obtiene un
precipitado insoluble correspondiente al citrato de calcio. Tratando esta sal con
cantidades equivalentes de cido sulfrico diluido y filtrando, se obtiene un
precipitado de sulfato de calcio insoluble (sulfato de calcio) y un sobrenadante en
el que se precipitan algunos cristales que una vez lavados en fro (agua de hielo),
permiten realizar las pruebas cuali- cuantitativas necesarias para demostrar la
existencia del cido ctrico.
Identificacin cualitativa de citratos: a 15 mililitros de pyridina, se deben
agregar unos pocos miligramos de un citrato disuelto o suspendido en 1 mililitro
de agua. Una vez agregado, se adicionan 5 mililitros de anhidrido acetico y se
mezcla esperando que aparezca un color rojo propio de la presencia del citrato.
Para un ensayo cuantitativo, se debe consultar alguna farmacopea en la que se
encuentren tcnicas especficas de anlisis para este metabolito.
GLOSARIO
Cepa: Conjunto de clulas o cultivos con un origen comn y que poseen una
dotacin gentica similar; cultivo puro de organismos, compuesto por la
descendencia de un nico individuo.
Inculo: Cultivo iniciador de un organismo, o una mezcla de organismos, aadido
a un medio para iniciar la produccin de un nmero mayor.
Micelio: Parte vegetativa de un hongo filamentosos. Consta de una masa de
hifas.
Hifa: Filamento tubular que constituye la fase vegetativa de la mayora de los
hongos y muchas algas.
Prctica No. 11
OBTENCIN DE PENICILINA Y COMPROBACIN DE SU ACCIN
ANTIBITICA
Antibiticos
Las sustancias medicinales seguras tienen el poder para destruir a verificar el
crecimiento de organismos infecciosos en el cuerpo. Los organismos pueden ser
bacterias, virus, hongos, o los animales minsculos llamados protozoa. Un grupo
particular de estos agentes se constituye de drogas llamadas antibiticos, desde
el griego anti ("contra") y bios ("vida"). Algunos antibiticos se producen desde
organismos vivientes tales como bacterias, hongos y moldes. Los otros son
totalmente o en parte sintticos que es, producido artificialmente. La penicilina es
quizs el mejor antibitico conocido. Su descubrimiento y luego desarrolla ha
permitido a la profesin mdica tratar efectivamente muchas enfermedades
infecciosas, incluyendo algunas que alguna vez amenazaron la vida.
FABRICACIN
El natural; hace tiempo todos los antibiticos se hicieron desde organismos vivos.
Este proceso conocido como biosntesis, se usa todava en la fabricacin de
algunos antibiticos. Realmente los organismos fabrican el antibitico. La gente
involucrada solo provee las condiciones favorables para que los organismos
puedan hacer el trabajo y entonces ellos extraen la droga.
Sinttico; Todos los tipos de penicilina poseen un ncleo qumico idntico llamado
anillo. La cadena qumica que es adjunta al anillo es diferente en cada tipo.
Cambiando las molculas de la cadena, los cientficos idean drogas con efectos
potencialmente diferentes sobre organismos diferentes. Algunas de estas drogas
son tiles para tratar infecciones, algunas no lo son.
Obtencin y separacin de antibiticos
Como se hallan y aslan los microorganismos productores de los
antibiticos
Prctica No. 11
TRANSFORMACION BACTERIANA
INTRODUCCION
La transformacin se puede definir como la variacin hereditaria de una clula
bacteriana susceptible, originada por la captacin de ADN desnudo libre en el
medio. Tras la transformacin, la clula que ha recibido el ADN se suele
denominar transformante.
En los ltimos aos se ha logrado desarrollar sistemas artificiales para producir
"clulas competentes" en algunas de ellas (como Escherichia coli, Salmonella
typhimurium y algunas especies de Pseudomonas), lo cual ha hecho avanzar los
estudios genticos, especialmente mediante manipulaciones in vitro: por ejemplo,
la transformacin artificial de E. coli con ADN plasmdico es una de los mtodos
bsicos de la Ingeniera Gentica.
La obtencin de clulas competentes en E. coli consiste en ir concentrando un
cultivo recogido en fase logartmica, mediante lavados sucesivos en una solucin
fra (4C) de Cl2Ca, tras lo cual la mezcla de clulas y ADN se someten a unos 2
min. a 42C (choque por calor). Este tratamiento altera las envueltas (sobre todo
la membrana externa) y aumenta su permeabilidad al ADN. Los plsmidos entran
a la clula como molculas de cadena doble intactas, mientras que los ADN
lineales, que entran de la misma forma, son degradados por nucleasas
citoplsmicas (RecBCD). Los transformantes se suelen seleccionar en base a la
resistencia a algn o algunos antibiticos conferidos por los plsmidos artificiales
usados en Ingeniera Gentica.
OBJETIVOS
Producir clulas bacterias competentes para transformacin
Transformar clulas de Escherichia coli con plasmidos que portan genes de
resistencia a antibiticos
A.- Preparacin de clulas competentes.
1.- Tome con un palillo o punta de micro pipeta una sola colonia bacteriana e
inoclela en un Erlenmeyer de 250 ml que contenga 30 ml de medio de cultivo
SOB.
2.- Incube toda la noche a 37C con agitacin moderada (150 o 200 rpm)
3.- Tome un mililitro de cultivo bacteriano que usted ha crecido toda la noche e
inoclelo en un Erlenmeyer de 500ml que contenga 50ml de medio de cultivo
SOB. Incube a 37C a 250 rpm, hasta que la densidad ptica a 550 sea de
aproximadamente 0.3.
4.- Colecte el cultivo bacteriano en dos tubos estriles de polipropileno de 50 ml y
enfri en hielo por 15 minutos.
5.- Precipite las bacterias mediante centrifugacin a 3000 X g (5000rpn utilizando
un rotor Sorval SS-34) por 15 minutos a 4C. Elimine el sobre nadante con
cuidado de no eliminar el precipitado bacteriano.
6.- Adicione 8 ml de tampn de transformacin 1 (16 ml por 50 ml de cultivo
inicial). Resuspenda el precipitado con agitacin suave, puede utilizar un vortex.
7.- Incube los tubos en hielo por 15 minutos.
8.- Precipite las bacterias como se describi en el paso 5.
9.- Resuspenda el precipitado bacteriano en 2 ml de tampn de transformacin 2.
Almacene a 4C no mas de 4 o 5 horas antes de ser utilizadas.
10.- Las clulas competentes pueden ser almacenadas a -70C hasta por dos
meses. Para congelar las clulas siga el siguiente procedimiento:
Adicione 70 ul de Dimetil sulfoxido (DMSO) por cada 2ml de clulas competentes.
Mezcle suavemente y almacene la suspensin en hielo por 15 minutos.
Adicione otros 70 ul de DMSO, agite suavemente y regrese la suspensin a un
bao de hielo.
Dispense 100 ul de suspensin de clulas competentes a tubos eppendorf ,
sumerja los tubos eppendorf con las clulas en nitrgeno lquido e
inmediatamente almacene en una nevera de -70C hasta que las necesite.
B.- Transformacin
1.- Si las clulas han sido congeladas, desconglelas en hielo.
2.- Adicione aproximadamente 20 ul de DNA plasmidico a la fraccin de clulas
competentes y mezcle suavemente con una micropipeta.
3.- Incube las clulas en hielo por 40 minutos.
4.- Someta las clulas a choque trmico, introducindolas en un bao mara que
este a 42C por 45 segundos. No agite las clulas.
5.- Adicione 1 ml de medio de cultivo SOB (sin antibitico) a cada tubo con las
bacterias transformadas e incube a 37C con agitacin suave por 45 o 60
minutos.
6.- Sirva entre 100 a 200 ul de las bacterias transformadas del paso anterior sobre
cajas de petri con LB-agar suplementado con antibitico (cuyo gen de resistencia
se encuentra presente solo en el DNA del plasmado). Incube los transformantes
toda la noche a 37C y evalu el crecimiento bacteriano.
C. Medios de cultivo y tampones.
Medio de cultivo SOB (1 litro)
Bacto triptona
Extracto de levadura
NaCl
KCl
MgCl2
MgSO4
20.0 g
5.0 g
0.6 g
0.5 g
10 mM (Vea mas abajo)
10 mM (Vea mas abajo)
10.0 g
5.0 g
10.0 g
Agite hasta que los solutos se hayan disuelto completamente. Ajuste a pH 7.0
con NaOH 5N. Adicione 15 g de bacto agar lleve a 1 litro y autoclave.
Tampn de Transformacin 1 (500 ml)
RbCl
MnCl24H2O
Acetato de potasio
CaCl22H2O*
Glicerol
6.0 g
5.0 g
15.0 ml (1 M stock, pH 7.5)
0.75 g
75.0 ml
Combine los reactivos en dH2O. Ajuste a pH 5.8 con 0.2 M de cido actico.
Lleve a un volumen final de 500ml con dH2O. Esterilice mediante filtracin con
una membrana 0.22 m. Almacene a 4C.
Tampn de Transformacin 2 (500 ml)
MOPS
RbCl
CaCl22H2O*
Glicerol
dH2O
5.5 g
75.0 ml
500.0 ml
Combine los reactivos en dH2O. Lleve a un volumen final de 500ml con dH2O.
Esterilice por filtracin utilizando una membrana de 0.22 m. Almacene a 4C.
* Si utiliza CaCl2 anhidro, utilice 0.57 g para el Tampn 1, y 4.15 g para el
Tampn 2.
Stock 2 M Mg2+ (100 ml)
MgCl2
MgSO4
20.3 g
24.7 g
Prctica No. 12
EXTRACCIN DE ADN (cido desoxirribonucleico)
INTRODUCCIN
La extraccin de ADN tiene como objetivo principal obtener la mayor cantidad
posible del ADN de alto peso molecular, libre de protenas, carbohidratos y
otros inhibidores de enzimas.
Diferentes mtodos de extraccin han sido descritos para el aislamiento de
cidos nucleicos, aqu se trabajara especficamente con la extraccin de AND
vegetal, la presencia de algunos metabolitos secundarios y como interfieren
estos en el aislamiento del ADN.
En plantas y hongos la pared celular es la primera barreras para la extraccin,
es necesario degradarla empleando mtodos fsicos o qumicos. Los mtodos
fsicos son los ms empleados, especialmente la congelacin y la maceracin.
Para bacterias y clulas desprovistas de pared, se emplean soluciones ricas
en detergentes o enzimas, para destruir las membranas celulares.
Una vez se ha destruido la membrana celular debe emplearse detergentes y
soluciones de alta (o baja) fuerza inica para permitir que el ADN se libere en
el buffer.
La inhibicin de nucleasas es un factor critico, esta se alcanza empleando
buffer1 con pHs poco ptimos para accin de estas enzimas y adicionando
agentes quelantes de iones como el EDTA (Ethylen diamin tetre acetato).
Posteriormente se utilizan sustancias que desnaturalicen y separen las
protenas del ADN como fenol y cloroformo. Finalmente en ADN es
precipitado con alcohol y centrifugacin. El ADN libre de protenas y otros
compuestos celulares se disuelve en un buffer2 .
Algunos tejidos pueden poseer altas concentraciones de polisacridos, para
separarlos de los cidos nucleicos se puede emplear mayor cantidad de buffer
extraccin o sustancias como CTAB ( cetil trimethyammonium) que colabora
en la precipitacin del ADN.
El pH durante el proceso de extraccin debe ser ptimo, que evite la accin de
enzimas degradativas del cido nucleico. La mayora de los procedimientos
de extraccin de ADN emplean soluciones taponadas con pH 7.0-9.0.
Para cuantificacin del ADN se hace uso de la espectrofotometra
(absorbancia a una longitud de honda de 260nm), o la observacin directa con
fluorescencia despus de teir el gel de extraccin con bromuro de
etidio.(mtodo de saram wrap, mtodo del plato de agarosa, mtodo del minigel) o por fluorometria.
OBJETIVO
Comprender los procedimientos necesarios para extraer ADN de buena
calidad y alta pureza.
EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS
Material del que se extrae el DNA ( se recomienda utilizar material fresco),
bistur, mortero, balanza analtica, tubos de ensayo con tapa, centrfuga
refrigerada, bao agua (60 C), pipetas de 5 ml, micropipetas y puntas, tubos
eppendorf, espectrofotmetro.
Buffer 1
Buffer 2
Otros reactivos
Cloroformo, alcohol Isoamilico, iIsopropanol, etanol 70%
PROCEDIMIENTO No. 1
Nota: Para saber que tan puro es el ADN obtenido realizamos la siguiente
relacin
ADN/Proteina =260nm/280nm
Un valor menor de 1.8 indica contaminacin por protenas.
MINIPREPARACION DE DNA PLASMIDICO
INTRODUCCION
Por lo general, los plsmidos son purificados a partir de cultivos (Crecidos en
medio lquido que contienen el antibitico apropiado) que han sido inoculados con
una colonia bacteriana, tomada de un plato de agar. Muchos de los plsmidos
comnmente utilizados, se replican a muy altas tasas y pueden ser purificados en
grandes cantidades a partir de bacterias transformadas que alcanzan la fase
logartmica del crecimiento, en medio lquido.
Las bacterias se recuperan por centrifugacin y son lisadas por uno de varios
mtodos, incluyendo tratamiento con detergentes inicos y no inicos, solventes
orgnicos, lcali o calor. En la presente prctica utilizaremos el mtodo de lisis
alcalina para la preparacin de DNA plasmdico, debido a su facilidad de
implementacin, rapidez y las altas cantidades de DNA obtenido.
OBJETIVO
Obtener DNA plasmdico de alta calidad a partir de cultivos bacterianos.
MATERIALES Y MTODOS
1. Tome con un palillo o punta de micropipeta una colonia bacteriana e inoclela
en un tubo falcn de 50 ml que contenga 5 ml de medio de cultivo LB
suplementado con 50 ug/ml de ampicilina. Ponga el cultivo en agitacin a 250
RPM y 37oC toda la noche
2. Centrifugue 1.5mL del cultivo bacteriano crecido toda la noche a 12000 rpm por
1 minuto. Retire el sobrenadante.
3. Resuspenda el precipitado de clulas bacterianas en 100 ul de tampn GTE
(50 mM Glucosa, 25 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, pH 8). Mezcle hasta que el
precipitado quede totalmente disuelto, utilice un vortex si es necesario.
4. Adicione 200 ul de solucin de lisis (0.2 M NaOH, 1% SDS). Invierta el tubo
unas 6 a 8 veces.
5. INMEDIATAMENTE adicione 150 ul de una solucin 5M de acetato de potasio
pH 4.8. Esta solucin neutraliza el NaOH utilizado en el paso previo de lisis
precipitando simultneamente el DNA genmico y el SDS. Centrifugue a 12000
rpm por 1 minuto.
6. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf, teniendo especial
cuidado en no remover el precipitado blanco. Precipite los cidos nucleicos
utilizando un volumen de isopropanol e incubando en hielo por 10 minutos.
Centrifugue a 12000 rpm por 1 minuto.
7. Retire el sobrenadante de isopropanol y coloque con cuidado el tubo
eppendorf boca abajo sobre una toalla de papel por 15 o 20 minutos (Debe
asegurarse que todo el isopropanol se haya eliminado). Disuelva el precipitado
en 400 ul de tampn TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7.5). Adicione 10ul de
solucin de RNAse A (Stock de 20 mg/ml almacenado a -20 C), agite e incube a
37 C por 20 a 30 minutos para digerir todo el RNA.
8. Extraiga las protenas de la solucin que contiene el DNA del plasmido
utilizando un volumen igual de FCI (fenol/cloroformo/alcohol isoamilico). Agite
vigorosamente por 30 o 60 segundos. Centrifugue a 12000 rpm a temperatura
ambiente. Observe que la fase orgnica de FCI se localiza en la parte baja del
tubo eppendorf.
9. Remueva la fase acuosa (superior) que contiene el DNA del plasmado,
cuidadosamente, sin alterar la interfase blanca que se encuentra por encima de la
fase orgnica de FCI y transfirala a un tubo limpio de 1.5 ml.
10. Para precipitar el DNA del plasmado, adicione 100 l de acetato de amonio
7.5 M y 1 ml de etanol, incube a -20C por 15 minutos. Centrifugue a 12000 rpm
por cinco minutes a temperatura ambiente.
11. Retire el sobrenadante de etanol y coloque con cuidado el tubo eppendorf
boca abajo sobre una toalla de papel por 15 o 20 minutos (Debe asegurarse que
todo el etanol se haya eliminado). Disuelva el precipitado de DNA en 50 ul de
Tampn TE. Corra una electroforesis en gel de agarosa al 1% y observe el DNA
del plasmido.
Para cuantificar el DNA realice una dilucin 1/200 y lea la absorbancia a 260nm.
Medio LB agar(1 litro):
Bacto triptona
Extracto de levadura
NaCl
10.0 g
5.0 g
10.0 g
Agite hasta que los solutos se hayan disuelto completamente. Ajuste a pH 7.0
con NaOH 5N. Autoclave por 20 o 30 minutos.
Solucin GTE
Solucin stock
volumen
2.27 ml
2.0 ml
2.5 ml
93.23 ml
100.0 ml
concentracin final
50 mM
10 mM
25 mM
volumen
concentracin final
NaOH 1N
SDS 10%
ddH2O estril
Total
2.0 ml
1.0 ml
7.0 ml
10.0 ml
0.2 N
1%
volumen
Acetato de potasio 5 M
cido actico glacial
ddH2O
Total:
60 ml
11.5 ml
28.5 ml
100 ml
Se deben tener soluciones stock de Tris-Cl 1M (pH 7.5) y 500 mM de EDTA (pH
8.0).
GLOSARIO
ADN: cido desoxirribonucleico (ADN), material gentico de todos los
organismos celulares y casi todos los virus. El ADN lleva la informacin
necesaria para dirigir la sntesis de protenas y la replicacin.
Tris: (hidroximetil amino metano) Es un tampn biolgico. Su principal funcin
es mantener el pH de la solucin estable (7.0 8.0).
EDTA: (Etilen diamino tetra actico) Es un agente quelante. Se encarga de
remover iones de magnesio que son esenciales para preservar l estructura de
la envoltura celular.
Cloroformo: Solvente orgnico que se encarga de remover residuos de
lpidos y fenoles en la muestra. Colabora en la desnaturalizacin de protenas.
CTAB: cetil trimetil bromuro de amonio, detergente cationico que solubiliza las
membranas celulares, dependiendo de la concentracin de cloruro de sodio en
la solucin, permite la remocin de polisacridos y otras macromolculas. El
CTAB forma un complejo con el ADN y por lo tanto puede ser empleado para
precipitar ADN selectivamente.
Cloruro de sodio: colabora para equilibrar las fuerzas inicas.
Mercaptoetanol: Antioxidante. Forma enlaces disulfuro, forma disulfuros
mixtos con las cadenas laterales de las protenas. Evita color pardo en ADN
extrado.
Alcohol Isoamilico: Antioxidante. Reduce o imposibilita la formacin de
interfases durante la extraccin de ADN.
Etanol, Isopropanol: Alcoholes. En presencia de sales (temperatura de
aproximadamente 20 C ) precipita ADN, reduciendo la constante dielctrica
del solvente.
BIBLIOGRAFA
Perea Arango Irene, Pineda Tuirn Rosana, Arango Isaza Rafael, MANUAL
DE TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR. 2002 U de A pg 11-16
Plant Tissue Culture and Biotechnology . June 1998 vol 4 N 2 pg 76 -79
Sambrook, J., Fritsch, EF., Maniatis, T. 1989 Molecular Cloning: A laboratory
Manual. 2nd Ed. Cold Spring harbor Laboratory Press. New York, USA.
Prctica No. 13
Electroforesis de DNA y de protenas
Introduccin:
Electroforesis es la migracin de las molculas cargadas presentes en una
solucin acuosa como respuesta a la presencia de un campo elctrico, dichas
molculas son atradas hacia el polo opuesto a su carga neta. Dos fuerzas de
accin opuesta determinan la velocidad de la partcula en cuestin. Por un lado, la
fuerza elctrica, que la atrae al electrodo, cuya intensidad es directamente
proporcional a la carga, y, de acuerdo a la segunda ley de Newton (F=m x a,
entonces a=F/m), le impone una aceleracin directamente proporcional al
cociente carga/masa (q/m). Por otro lado, la fuerza de rozamiento, que se opone a
la migracin con una intensidad que depende del tamao y la forma de la
partcula y de las caractersticas del medio (viscosidad y estructura, por ejemplo).
La electroforesis se utiliza en el laboratorio para separar macromolculas en
solucin, en forma analtica (es decir, slo para verlas) o preparativa (para
purificarlas). Los cidos nucleicos tienen un fosfato cargado negativamente por
nucletido. Como el peso molecular de los cuatro nucletidos es similar, la
relacin q/m es independiente de la secuencia y el tamao de la molcula. Por lo
tanto la aceleracin impuesta por la fuerza elctrica es igual para cualquier
molcula de cido nucleico. La nica diferencia en velocidad de migracin estar
dada por diferencias en la fuerza de rozamiento, o sea de su forma y de su
tamao. En el caso del DNA doble cadena, la forma es la misma para cualquier
molcula, entonces las distintas molculas tendrn una velocidad que slo
depender de su tamao, es decir, de su longitud en pares de bases. Sin
embargo, si tratramos de separar molculas de DNA doble cadena en una
electroforesis en una solucin acuosa, nos encontraramos con que el rozamiento
impuesto por sta es tan pequeo que todas las molculas migraran juntas.
Adems, durante la electroforesis, las molculas se separaran unas de otras por
difusin, impidiendo el anlisis. Para lograr una separacin eficiente, se utiliza un
medio soporte que aumente considerablemente la friccin recibida por las
macromolculas y reduzca la difusin a un mnimo. Este medio suele ser una red
molecular de algn polmero orgnico, conocida como gel, por su consistencia
gelatinosa. Los ms utilizados en laboratorios de biologa molecular son de
poliacrilamida, una red molecular estabilizada por uniones covalentes, y agarosa
(un derivado del agar-agar), un polisacrido extrado de un alga que forma, al
disolverlo, una red estabilizada por interacciones no covalentes. Las mezclas de
DNAs de distinto tamao se hacen migrar (desplazarse) a travs del gel durante
un cierto tiempo y se obtiene una separacin en la que la distancia migrada por
una molcula dada es inversamente proporcional al logaritmo de su peso
molecular (o de su longitud en pares de bases). El tamao de una muestra
desconocida puede estimarse corriendo en paralelo muestras de longitud
conocida.
buffer TBE medido, calentar hasta que la agarosa se disuelva (quede translcida
la solucin). Verter la solucin en caliente sobre el molde previamente preparado
y colocar la peineta sin traspasar el gel; es decir, teniendo la precaucin que los
dientes que formarn los posuelos queden a una distancia de 0,5-1 mm por
encima de la base del gel para que los posuelos queden completamente sellados.
Despus de que el gel se enfre y solidifique, retire cuidadosamente la peineta y la
cinta de enmascarar con la que hizo el molde del gel y coloque el gel en el tanque
de electroforesis.
Agregue suficiente buffer TBE para cubrir el gel 1mm por encima de su parte
superior.
Mezcle las muestras de DNA que estn suspendidas en TE con buffer de carga
(una solucin de sacarosa al 40% con azul de bromofenol al 0.25% preparado en
agua) en una proporcin 1:1.
Coloque lentamente las muestras mezcladas con el buffer de carga en los
posuelos dentro del gel de agarosa con la ayuda de una micropipeta.
Complete el montaje teniendo la precaucin de que el polo positivo este al lado
opuesto del sitio de siembra, aplique la corriente elctrica (3-5V/cm) hasta que el
color haya migrado casi hasta el final del gel (unos 10cm), suspenda la corriente
elctrica, retire el gel y sumrjalo 45 minutos en una solucin con bromuro de
etidio (en buffer o agua) con una concentracin de 0,5 g/mL.
Tenga la precaucin de usar guantes cuando manipule el gel o las soluciones ya
que el bromuro de etidio es un poderoso mutagnico.
Coloque luego el gel sobre un transiluminador ultravioleta (UV) y observe las
bandas de DNA protegiendo los ojos de la radiacin UV.
Reactivos para electroforesis de protenas en geles de poliacrilamida:
Precaucin, la acrilamida y bisacrilamida como monmeros son potentes
neurotoxicos acumulativos que se absorben rpidamente por la piel, no pipetear
con la boca ni manipular las soluciones sin usar guantes.
Buffer Tris-HCl pH 8.9 (solvente para poliacrilamida y persulfato de amonio):
Preparacin: Disolver 36.6 g de Tris(hydroxymethyl)-aminometano p.a. (V-12) en
850 mL de agua destilada, ajustar pH y ajustar volumen a 1 L, guardar en frasco
mbar bajo refrigeracin.
Prctica No. 14
Esterilizacin
Marco Terico
Agentes fsicos: Los factores ambientales como son la temperatura y la
humedad son fundamentales para el desarrollo de bacterias, de forma tal que
la alteracin del de este ambiente causa inhibicin o muerte de los
microorganismos. Se cuenta actualmente con diferentes agentes fsicos para
el control de microorganismos en la industria y en el rea de la salud, los ms
usados son: calor seco y hmedo, radiacin, y filtracin.
la bacteria y por lo tanto tiene accin letal, el uso mas amplio de este mtodo
es en salas de quirfano, medios de cultivo y en cmaras de bioseguridad en
el laboratorio.}
Loas rayos X son letales para las clulas microbianas y los seres vivos
superiores, por su alto costo y mala difusin de las radiaciones que afectan al
usuario son de poco uso en el control microbiano.
Los rayos gama tienen mucha energa y poder de penetracin, son emitidos
por istopos radioactivos como el Co60 , son letales para todas las formas de
vida, se ha utilizado alimentos empacados pero su uso en el rea hospitalaria
es limitado a algunos procedimientos de diagnstico.
Los rayos catdicos o haz de electrones son microbicidas a velocidades
extremas, se usan parea esterilizar material quirrgico, drogas o otros
materiales tienen como ventaja que estos pueden esterilizarse despus de
empacados a temperatura ambiente.
Objetivos
Comprender el fundamento del mtodo de esterilizacin fsico: calor a vapor
presin, su importancia y utilidad dentro de procesos industriales.
Materiales
Agua destilada
Cajas de petri con medio servido (PCA)
Cajas de petri sin medio
Reactivos
Medio melaza: Extracto de levadura y melaza (realizar los clculos)
Prctica No. 15
CULTIVO Y MANEJO DE MICROORGANISMOS
En el laboratorio es de vital importancia conocer los requerimientos mnimos para
el manejo de microorganismos. Sobra decir que todo microorganismo en el
laboratorio se debe manipular como si este fuera potencialmente perjudicial para
la salud.
En la prctica cuando se manipulan microorganismos provenientes de muestras
ambientales se debe tener especial cuidado en no perder microorganismos en las
diferentes etapas de aislamiento, como tampoco permitir la contaminacin.
Marco Terico
Microorganismos: La observacin de los microorganismos se valora en dos
aspectos ; el aspecto microscpico en el que se evala color , forma y tamao
de las colonias, y, el aspecto microscpico en el que se evala la forma ,el
tamao y propiedades de la pared del microorganismo como tal Estas
apreciaciones le permitirn al microbilogo determinar aspectos como:
Pureza del cultivo, ya que las colonias observadas deben ser de un solo tipo y la
morfologa microscpica debe presentar uniformidad en el tamao, absorcin de
la coloracin y forma de los microorganismos evaluados
Composicin de la pared, ya que la coloracin de gram utilizada para la
observacin microscpica, da cuenta de los componentes presentes en la pared
celular; puesto que al ser negativa el microorganismo en esta tendra mayor
porcentaje de lipopolisacaridos, mientras que al ser positiva, indicara que el
microorganismo en esta estructura presenta mayor porcentaje de pptidoglicanos.
Viabilidad, dado que la observacin en fresco, permite ver el movimiento
microbiano.
Preparaciones
Preparaciones no coloreadas: Con este mtodo se observan los
microorganismos vivos, lo que permite detectar el tipo de movilidad y la viabilidad
de los mismos.
Preparaciones coloreadas: Como los microorganismos son incoloros y tienen el
mismo ndice de refraccin del agua, es necesario utilizar colorantes para
Coloracin de Gram
La coloracin de Gram es un mtodo que ha permitido la divisin de las bacterias
en dos grupos: El de gram positivas y el de las gram negativas. La tcnica esta
basada en la capacidad de las bacterias para retener el colorante cristal violeta
durante la decoloracin con el alcohol acetona.
Las bacterias gram negativas son decoloradas por el alcohol acetona, perdiendo
el color prpura propio del cristal violeta.
Las bacterias gram positivas no se decoloran y retiene el color violeta. Despus
de la decoloracin, se utiliza la safranina , que es un colorante de contraste de
color rojo, dicho colorante da un color rosado a las clulas decoloradas.
Las bacterias Gram positivas presentan una gruesa capa de peptidoglicano como
estructura fundamental por sobre la membrana citoplasmtica, y las Gram
negativas, encima de sta, presentan una delgada capa de peptidoglicano, a la
que se superpone una capa de lipopolisacridos-lipoprotena, denominada
membrana externa. La presencia de esta membrana diferencia actualmente dos
divisiones en sistemtica bacteriana: las que no lo poseen, Gram (+) y las que s,
Gram (-). La diferencia entre ambos grupos es pues de enorme importancia
taxonmica. En el comportamiento como patgenos y en la sensibilidad
antibacteriana difieren sustancialmente; de ah que la realizacin rpida de una
coloracin de Gram, reviste enorme importancia en los procesos biotecnolgicos y
en la bacteriologa clnica.
Medios de cultivo
Un cultivo microbiolgico, puede realizarse para diferentes fines, por ejemplo:
aislamiento e identificacin de una bacteria, pruebas de esterilidad de diferentes
productos, anlisis microbiolgico de aguas, alimentos ambientes etc.
Estos pueden denominarse como sustratos sobre los cuales los microorganismos
encuentran los elementos nutricionales necesarios para realizar su metabolismo
en forma similar a como lo hacen cuando se encuentran en la naturaleza.
En ellos las bacterias crecen y se reproducen dando como resultado la formacin
de colonias en los medios slidos y enturbiamiento, grumos, natas, velos o
produccin de gas en los lquidos
Materiales
Procedimiento
Para el cultivo:
1
1:10
3
2
4
1:100 1:1000 1x104
Prctica No. 16
DEGRADACIN DE COLORANTES CON HONGOS
LIGNINOLTICOS
INTRODUCCION
Existe una gran cantidad de organismos (bacterias y hongos) degradadores de
celulosa y hemicelulosa, pero muy pocos con la capacidad de desdoblar la ligina;
de hecho, los nicos con la capacidad de hacerlo son un grupo de basidiomicetes
poseedores de un complejo enzimtico compuesto por enzimas oxidasas y
peroxidasas, que al catalizar las primeras reacciones pueden generar molculas
ms pequeas que se incorporan a los ciclos metablicos del organismo. Entre
las peroxidadas, las mas importantes en la mineralizacin de la lignina son la
lignina peroxidasa (LiP), la manganeso peroxidasa (MnP), y peroxidasa verstil
(PV). MnP y PV tienen un grupo hemo como cofactor y emplean H2O2 como
primer aceptor de electrones, mientras que la LiP puede oxidar directamente
sustratos aromticos no fenlicos, como el alcohol veratrlico. La MnP puede
oxidar sustratos del tipo fenlico a travs de Mn2+ pero tambin puede hacerlo con
aqullos del tipo no fenlico a travs de los productos de peroxidacin de cidos
grasos insaturados, mientras que la PV comparte las propiedades catalticas con
las descritas anteriormente, pues puede oxidar el Mn2+ a Mn3+ (como lo hace la
MnP) y tambin oxida compuestos no fenlicos (como lo hace la LiP), La lacasa
es una oxidasa ampliamente distribuida entre los hongos de pudricin blanca con
cuatro tomos de cobre como cofactor y cuyo aceptor de electrones es el O2
dando agua como producto. La enzima oxidada ataca principalmente sustratos
fenlicos, pero en presencia de 1-hidroxibenzotriazol (1-HBT), 2,2-azinobis [cido
3-etilbenzothiazoline- 6-sulfnico] (ABTS) o cido violrico [10,11] stos actan
como cooxidantes y capacitan a la enzima para atacar sustratos menos oxidables
como los de tipo no fenlico.
Los colorantes sintticos son ampliamente utilizados en muchas industrias (textil,
papel, cosmtica, farmacutica y alimentaria), por su fcil uso, bajo costo y alta
estabilidad, sin embargo, algunos estudios sugieren que estos colorantes
pueden ser txicos, carcingenos y generadores de reacciones alrgicas y
asmticas en personas susceptibles. Adicionalmente, estos colorantes no son
removidos por los tratamientos tradicionales de manejo de aguas residuales y por
ello, en muchos pases se utilizan microorganismos degradadores que separan
los enlaces azo de su respectivo azocolorante y produce la decoloracin de los
pequeas alcuotas del medio a partir del cuarto o quinto da, y con ellas realizar
unas cuantificaciones espectrofotomtricas (598 nm) que faciliten la elaboracin
de un grfico que evidencie el decoloramiento progresivo del color.
BIBLIOGRAFA
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basidiomycetes for enzymes involved in lignin degradation. Mycol Res 1995; 99:
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lignin decomposition by two woodroting fungi. Appl Environ Microbiol 1976; 32:
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Phanerochaetechrysosporium. Appl Environ Microbiol 1992; 58: 2402-2409.
5. Tuor U, Wariishi H, Schoemaker HE, Gold MH. Oxidation of phenolic
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6. Soares GM, de Amorim MT, Costa- Ferreira M. Use of laccase together with
redox mediators to decolourize Remazol Brilliant Blue R. J Biotechnol 2001; 89:
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7. Hess J, Leitner C, Galhaup C, et al. Enhanced formation of extracellular laccase
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8. Galhaup C, Wagner H, Hinterstoisser B, Haltrich D. Increased production of
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9. Levin, L, Papinutti, L., Forchiassin, F. Evaluation of Argentinean white rot fungi
for their ability to produce lignin-modifying enzymes and decolorize industrial dyes.
Bioresource Technology 94. pp. 169176 (2004)
10. Camarero, S., Sarkar, S., Ruiz-Dueas, F., Martnez, M., Martnez, A.
Description of a Versatile Peroxidase Involved in the Natural Degradation of Lignin
That Has Both Manganese Peroxidase and Lignin Peroxidase Substrate
Interaction Sites. The Journal of Biological Chemistry. 274(15), 1032410330.
(1999)
11. Yonni, F., Moreira, M.T., Fasoli, H., Grandi, L., Cabral, D. Simple and ea
ANEXO
Cuantificacin de variables con importancia en los procesos que se realizan
en el laboratorio
DETERMINACIN DE AZUCARES TOTALES POR EL MTODO DE ANTRONA
PREPARACIN DE LA SOLUCIN BASE DE ANTRONA
La vidriera a utilizar debe estar previamente lavada con solucin de cido
sulfrico al 10%.
Tomar 100 mL de cido sulfrico al 96% en un recipiente mbar o en un
erlenmeyer previamente cubierto con papel aluminio para evitar que la solucin
final de Antrona en cido reaccione con la luz. A los 100 mL de cido adicionarles
200 mg de Antrona slida y llevar a agitacin hasta obtener una solucin
homognea. Para la manipulacin de este reactivo es necesario utilizar tapabocas
y guantes debido a su alta toxicidad.
ELABORACIN DE CURVA ESTANDAR
Pesar 0.25 g de glucosa y llevarlo a un volumen final de 50 mL para obtener una
solucin de concentracin 5 g/L. Tomar una alcuota de 0.5 ml de esta solucin y
llevarlos a un volumen final de 50 mL para obtener una solucin de concentracin
0.05 g/L. Con esta ltima solucin preparar las siguientes diluciones en tubos de
ensayo, utilizar micropipeta de 1 mL para esto.
Solucin
Concentracin [g/L]
Blanco
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0.035
0.04
0.045
0.05
Volumen
de solucin Volumen
de
madre (mL)
agua destilada
(mL)
0
1.5
0.15
1.35
0.30
1.20
0.45
1.05
0.60
0.90
0.75
0.75
0.90
0.60
1.05
0.45
1.20
0.30
1.35
0.15
1.50
0
Concentracin [g/L]
Blanco
1
2
3
4
5
6
7
0
0.04
0.08
0.12
0.16
0.20
0.24
0.28
Volumen de
solucin
madre (ml)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Volumen de
agua
destilada (ml)
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
8
9
10
0.32
0.36
0.40
1.6
1.8
2.0
0.4
0.2
0
Ppm
Absorbancia
50
0.074
100
0.134
300
0.346
500
0.548
700
0.709
[Estndar]
50
100
300
500
700
Absorbancia
0.074
0.134
0.346
0.548
0.709
.....30 mL
Harina de maz..............................100 g
Agar agar.........................................6 g
Melaza...........................................80 mL
Acido propinico .........................
5 mL
Agua............................................900 mL
2. PREPARACIN DEL ALIMENTO
El agua se divide en dos porciones. La primera se agrega a la levadura y se
mezcla muy bien. Luego se agrega la harina de maz y se contina con la
agitacin hasta obtener una mezcla homognea.